茶皂素在防治大豆孢囊线虫病害上的应用

摘要

本发明涉及茶皂素在防治大豆孢囊线虫病害上的应用，属于生物防治领域。茶皂素(Tea saponin)作为主要有效成分，对大豆孢囊线虫(Heterodera glycines)有强毒杀活性，能有效用于大豆孢囊线虫病害防治。

说明书

技术领域

本发明涉及生物防治领域，特别是涉及茶皂素(Tea saponin)防治大豆孢囊线虫病害的 应用。

背景技术

植物线虫是植物重要病原生物之一，随着农田流转，现代农业向产业化，基地化发展， 长期大面积种植单一农作物，以及常年连作及土地重复利用率的提高，线虫在土壤中的数量 迅速累积，线虫病害问题日益突出。我国的小麦孢囊线虫(Heterodera.avenae, Heterodera.filipjevi)、大豆孢囊线虫(Heterodera glycines)普遍发生且危害严重，对我国农业生 产造成重大损失和影响(彭德良等，1993，2008，2012；冯志新，2001)。孢囊线虫是一类 寄主范围比较窄的寄生线虫，雌虫成熟后卵大多数留在体内，雌虫表皮加厚形成孢囊以保护 体内的卵，植物收获后，孢囊掉落在土壤中，可以在土壤中存活几年甚至十几年，因此与根 结线虫及其它线虫相比是一类更加难以防治的线虫(冯志新，2001)。杀线剂是目前防治线虫 病害的有效措施之一，但当前的化学杀线剂均为高毒高残留农药，极易造成对农作物及生态 环境的污染，而目前毒性较低的生物农药阿维菌素也在生产上出现了抗药性问题。因此寻求 新的生物防治杀线剂，是目前防治农作物线虫病害的研究热点之一。

植物是生物活性化合物的的天然宝库，直接将天然产物(如植物的全株或某部分)加工 成制剂用以控制害虫(如鱼藤酮，印楝素)，或在充分研究植物天然杀虫活性成分、构效关系、 毒杀机理的基础上，模拟合成新的高效低毒杀虫剂，这在植物杀虫剂方面已经有很成功的先 例，与此相比，植物源杀线剂的研究相对落后，直到20世纪80年代以后，从植物中寻找天 然杀线虫活性物质的研究才开始受到关注，申请号为CN201210050127.5的中国发明专利公 开了茶皂素对蔬菜根结线虫的防治方法，吴慧平，李丽丽，王龙平等先后报道茶皂素对松材 线虫，水稻潜根线虫,根结线虫及小麦孢囊线虫有很好的毒杀活性及防治效果(吴慧平等， 2007；李丽丽，2012；王龙平等，2013a,2013b)；申请号为2009101162680的发明名称为“茶 皂素杀线虫颗粒剂及其制备方法”专利公开了茶皂素对水稻潜根线虫、山芋茎线虫，南方根 结线虫、松材线虫有防治作用，而对小杆线虫无致死活性，表明茶皂素并非对所有的线虫种 类有致死活性。而且目前还未有茶皂素对大豆孢囊线虫病害的研究报道及专利申请。

茶皂素(Tea saponin)是一种天然的非离子型表面活性剂，从山茶科的茶籽树种子、茎 和叶提取得到，由亲水性的糖基和疏水性的苷元以及有机酸构成，于1931年被日本学者青山 次郎首次提取得到。茶皂素是一种五环三萜皂苷(Pentacyclic Triterpenoid)，从碳骨架结构来 看它属于齐墩果烷(Oleanane)类，由皂苷元、糖基和有机酸组成，平均化学分子式为： C₅₇H₉₀O₂₆。茶皂素具有溶血、抗菌杀虫及鱼毒等多种生物活性作用，在我国目前主要作为分 散剂、悬浮剂、湿润剂、乳化剂应用于农药加工上，能极大地提高原药的湿润分散能力，降 低药液表面张力，增强湿展性；在洗涤方面的应用国内已开发出了各种织物特种洗涤剂(周 昊等，2009；夏春华等，2000)。

发明内容

针对上述领域中的空白，提供一种茶皂素在防治大豆孢囊线虫病害上的新应用，其浓度 达8mg/mL时，对大豆孢囊线虫致死活性非常高，可作为农药使用。

茶皂素在防治大豆孢囊线虫病害上的应用。

所述防治为抑制大豆孢囊线虫卵孵化，杀死二龄幼虫。

所述茶皂素作为农药的药物有效成分。

本发明中以茶皂素为药物有效成分，添加到农药用载体或组合物中，制成农药，可以采 用通常的农药剂型和使用方法，用于防治大豆孢囊线虫病害。

本发明实验证明，茶皂素对大豆孢囊线虫(Heterodera glycines)室内生测表明，以2 mg/mL、5mg/mL和8mg/mL浓度的茶皂素处理3d，对大豆孢囊线虫卵孵化抑制率分别为 43.12％、67.25％和75.36％；同样浓度处理5d，卵孵化抑制率分别为59.98％、76.31％和85.32％； 处理10d，卵孵化抑制率均达到了71.57％以上。

茶皂素以2mg/mL、5mg/mL和8mg/mL浓度处理大豆孢囊线虫二龄幼虫72h，并用清 水复苏24h，校正死亡率分别为29.86％、59.92％和86.14％。

大田试验结果表明，茶皂素对大豆孢囊线虫病有很好的防治效果，90％茶皂素以每小区(面 积为15m²)120g，240g，300g沟施处理，防治效果分别为43％，49.9％，65％，前两个 浓度处理的防效与杀线剂噻唑磷相当，而300g每小区浓度处理的防效为65％，明显优于噻 唑磷48.8％的防效。

本发明的优点：

1)本发明所述的茶皂素来源于山茶科的茶籽树种子、茎和叶提取得到，在茶叶中也有少量存 在，证明是对人体比较安全的。

2)田间大豆孢囊线虫病害防治试验表明，茶皂素对大豆孢囊线虫病害的防治效果优于目前常 规化学杀线虫剂噻唑磷。

3)本发明所述的茶皂素来源于天然植物中，在环境中易于降解，因此与化学杀线剂相比，具 有低毒低残留的特性，符合绿色植保和可持续农业生产和发展的需要。

具体实施方式：

以下试验及操作是对本发明的进一步说明，而不应该当做对本发明的限制。

本发明所用茶皂素是市售产品，来源于茶籽树种子、茎和叶，含量98％。

实施例1：茶皂素对大豆孢囊线虫卵孵化抑制活性测定

在解剖境下挑取色泽和大小较一致的成熟大豆孢囊线虫，用1％次氯酸钠消毒3-5min， 再用无菌水冲洗几遍，放入24孔板内，每处理加入10个成熟的大豆孢囊线虫，加入1mL 供试茶皂素溶液，供试溶液以灭菌水配制，每处理设4次重复，以无菌水做对照，置25℃培 养，分别于3d、5d、10d观察记录线虫孵化数量，按以下公式计算线虫卵孵化抑制率。

结果表明以2mg/mL、5mg/mL和8mg/mL浓度的茶皂素处理3d，对大豆孢囊线虫卵孵 化抑制率分别为43.12％、67.25％和75.36％；同样浓度处理5d，卵孵化抑制率分别为59.98％、 76.31％和85.32％；处理10d，卵孵化抑制率均达到了71.57％以上(详见表1)。

表1茶皂素对大豆孢囊线虫卵孵化的抑制活性

注：1)表中数据格式为：代表4次重复平均值，S.E为标准误；

2)表中数据为4次重复平均值，同列数据后标有相同字母表示在5％差异不显著(DMRT)。

实施例2：茶皂素对大豆孢囊线虫二龄幼虫的毒杀活性测定

采用药液浸泡法：在24孔板内加入1mL的供试溶液，供试溶液以灭菌水配制，然后加 入供试线虫30-50条，置于25℃恒温箱中，于24h、48h、72h在倒置显微镜下检查并记录 线虫活虫数和死虫数，按公式3计算各自校正死亡率。并且，将处理72h的进行清水复苏24 h，再次于倒置显微镜下检查并记录线虫活虫数和死虫数，按公式以下计算复苏24h校正死 亡率。每处理设4次重复，以无菌水做对照。

结果表明，茶皂素以2mg/mL、5mg/mL和8mg/mL浓度处理72h，并用清水复苏24h，校 正死亡率分别为29.86％、59.92％和86.14％；茶皂素以5mg/mL浓度分别处理24h、48h和 72h，校正死亡率分别为49.83％、63.57％和77.35％(详见表2)。

表2茶皂素对大豆孢囊线虫二龄幼虫的杀线活性

注：1)表中数据格式为：代表4次重复平均值，S.E为标准误；

2)表中数据为4次重复平均值，同列数据后标有相同字母表示在5％差异不显著(DMRT)。

实施例3：

2013年5月至6月，在中国农科院植保所廊坊基地大豆孢囊线虫感染地，进行了茶皂素 防治大豆孢囊线虫病大田小区试验，小区面积为15m²。

设茶皂素每小区120g，240g，300g三种浓度处理，对照药剂为每小区10％噻唑磷颗粒剂 50g，设不施药空白对照(CK)，每种处理3次重复，随机排列。5月17日，将地耙匀后起 跬，15m²一个小区，小区内开出4条小沟，将处理药剂均匀撒施在沟内，然后将大豆种子撒 播在施了药剂的沟内，最后覆土并踩实，翌日浇水。一个月后，即6月20日进行取样调查， 每个小区随机取10株，记录单株孢囊数，并进行统计分析，计算防效。结果表明，茶皂素以 每小区120g，240g，300g处理，防治效果分别为43％，49.9％，65％，前两个浓度处理 的防效与杀线剂噻唑磷相当，而300g每小区浓度处理的防效为65％，明显优于噻唑磷48.8 ％的防效(详见表3)。

表3  茶皂素处理对大豆孢囊线虫病的防治效果