优化多粘芽孢杆菌发酵液中E1和E2组分比例的方法

摘要

优化多粘芽孢杆菌发酵液中E1和E2组分比例的方法，步骤如下：a、斜面培养；b、种子液培养；c、发酵培养；d、发酵液中E1和E2组分检测。本发明解决了多粘菌素E发酵液中E1和E2组分比例不稳定性和不可控性的问题。

说明书

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及优化多粘芽孢杆菌发酵液中E1 和E2组分比例的方法。

背景技术

多粘菌素E是由多粘类芽胞杆菌产生的，由多种氨基酸和脂肪酸组成 的一种碱性多肽类抗生素，多粘菌素E对革兰氏阴性菌的作用最强，无论 生长期还是静止期的细胞均能很快被杀死，它可以治疗由志贺氏痢疾菌、 大肠埃希氏菌、铜绿假单胞菌、沙门氏菌属和普通变形杆菌引起的感染， 并对霍乱弧菌、鼠疫杆菌等也有很好的作用。由于多粘菌素E具有良好的 抗菌活力和高效，低毒，残留少的特性，可用于饲料添加剂，促进禽畜生 长和提高饲料利用率，并且可以防止饲料大规模生产中常出现的由大肠埃 希氏菌和沙门氏菌污染引起的疾病。

多粘菌素E主要成分为多粘菌素E1和E2，多粘菌素E主要的获得方 法就是发酵法，而多粘菌素E发酵液中E1和E2组分比例的不稳定性和不 可控性一直是困扰多粘菌素E发酵行业的一个问题，因此有必要发明一种 实施简单，工艺可行的方法来解决这一问题。

发明内容

本发明的目的是解决多粘菌素E发酵液中E1和E2组分比例的不稳定性 和不可控性的问题。

本发明为实现其目的采用的技术方案是：

优化多粘芽孢杆菌发酵液中E1和E2组分比例的方法，包括以下操作 步骤：

a、斜面培养：将多粘菌素生产菌株砂土孢子接种于斜面培养基中，于温度 28-30℃、湿度30％-60％的条件下培养48-72h；

b、种子液培养：挖取2-5cm²步骤a制备的斜面孢子接种于种瓶培养基中， 于温度28-30℃、湿度30％-60％、转速180-220rpm的条件下震荡培养24-26 h；

c、发酵培养：将步骤b培养成熟的种子液按2％的接种量接入发酵培养基 中，于温度28-30℃、湿度30％-60％、转速180-220rpm的条件下震荡培养 48-72h；在发酵培养24h-32h按不同配比加入缬氨酸和异亮氨酸继续培养；

d、发酵液中E1和E2组分检测：将步骤c培养48-72h后得到的多粘菌素 E发酵液中E1和E2组分的含量进行检测。

步骤a中所用的斜面培养基成分及其含量为：以质量百分比计，葡萄 糖1％-1.5％、硫酸铵1％-1.5％、柠檬酸钠1％-1.5％、磷酸二氢钾1％-1.5％、 硫酸镁0.12％-1.13％、琼脂2％-2.5％。

步骤b中所用的种子液培养基成分及其含量为：以质量百分比计，葡 萄糖2.0％-2.5％、蛋白胨1.5％-2.0％、氯化钠0.2％-0.3％、碳酸钙0.4％-0.5％、 泡敌0.04％-0.05％。

步骤c中所用的发酵培养基的成分及其含量为：以质量百分比计，玉 米淀粉6.0-8.0％、葡萄糖1.0％-1.5％、蛋白胨1.5％-2.0％、碳酸钙 0.4％-0.5％、氯化钠0.1％-0.2％、硫酸铵0.1％-0.2％、磷酸二氢钾1％-1.5％、 泡敌0.04％-0.05％。

步骤c中不同缬氨酸和异亮氨酸的配比包括以下三种情况：

Ⅰ、E2组分：E1组分≥2:1，添加缬氨酸使其在发酵液中的终浓度为：0.8 mg/mL-1.6mg/mL，同时添加异亮氨酸使其在发酵液中的终浓度为：0 mg/mL-0.1mg/mL。

Ⅱ、2:1>E2组分：E1组分>1:1，添加缬氨酸使其在发酵液中的终浓度为： 0.3mg/mL-0.8mg/mL，同时添加异亮氨酸使其在发酵液中的终浓度为：0.1 mg/mL-0.3mg/mL。

Ⅲ、E2组分：E1组分≤1:1，添加缬氨酸使其在发酵液中的终浓度为： 0mg/mL-1.2mg/mL，同时添加异亮氨酸使其在发酵液中的终浓度为：0.3 mg/mL-1.5mg/mL。

本发明的有益效果是：本发明研究的这种优化多粘菌素E发酵液中E1 和E2组分的方法解决了多粘菌素E发酵液中E1和E2组分比例不稳定性和 不可控性的问题，而且本发明具有方法简单、实用性强、重现性好的优点。 具体实施方式

本发明的目的是解决多粘菌素E发酵液中E1和E2组分的不稳定性和 比例的不可控性的问题，下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。

具体实施例1，E2组分：E1组分≥2:1的情况

a、斜面培养：将多粘菌素生产菌株砂土孢子接种于斜面培养基中，于温度 28-30℃、湿度30％-60％的条件下培养60h；

b、种子液培养：挖取2-5cm²步骤a制备的斜面孢子接种于种瓶培养基中， 于温度28-30℃、湿度30％-60％、转速180-220rpm的条件下震荡培养25h；

c、发酵培养：将步骤b培养成熟的种子液按2％的接种量接入发酵培养基 中，每个种子做4个平行样，于温度28-30℃、湿度30％-60％、转速180-220 rpm的条件下震荡培养60h；发酵25h后加入缬氨酸使其在发酵培养基中 的终浓度为0.954mg/mL，同时加入异亮氨酸使其在发酵培养基中的终浓度 为0.015mg/mL继续震荡培养；

d、发酵液中E1和E2组分检测：将步骤c培养60h后得到的多粘菌素E 发酵液中E1和E2组分的含量进行检测。

检测结果见表1

表1 60h发酵样品检测结果

发酵平行样品 E1(峰面积) E2(峰面积) E2/E1 发酵平行样品1 1021097 2225768 2.18 发酵平行样品2 1075070 2163723 2.01 发酵平行样品3 1060537 2240680 2.11 发酵样品均值 1052235 2210057 2.10

具体实施例2，2:1>E2组分：E1组分>1:1的情况

a、斜面培养：将多粘菌素生产菌株砂土孢子接种于斜面培养基中，于温度 28-30℃、湿度30％-60％的条件下培养60h；

b、种子液培养：挖取2-5cm²步骤a制备的斜面孢子接种于种瓶培养基中， 于温度28-30℃、湿度30％-60％、转速180-220rpm的条件下震荡培养25h；

c、发酵培养：将步骤b培养成熟的种子液按2％的接种量接入发酵培养基 中，每个种子做4个平行样，于温度28-30℃、湿度30％-60％、转速180-220 rpm的条件下震荡培养60h；发酵25h后加入缬氨酸使其在发酵培养基中 的终浓度为0.460mg/mL，同时加入异亮氨酸使其在发酵培养基中的终浓度 为0.148mg/mL继续震荡培养；

d、发酵液中E1和E2组分检测：将步骤c培养60h后得到的多粘菌 素E发酵液中E1和E2组分的含量进行检测。

检测结果见表2

表2 60h发酵样品检测结果

发酵平行样品 E1(峰面积) E2(峰面积) E2/E1 发酵平行样品1 1149420 1698556 1.47 发酵平行样品2 1232251 1665791 1.35 发酵平行样品3 1203322 1687841 1.40 发酵样品均值 1194998 1684063 1.41

具体实施例3，E2组分：E1组分≤1:1的情况

a、斜面培养：将多粘菌素生产菌株砂土孢子接种于斜面培养基中，于温度 28-30℃、湿度30％-60％的条件下培养60h；

b、种子液培养：挖取2-5cm²步骤a制备的斜面孢子接种于种瓶培养基中， 于温度28-30℃、湿度30％-60％、转速180-220rpm的条件下震荡培养25h；

c、发酵培养：将步骤b培养成熟的种子液按2％的接种量接入发酵培养基 中，每个种子做4个平行样，于温度28-30℃、湿度30％-60％、转速180-220 rpm的条件下震荡培养60h；发酵25h后加入缬氨酸使其在发酵培养基中 的终浓度为1.060mg/mL，同时加入异亮氨酸使其在发酵培养基中的终浓度 为0.366mg/mL继续震荡培养；

d、发酵液中E1和E2组分检测：将步骤c培养60h后得到的多粘菌素E 发酵液中E1和E2组分的含量进行检测。

检测结果见表3

表3 60h发酵样品检测结果

本发明研究的这种优化多粘菌素E发酵液中E1和E2组分的方法解决 了多粘菌素E发酵液中E1和E2组分比例不稳定性和不可控性的问题，而 且本发明具有方法简单、实用性强、重现性好的优点。