一种测定纳米金表面上巯基修饰线性DNA或核酸适配体构象的方法

摘要

本发明涉及一种测定纳米金表面上巯基修饰线性DNA或核酸适配体构象的方法，是利用动态光散射测定组装过程中线性DNA或核酸适配体与纳米金复合物的水合粒径，结合吸附动力学，分别测定线性DNA或核酸适配体在不同表面包被量时在纳米金表面上的构象。利用本发明的方法发现在中等表面探针容量时，线性DNA在纳米金表面上的构象为连接巯基的一端缠绕在纳米金表面，另一端与表面垂直向外伸展，随着表面探针容量的增加，每条DNA探针缠绕在纳米金表面上的长度不断减小，而同时向外延伸的尾部越来越长，但纳米金表面保持被DNA碱基吸附包裹的低表面自由能状态上述构象可以描述为DILOT模型，对于核酸传感器探针设计和基于DNA杂交的纳米组装等应用具有重要的指导意义。

说明书

技术领域

本发明涉及一种测定纳米金表面上巯基修饰线性DNA或核酸适配 体构象的方法，属于生物技术领域。

背景技术

由巯基线性DNA或核酸适配体修饰的纳米金复合物(DNA/AuNP)， 从自组装材料制备、生物传感技术，到药物传输等领域，都拥有十分 重要的应用。但是最近的研究表明DNA碱基会与纳米金表面发生非特 异性相互作用，部分吸附在纳米金的表面，使得线性DNA杂交效率下 降，使得核酸适配体与其靶标的识别能力下降。因此深入了解线性DNA 或核酸适配体探针在纳米金表面的构象，对于优化探针设计具有十分 重要的价值。现阶段对线性DNA在平面金表面上的构象研究较多，有 多种表征技术，例如X射线光谱，表面等离子体共振等都被用于线性 DNA在平面金表面上的构象研究。但是对于线性DNA或核酸适配体探针 在纳米金表面上构象的研究却很少。目前仅有琼脂糖凝胶电泳技术被 用于线性DNA在纳米金表面上构象的系统研究(Parak，W.J.； Pellegrino，T.；Micheel，C.M.；Gerion，D.；Williams，S.C.； Alivisatos，A.P.NanoLett.2003，3，(1)，33-36.)。该方法通 过测定DNA/AuNP在琼脂糖凝胶电泳中的迁移速率计算其有效粒径，然 后通过其有效粒径测定线性DNA的构象。琼脂糖凝胶电泳技术虽然可 以用于研究线性DNA的构象变化，但是这种方法却存在许多缺陷：1. 琼脂糖凝胶电泳技术需要的样品量较大，样品不能重复使用，费时费 力，不适合动力学研究；2.短链DNA(小于40个核苷酸)修饰的纳米金 在实际应用中很常见，但是琼脂糖凝胶电泳无法获得单条短链DNA的 分辨率；3.凝胶方法计算所得的DNA/AuNP粒径实验误差较大，受凝 胶比例影响，需要多次测量，费时费力；4.纳米金在琼脂糖凝胶电 泳之前需要修饰提高纳米金稳定性的小分子，防止电泳时发生聚集， 但在实际应用中这些小分子的存在却会干扰DNA在纳米金表面的实际 构象情况，从而无法得到正确的构象信息；5.具有二级构象的适配体 DNA会折叠成为紧密的二级结构，影响电泳的迁移率，从而影响对构 象的研究。因此非常需要寻找一种可以高效、精确和灵敏的表征方法 来探测线性DNA或核酸适配体探针在纳米金表面上的构象。

发明内容

本发明的目的是提供一种测定纳米金表面上巯基修饰线性DNA或 核酸适配体构象的方法，该方法包括如下步骤：步骤一：利用动态光 散射(DLS)测定线性DNA或核酸适配体的纳米金复合物在其组装过程 中的水合粒径，步骤二：结合吸附动力学模型拟合，并通过对线性DNA 或核酸适配体纳米金复合物水合粒径的直接比较，测定在不同表面容 量时线性DNA或核酸适配体在纳米金表面上的构象。

本发明的具体实验步骤：

(1)利用动态光散射测定组装过程中不同长度巯基修饰线性DNA 或核酸适配体纳米金复合物的水合粒径的动态变化过程；

具有巯基修饰的线性DNA或核酸适配体与二硫苏糖醇(DTT)在2％ (V/V)的三乙胺(TEA)溶液下还原后利用NAP-5柱进行两次纯化。纯化 后的线性DNA或核酸适配体与纳米金(AuNP)按照一定物质的量比例混 合于磷酸盐缓冲液(10mM PB，pH7.4)中，室温(25℃)下孵育并利用 动态光散射测定DNA/AuNP粒径变化过程。包被过程包括三个阶段：老 化，加盐，温育。老化过程即包被后的17个小时内，使线性DNA或核 酸适配体通过自组装过程包被于纳米金表面，该过程不另外添加盐， 选取多个时间点测定粒径值；加盐过程即老化过程完成后，逐渐向纳 米金与线性DNA或核酸适配体混合溶液中滴加浓度为1M氯化钠 (NaCl)的磷酸盐缓冲溶液使得盐浓度缓慢增至0.3M，选取多个盐浓 度点测定DNA/AuNP的粒径；温育过程即加盐过程完成之后等待一段时 间使线性DNA或核酸适配体更加完全地包被于纳米金表面，选取数个 时间点测定粒径。

(2)荧光测定老化过程中DNA在纳米金表面DNA链数；

利用荧光标记和巯基修饰的线性DNA或核酸适配体在(1)相同的 条件下还原并与纳米金包被。在老化过程中(0-17h)选取数个时间 点对样品进行离心纯化，将包被上DNA链的纳米金沉淀复溶于二硫苏 糖醇(DTT)磷酸盐缓冲溶液并过夜并离心取上清，根据标准曲线测定 其上清液探针浓度并计算每个纳米金上DNA的包被量。相对应公式为：

(3)老化过程DNA在纳米金表面吸附动力学拟合；

根据准二级吸附动力学公式(公式1)(其中qe表 示平衡吸附量，qt表示时间为t时的吸附量，Ks表示二级吸附速率 常数)和粒径与包被量线性关系(由(2)可得)公式q_e＝kd_eq_t＝kd_t(公 式2)(其中de表示平衡时纳米金粒径增加量，dt表示时间为t时的 纳米金粒径增加量，k为纳米金粒径增加量与DNA吸附量之间的比例 常数)得到(公式3)(其中Ks′为kKs)。将(1)获得的粒 径增长量带入公式3中，若t/dt与t符合线性关系，即符合准二级 吸附动力学模型。

(4)利用动态光散射测定非巯基修饰DNA链包被纳米金的过程；

没有巯基修饰的线性DNA单链与纳米金(AuNP)投入物质的量比 例为500∶1，在室温条件(25℃)包被并利用动态光散射测定DNA/AuNP 粒径在老化过程中的变化过程。

(5)根据(1)-(4)，建立线性DNA在纳米金表面上的构象DILOT (Dynamic Inner-Layer and Outer-Tail)模型，测定在不同表面容 量时线性DNA在纳米金表面上的构象；

(6)利用动态光散射测定盐浓度对线性DNA或核酸适配体在纳 米金表面构象的影响；

(7)紫外定量加盐和温育过程线性DNA或核酸适配体在纳米金 表面上的数量；

完成包被过程的DNA/AuNP经过离心，取上清，利用紫外测定其浓 度，根据包被时投入的DNA、纳米金和离心后上清的浓度和体积计算 包被量。相对应公式为：

(8)根据(1)、(6)和(7)测定在加盐和温育过程不同表面容量时 线性DNA或核酸适配体在纳米金表面上的构象。

该方法具有如下优势：

1)DLS技术基于悬浮液中球形粒子的布朗运动会引起的不同强度 的激光散射，通过强度波动得到平动系数，从而再通过斯托克斯爱因 斯坦方程(Stokes-Einstein)得到粒子的水合粒径。这种技术不需 要对测量样品进行额外的化学修饰，无损伤，特别是可以实时监测；

2)DLS技术的灵敏度高，所需样品量相比琼脂糖凝胶电泳技术大 幅减少，且无需浓缩；

3)DLS技术的分辨率高，可以准确分辨小于40个碱基的单条短链 DNA的吸附；

4)利用DNA与蛋白相比，化学基团少，结构简单，通过直接比较 相同长度的线性DNA或核酸适配体的水合粒径，可以测定具有二级结 构的核酸适配体在纳米金表面的构象；

5)基于本发明的方法测定在中等表面容量时，巯基修饰线性DNA 在纳米金表面上的构象为连接巯基的一端缠绕在纳米金表面，另一端 与表面垂直向外伸展，随着表面探针容量的增加，每条DNA探针缠绕 在纳米金上的长度不断减小，而同时向外延伸的尾部越来越长，但纳 米金表面保持被DNA碱基吸附包裹的低表面自由能状态，上述构象可 以描述为DILOT(Dynamic Inner-Layer and Outer-Tail)模型。这个 模型不仅适用于线性的DNA在纳米金表面上的构象，而且也适用于没 有形成二级结构时的核酸适配体探针在纳米金表面上的构象。根据该 模型可以计算不同长度线性DNA在包被过程中缠绕在纳米金表面的不 能有效杂交的碱基的长度：

D_h是DNA/AuNP的水合粒径，D_Au is纳米金的直径，I_n是DNA/AuNP外层非专一性吸附DNA的厚度(～1nm)。因此该模型对于 核酸传感器探针设计和基于DNA杂交的纳米组装等应用具有十分重 要的指导意义。

附图说明

图1是本发明中，不同长度的巯基修饰的线性DNA：polyA₁₅， polyA₃₀，polyA₄₄，polyA₅₁在包被纳米金过程中，随着时间和盐浓度变 化，polyA/AuNP的粒径变化过程。

图2是本发明中，非巯基修饰的polyA₁₅，polyA₃₀，polyA₄₄，polyA₅₁在纳米金表面老化过程中，粒径随时间变化曲线。

图3是本发明中，polyA₃₀老化过程中纳米金表面DNA链数与粒径之 间的线性关系曲线。

图4A是本发明中，不同长度的polyA在纳米金表面老化过程中的 准二级吸附动力学曲线。图4B二级吸附速率常数与不同长度polyA之 间指数关系曲线。

图5是本发明中表示巯基修饰的线性DNA在纳米金表面的动态内 部环绕外部伸展的DILOT构象模型。图5A表示具有不同长度的带有和 不带有巯基修饰线性DNA在纳米金表面老化过程完成时的构象状态。 图5B表示线性DNA在纳米表面的包被过程构象变化，其在包被过程中 一致符合DILOT模型。图5C表示核酸适配体在纳米金表面的包被过程 的构象变化，当浓度低于临界盐浓度时，其构象符合DILOT模型，当 盐浓度高于临界盐浓度时，适配体开始在表面形成二级结构，不再符 合DILOT模型。

图6A-6C是本发明中，巯基修饰的线性polyA/AuNP和核酸适配体 (TBA₃₀，TBA₄₄，CBA₄₅，CRA₅₁)/AuNP在包被过程中粒径变化过程。

图7A-7C是本发明中，包被完全的线性DNA polyA/AuNP和核酸适 配体(TBA₃₀，TBA₄₄，CBA₄₅，CRA₅₁)/AuNP在不同盐浓度下的粒径变化。

图8是本发明中，包被完全的巯基修饰的polyA/AuNP和核酸适配 体(TBA₃₀，TBA₄₄，CBA₄₅，CRA₅₁)/AuNP在2％琼脂糖凝胶中的电泳照片和 包被量。

具体实施方式

表1：本发明中所用的线性DNA或核酸适配体探针序列。

表2：本发明中准二级吸附动力学模型参数。

实施例1.DLS实时监测老化过程中没有巯基修饰和巯基修饰线 性DNA和核酸适配体与13nm纳米金复合物的水合粒径。

将具有5’端巯基修饰的，不同长度的线性DNA：polyAl5， polyA30，polyA44，polyA51，以及具有不同长度的适配体DNA：TBA30， TBA44(牛凝血酶蛋白的适配体，Thrombin binding aptamer)，CBA45， CBA51(可卡因的适配体Cocaine binding aptamer)40μM，分别与40 mM二硫苏糖醇(DTT)在2％(V/V)的三乙胺(TEA)溶液下还原30分钟后 利用NAP-5柱进行两次纯化。纯化后的DNA与纳米金投入物质的量比例 为500∶1。同时将没有巯基修饰的线性DNA单链polyA15，polyA30， polyA44，polyA51与纳米金(AuNP)投入物质的量比例为500∶1。这12 条链在在磷酸盐缓冲液(10mM PB，pH7.4)条件下，室温(25℃)包被 并利用动态光散射测定DNA/AuNP粒径在老化过程中的变化过程(图1， 2，6)。

结果说明，不具有巯基修饰的polyA在纳米金表面粒径增加约为1 nm，与两个核苷酸大小(0.43nm×2)相近，说明在纳米金表面形成环 绕型构象(图5A)，其中非特异性吸附是主要作用力，且不同长度的DNA 具有相同的动力学过程。而具有巯基修饰的polyA在老化过程结束时， 不同长度线性DNA链(polyA15，polyA30，polyA44，polyA51)修饰的 AuNP的粒径增加量分别为1.5，2.8，5.2，和5.9nm，大于非特异性 吸附粒径增长量(～1nm)，小于线性DNA在纳米金表面完全伸展时粒径 增长量(12.9，25.8，37.8，43.9nm)说明DNA在纳米金表面构象介于 环绕型和伸展型之间，属于部分环绕部分伸展的DILOT构象状态(图 5A)，这种构象与无规则卷曲型构象相比其使纳米金表面自由能处于 更低的状态。而且相同长度的巯基修饰的线性DNA与适配体DNA在老化 过程中粒径大小和变化趋势相同，说明探针序列并不影响构象形成， 粒径增加主要源于DNA特异性包被于纳米金表面数量的增加。

实施例2.测定老化过程中线性DNA在纳米金上包被量与线性 DNA/AuNP水合粒径的关系。

具有5’端巯基修饰，3’端荧光FAM基团修饰的f-polyA30还原并 与纳米金包被。在老化过程中选取0.2，0.5，1，2，6，10，17h的 点对样品进行15000rpm离心，将沉淀复溶于1()()uL，1M二硫苏糖 醇(DTT)磷酸盐缓冲溶液并过夜并离心取上清，根据标准曲线测定其 上清液探针浓度并计算包被量。并观察其包被量与粒径变化之间的关 系。

结果说明，粒径(y)与包被条数(x)之间符合线性关系 y＝0.1779x+16.6038(R²＝0.996)(图3)。也就是说纳米金上的包被量 与DNA/AuNP粒径的增长量成正比该结果与下面实施例3的结果都支 持了线性DNA在纳米金表面上的DILOT模型。

实施例3.拟合线性DNA在13nm纳米金表面上的吸附动力学模 型。

根据老化过程中粒径与包被量之间的线性关系q_e＝kd_eq_t＝kd_t公式2)，通过准二级动力学方程(公式1)得到 (公式3)(其中Ks′为kKs)。选取不同长度巯基修饰 polyA15，polyA30，polyA44，polyA51在纳米金表老化包被时0.2， 0.5，1，2，6，10，17小时(h)的时间点和相应时间下的粒径增长量 带入公式3中。

结果表明，t/dt与t符合线性关系(图4A)，且计算所得qe与 实验所得qe高度一致(表2)，即巯基修饰的DNA在纳米金表面的吸 附过程符合准二级吸附动力学模型；同时表明巯基在纳米金表面的化 学吸附过程是控制动力学包被的限速步，所以粒径的增加是DNA特异 性包被于纳米金表面的数量的增加而引起的。而且DNA链越长，吸附 速率K’s越小(图4B)，表明越长的DNA链在纳米金表面环绕的部分 越长，亲和力越大。因此越难被其它的DNA链取代和表面重排，所以 包被过程越缓慢；体现在粒径变化上为：DNA链越长，达到粒径平衡 的时间越长，例如polyA15，在2h粒径即达到平衡，而polyA51在 老化时间完成时(17h)仍未达到平衡(图1)。该动力学数据有力支持 了DILOT模型。

实施例4.DLS检测在加盐和温育过程中巯基修饰线性DNA和核 酸适配体与13nm纳米金复合物的水合粒径。

利用DLS检测具有巯基修饰的不同长度的线性DNA(polyA15， polyA30，polyA44，polyA51)和适配体DNA(TBA30，TBA44，CBA45， CBA51)的纳米金在加盐和温育过程中粒径变化，选取浓度为0，0.02， 0.06，0.12，0.2，0.3M时的盐浓度时的粒径进行测量。

结果表明，加盐过程中，随着盐浓度不断提高，钠离子的引入减 小了带负电性DNA和纳米金之间的斥力，使纳米金表面的DNA链数量不 断增加，DNA/AuNP的粒径不断地提高；在达到临界盐浓度之前，线性 DNA与适配体DNA的粒径变化趋势相同，说明它们在纳米金表面的构象 变化相同，都是动态的内部环绕与外部伸展的DILOT构象；但是盐浓 度超过临界盐浓度时，核酸适配体开始形成二级构象，粒径变化开始 小于线性DNA的粒径变化(图6)。

实施例5.包被完全的线性DNA polyA/AuNP和适配体DNA(TBA30， TBA44，CBA45，CBA51)/AuNP在不同盐浓度下的粒径变化。

按照实施例4的方法包被完成DNA/AuNP，然后将DNA/AuNP复溶至 不同浓度的NaCl磷酸盐缓冲溶液(10mM PB，pH7.4)中，并利用紫 外法测量八种探针的包被量，并用琼脂糖凝胶电泳证明。

结果表明随着盐浓度的升高，核酸适配体纳米金复合物比线性 DNA纳米金复合物在相同的盐浓度下具有更小的水合粒径，是由于核 酸适配体折叠为更为紧凑的二级结构；同时核酸适配体环绕在纳米金 表面的部分，因为参与构象的折叠使得纳米表面更多的裸露，折叠构 象也减小了空间位阻，使得更多的适配体通过巯基的作用包被于纳米 金表面，表现为比同等长度的线性DNA更高的包被量。这也通过紫外 可见光谱定量和凝胶电泳迁移率的降低得到证实(图7)。这些结果说 明核酸适配体在超过临界盐浓度时不再符合DILOT模型(图5C)。