变异链球菌rnc基因突变株及其应用

摘要

本发明公开了一株长链状、低致龋能力的变异链球菌（Streptococcusmutans）rnc基因突变株及其在预防龋病方面的应用。该突变菌株通过变异链球菌UA159构建、筛选和鉴定而获得，保藏编号为：CCTCCM2013211,分类命名为StreptococcusmutansHT120211。本发明变异链球菌rnc基因突变株可制成微生态制剂，作为变异链球菌的替代菌株，调整口腔菌群失调，减少高致龋能力的变异链球菌数量，预防龋病的发生。

说明书

技术领域

本发明涉及一株通过变异链球菌UA159构建、筛选和鉴定而获得的长链状、低致龋能力的变异链球菌(Streptococcusmutans)rnc基因突变株及其在预防龋病方面的应用。该变异链球菌rnc基因突变株可制成微生态制剂，作为变异链球菌的替代菌株，调整口腔菌群失调，减少高致龋能力的变异链球菌数量，预防龋病的发生，属于龋病预防技术领域。 

背景技术

龋病发病率高，是最常见的人类感染性疾病之一，WHO调查发现全球约有50亿人患有龋病。在我国，2005年全国第三次口腔流行病学调查显示，5岁儿童的患龋率约为66％，中年人群为88.1％，65岁以上老年人群则高达98％，但龋病的治疗率则不足10％。5岁组乳牙龋齿个数3.5颗(dmft),35-44岁组恒牙龋齿个数4.51颗(DMFT),65-74岁组恒牙龋齿个数14.65颗(DMFT)。 

变异链球菌是与龋病发生发展关系密切的主要致龋菌。它通过代谢口腔内的碳水化合物产酸、导致牙菌斑生物膜的pH值下降来抑制其他共生菌的生长，从而奠定自己在生物膜中的优势地位。变异链球菌通过生物膜的形成，依靠细胞外基质的保护和其他信号传导通路来应对环境变化带来的压力。其分泌的葡糖基转移酶和果糖基转移酶可以有效合成细胞外多糖，一方面促进细菌与牙齿表面的黏附，一方面为其他的细菌的定植提供结合位点，促进稳定生物膜的形成。变异链球菌的主要致龋毒力因子主要包括其产酸、耐酸、胞外多糖合成、生物膜形成能力等。 

rnc基因是近年来在其他细菌中被广泛研究的基因。其在大肠杆菌中编码双链RNA特异性的内切核糖核酸酶RNase III，参与编码转录调节子gadX-gadW的mRNA处理过程，从而控制大肠杆菌对酸的反应。RNase III还被认为影响一些噬菌体、质粒和细胞基因的表达，在RNA处理、转录后基因表达控制、防御病毒入侵方面起着非常重要的作用。在天蓝色链霉菌中，RNase III被认为与孢子的形成和抗生素的产生有关。尽管RNaseIII在一些细菌内的生理功能被大量研究，但是在变异链球菌中存在的编码RNase III酶的rnc基因的功能并未被研究。其是否参与变异链球菌的一些生物学特性的调控，是否与变异链球菌致龋性有关尚不清楚。 

迄今为止尚未见到有关变异链球菌rnc基因突变菌株的构建及其在防治龋病中的应用的报道。 

发明内容

针对上述龋病高发，且没有特效药物防治的现状，本发明的目的是提供一株长链状、低致龋能力的变异链球菌(Streptococcusmutans)rnc基因突变株及其在预防龋病方面的应用。该变异链球菌rnc基因突变株可制成微生态制剂，作为变异链球菌的替代菌株，调整口腔菌群失调，减少高致龋能力的变异链球菌数量，预防龋病的发生。 

本发明的技术思路是：首先，基于龋病的防治尚无特效的药物，且由于变异链球菌是口腔最常见的致龋菌，因此选择致龋菌的变异链球菌作为内源性生态防龋的突破口，实施基因突变技术对目的基因进行敲除，可稳定地产生一株呈长链状、低致龋能力的变异链球菌基因突变株；然后，采用PCR技术以及DNA测序的方法，该株鉴定为变异链球菌rnc基因敲除突变株；最后，对含该株细菌的培养液进行人类龋病动物模型的致龋试验，结果显示出该突变菌株具有能够减少SPF级Vistar大鼠龋病的发生率的效果。 

具体讲，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是： 

本发明获得具有呈长链状、低致龋能力的变异链球菌rnc基因突变株的方法是(见图1)：采用从位于中国四川省成都市的口腔疾病研究国家重点实验室处获取的变异链球菌UA159(以下简称为“S.mutans UA159”)作为父本株(注：是采用单株进行基因突变)，用BHI培养基培养后，采用PCR连接诱变技术进行突变株的构建，得到一株抗红霉素、呈长链状、低致龋能力，能改善大鼠口腔的菌群结构，减少大鼠龋病的发生率的变异链球菌的rnc基因突变菌株，然后进行产酸、耐酸、耐氧化、早期粘附、生物膜形成及胞外多糖形成能力以及细菌毒力相关因子的比较试验。通过PCR扩增出突变菌株的DNA片段，经测序，获得目的基因序列，证实rnc基因被成功的敲除，确定该分离的菌株突变成功，该菌株为变异链球菌rnc基因缺失突变株(Streptococcus mutans HT120211)，它拥有更长的链状结构，产生更少的致龋毒力因子,已于2013年5月16日送交位于湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏日期为2013年5月16日，保藏编号为：CCTCC NO:M2013211。 

本发明变异链球菌rnc基因突变株Streptococcus mutans HT120211(以下文章中简称为“Streptococcus mutans HT120211CCTCC M2013211”，图片中简称“HT100211”)按照常规甘油冷冻方法保藏。 

本发明也提供“Streptococcus mutans HT120211CCTCC M2013211”在人类龋病大鼠模型中和父本株变异链球菌UA159的致龋能力的差异比较。 

分别使用过夜培养的S.mutans UA159和Streptococcus mutans HT120211CCTCC  M2013211菌液，感染SPF级Wistar大鼠细菌接种成功后，大鼠继续喂养3周，处死，取下颌骨，包埋、对下颌磨牙进行切片观察，照改良的Keyes法对龋坏数目及龋坏程度进行分级，并记录分析。结果表明Streptococcus mutans HT120211CCTCC M2013211具有与S.mutans UA159完全不同的致龋能力，突显出本发明Streptococcus mutans HT120211CCTCC M2013211具有减少人类龋病大鼠模型窝沟釉质龋损和牙本质浅层龋损的发生率的作用和效果。 

本发明具有以下效果： 

(1)本发明对变异链球菌UA159在正常条件下采用PCR连接诱变技术，通过基因重组，使红霉素抗性基因定点替换目的基因rnc,然后经过抗性培养基筛选，PCR+琼脂糖电泳、RT-PCR以及DNA核苷酸测序进行验证，从而可重复、稳定性得到本发明的变异链球菌rnc基因突变株“Streptococcus mutans HT120211CCTCC M2013211”。 

(2)本发明“Streptococcus mutans HT120211CCTCC M2013211”，具有抗红霉素、呈长链状、致龋能力低，能改善大鼠口腔的菌群结构，减少大鼠龋病的发生。 

(3)本发明“Streptococcus mutans HT120211CCTCC M2013211”可制成微生态制剂(以作为本发明变异链球菌的替代菌株)，调整口腔菌群失调，减少高致龋能力的变异链球菌数量，预防龋病的发生。 

附图说明

本发明的变异链球菌rnc基因突变株(Streptococcus mutans HT120211)，已于2013年5月16日由位于武汉的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏编号为：CCTCC NO:M2013211。 

图1为本发明的技术流程图 

图2—4为本发明“Streptococcus mutans HT120211CCTCC M2013211”细菌形态鉴定结果图 

图5为本发明“Streptococcus mutans HT120211CCTCC M2013211”生化鉴定结果图 

图6，7为本发明“Streptococcus mutans HT120211CCTCC M2013211”PCR片段的1.5％琼脂糖凝胶电泳检测图 

图8—13为本发明“Streptococcus mutans HT120211CCTCC M2013211”P1P4PCR产物的测序图谱 

图14为本发明“Streptococcus mutans HT120211CCTCC M2013211与变异链球菌UA159”生长曲线的比较图 

图15为本发明“Streptococcus mutans HT120211CCTCC M2013211与变异链球菌UA159” 产酸曲线的比较图 

图16为本发明“Streptococcus mutans HT120211CCTCC M2013211与变异链球菌UA159”环境应激耐受能力的比较图 

图17为本发明“Streptococcus mutans HT120211CCTCC M2013211与变异链球菌UA159”早期蔗糖依赖性粘附实验实验流程图 

图18为本发明“Streptococcus mutans HT120211CCTCC M2013211与变异链球菌UA159”早期蔗糖依赖性粘附实验结果图 

图19为本发明“Streptococcus mutans HT120211CCTCC M2013211与变异链球菌UA159”在不同培养基(BHI,BHI+0.5％蔗糖,BHI+1％蔗糖)中，生物膜形成实验实验流程图 

图20为本发明“Streptococcus mutans HT120211CCTCC M2013211与变异链球菌UA159”在不同培养基(BHI,BHI+0.5％蔗糖,BHI+1％蔗糖)中，生物膜形成情况图 

图21—26为本发明“Streptococcus mutans HT120211CCTCC M2013211与变异链球菌UA159”在不同培养基(BHI,BHI+0.5％蔗糖,BHI+1％蔗糖)中，生物膜电镜观察图片 

其中：图21—23是变异链球菌UA1598h16h24h生物膜扫描电镜结果(10000x)图；图24—26是变异链球菌Streptococcus mutans HT120211CCTCC M20132118h16h24h生物膜扫描电镜结果(10000x)图 

图27为本发明“Streptococcus mutans HT120211CCTCC M2013211与变异链球菌UA159”胞外多糖形成能力的研究图 

图28-29为本发明“Streptococcus mutans HT120211CCTCC M2013211与变异链球菌UA159”致龋毒力因子基因表达的体外研究结果图 

图30-31为本发明“Streptococcus mutans HT120211CCTCC M2013211与变异链球菌UA159”致龋毒力因子基因表达的人类龋病大鼠模型内研究结果图 

图32—34为本发明“Streptococcus mutans HT120211CCTCC M2013211、变异链球菌UA159与空白对照”人类龋病大鼠模型中导致的试验Vistar大鼠牙面龋坏图 

具体实施方式

实施例1：本发明“Streptococcus mutans HT120211CCTCC M2013211”的获取与鉴定，流程见图1 

1、本发明“Streptococcus mutans HT120211CCTCC M2013211”的构建与鉴定 

1.1菌株的培养 

从位于中国四川省成都市的口腔疾病研究国家重点实验室处获取的变异链球菌UA159(即： Streptococcus mutans UA159，简称“S.mutans UA159”)接种于牛脑心浸液(BHI)培养基(Sigma-Aldrich Corp,Saint Louis,MO,USA)，细菌常规传代过夜培养于DY-2型厌氧培养箱(37℃，5％CO2，10％H2，85％N2；浙江，中国)待用。 

1.2Streptococcus mutans HT120211突变菌株的构建 

查阅NCBI数据库，获得rnc基因，及其上下游片段的DNA序列，并在rnc基因上游约500bp与rnc基因内5’端约100bp的片段内设计引物(rnc-P1,rnc-P2)扩增rnc上游片段，同样在rnc基因下游约500bp与rnc基因内3'端约100bp的片段内设计引物(rnc-P3,rnc-P4)扩增rnc下游片段。所设计引物的特异性通过NCBI Blast(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)验证。同时使用erm-PF/erm-PR引物对从红霉素抗性基因盒(ermAM cassette)中扩增红霉素抗性片段。采用TaKaRa DNA纯化回收试剂盒，按照试剂盒的操作说明书，分别对rnc-P1/P2、rnc-P3/P4和erm-PF/erm-PR扩增的三个DNA产物进行纯化回收。然后37℃水浴下，分别使用限制性核酸内切酶FseI(New England Biolabs，USA)过夜酶切纯化的rnc-P1P2、限制性核酸内切酶AscI(New England Biolabs，USA)过夜酶切rnc-P3P4片段；AscI和FseI对纯化后的红霉素抗性基因erm-PFPR片段进行双酶切；酶切完成后将反应液置于65℃水浴中15min灭活限制性核酸内切酶，然后T4DNA连接酶(New England Biolabs，USA)连接酶切后的三个DNA片段，获得由以上三个DNA片段连接产生的rnc-P1P4片段。 

取20μl rnc-P1P4连接片段加入50μl过夜培养的S.mutans UA159菌液与0.5ml新鲜BHI液体培养基(含有终浓度为1μg/ml变异链球菌感受肽CSP)中，37℃厌氧培养3小时进行连接片段的转化。转化后接种于带有红霉素BHI平板(含终浓度10μg/ml红霉素)37℃厌氧培养48小时，筛选得到具有红霉素抗性的菌落。将抗性菌落分别传代培养48小时，进行菌落形态和显微镜细菌形态学检查(图2-4)。 

1.3Streptococcus mutans HT120211突变菌株的鉴定 

1.3.1Streptococcus mutans HT120211突变菌株的形态学与生化鉴定 

将抗性细菌接种于BHI固体培养基(含终浓度10μg/ml红霉素)中。37℃(5％CO₂，10％H₂，85％N₂)厌氧培养18h，涂片显微镜观察细菌形态，确定为纯培养后，采用反应板快速生化实验对变异链球菌Streptococcus mutans HT120211进行生化特征鉴定(图5)。 

结果显示：连接产物rnc-P1P4转化入变异链球菌UA159后，抗性平板筛选，成功的得到具有红霉素抗性的单菌落(如图2)；革兰染色鉴定为革兰阳性长链状球菌。红霉素抗性菌株经反应板快速生化实验鉴定为变异链球菌，能够代谢七叶苷、精氨酸、甘露醇、山梨 醇、棉子糖和密二糖。同时在液体培养基中，突变株与野生菌株显示出不同的生长方式Streptococcus mutans HT120211，突变菌株呈团块状，悬浮于较为清亮的培养基内，而野生菌株S.mutans UA159则在培养基内分布均匀，显示出均质的混浊悬液。 

1.3.2Streptococcus mutans HT120211突变菌株的PCR扩增及DNA测序鉴定 

采用特异性引物对rncP1/P2、rncP3/P4、rncP1/P4对突变体基因组DNA进行扩增，反应产物纯化回收后进行琼脂糖凝胶电泳和核苷酸序列测定，以验证红霉素抗性片段的正确插入(图6，图7)。 

反应产物纯化回收后进行核苷酸序列测定(图8-13)，结果显示了红霉素抗性片段替代rnc基因，正确插入rnc编码区域，证实了我们得到了一株新的突变株就是变异链球菌rnc基因突变菌株，根据国际通用命名原则，命名为Streptococcus mutans HT120211。该菌株已于2013年5月16日由中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，其保藏号为CCTCC NO:M2013211，简称“Streptococcus mutans HT120211CCTCC M2013211”。 

Streptococcus mutans生长与产酸能力的研究 

取变异链球菌UA159和Streptococcus mutans HT120211CCTCC M2013211对数生长中期菌悬液，接种于2ml新鲜BHI液体培养基的12孔板中(细菌终浓度为5x10⁵CFU/ml)，于37℃、5％CO2培养箱中恒温培养。在开始培养时、及每间隔1h，取出一个孔板，进行PH值与600nm波长吸光度值测定，监测细菌生长24h。以时间点为横坐标值，OD600值、pH值为纵坐标值分别绘制细菌的生长曲线与产酸曲线。 

24小时细菌生长曲线(图14)来看，Streptococcus mutans HT120211CCTCC M2013211与S.mutans UA159到达对数生长期的时间一致，对数生长期细菌倍增时间相同，在稳定期突变株的细菌菌细胞要多于S.mutans UA159。由细菌生长24h产酸曲线(图15)来看，突变株在对数生长期的PH值下降较UA159要慢，最终两者都达到PH值5.0，说明与野生菌株S.mutans UA159相比，Streptococcus mutans HT120211CCTCC M2013211细菌产酸速度变慢。 

.Streptococcus mutans HT120211CCTCC M2013211环境应激耐受性的研究 

通过对比UA159与Streptococcus mutans HT120211CCTCC M2013211在酸性pH值5.0环境中暴露2h、在含10μM过氧化氢的培养基内培养1h、含0.5M氯化钠的培养基内培养0.5h后细菌活力的变化，研究rnc基因对变异链球菌耐酸能力、耐氧化压力、耐渗透压力的影响。 

离心收集对数生长中期UA159和Streptococcus mutans HT120211CCTCC M2013211 细菌，重悬于2ml生长培养基(pH值5.0)、2ml含10μM过氧化氢的培养基、2ml含0.5M氯化钠的培养基，分别厌氧37℃培养2h、1h和0.5h。培养前后分别从反应体系吸取100μl菌液，梯度稀释，螺旋接种仪接种于BHI培养基，厌氧37℃培养48h，进行活菌菌落计数。 

经三个因素分别处理后的活菌菌落计数(如图16)结果显示：PH值5.0暴露2h、10μM过氧化氢处理1h后UA159活菌较Streptococcus mutans HT120211CCTCC M2013211多，两者之间差异具有统计学意义。0.5M氯化钠溶液处理0.5h后，Streptococcus mutans HT120211CCTCC M2013211活菌数较UA159多，两者之间差异具有统计学意义，说明Streptococcus mutans HT120211CCTCC M2013211具有更低的环境耐受力。 

.Streptococcus mutans HT120211CCTCC M2013211蔗糖依赖性粘附实验 

使用6孔板对变异链球菌UA159和Streptococcus mutans HT120211CCTCC M2013211进行早期表面黏附的研究。6孔板采用无菌唾液室温预处理1h，具体实验流程如图17所示。 

按照下列公式计算黏附细菌的百分率： 

1h、2h、4h的细菌蔗糖依赖性粘附实验结果显示：Streptococcus mutans HT120211CCTCC M2013211的蔗糖依赖性粘附能力较UA159低。三个时间点，两菌株之间的差异均具有统计学意义，如图18所示。特别是4h时，Streptococcus mutans HT120211CCTCC M2013211的黏附细菌百分率较UA159明显减少。 

.Streptococcus mutans HT120211CCTCC M2013211生物膜形成能力的研究 

采用96孔板生物膜形成模型，对比变异链球菌UA159与Streptococcus mutans HT120211CCTCC M2013211体外生物膜形成能力，分析rnc基因是否对变异链球菌生物膜的形成具有一定影响。实验流程如图19所示。 

另外，将变异链球菌UA159与Streptococcus mutans HT120211CCTCC M2013211接种于12孔板内培养生物膜。孔板内放置无菌玻片(1cmx1cm)，添加2ml BHI培养基(含1％蔗糖)，细菌终浓度为5x10⁵CFU/ml。将12孔板置于37℃厌氧培养8h、16h、24h后，小心吸取微孔中的液相浮游细菌细胞，然后使用PBS缓冲液洗涤生物膜3次。将生物膜玻片固定、梯度脱水、置换、干燥喷金后在扫描电子显微镜下进行观察并进行图像采集 

结果发现：96孔板生物膜形成实验结果显示，S.mutans UA159可以在孔板底部形成均匀致密的生物膜，而Streptococcus mutans HT120211CCTCC M2013211所形成的生物膜结构，稀 疏不均，形成生物膜的量较UA159明显减少。在含0.5％蔗糖和1％蔗糖的培养基内，UA159形成生物膜的量大于Streptococcus mutans HT120211CCTCC M2013211，两者之间的差异具有统计学意义(图20)。 

扫描电镜结果显示UA159与Streptococcus mutans HT120211CCTCC M2013211在生物膜结构和细菌形态上存在较大不同。UA159生物膜的结构更加致密均匀，长短链之间结合紧密，而Streptococcus mutans HT120211CCTCC M2013211生物膜内长链状的细菌排列混乱，生物膜空隙较大，生物膜厚度不及UA159(图21-26)。 

Streptococcus mutans胞外多糖形成能力的研究 

采用12孔板体外培养模型，在BHI液体培养基内加入30mM[¹⁴C]标记的蔗糖(0.02μ Ci/ml)。37℃，厌氧培养24h后轻轻取出生物膜标本，置于2ml去离子水中，无菌刮勺刮净玻片表面生物膜，震荡重悬，10000g4℃离心10分钟收集上清，再次用2ml去离子水震荡重悬重复上述操作两次，合并上清液即为收集的水溶性多糖。沉淀用0.4M氢氧化钠溶液2mL洗涤、离心，重复三次，合并上清，即为收集的水不溶性多糖。加入无水乙醇沉淀18h，采用孔径0.22μm的玻璃纤维滤膜过滤收集多糖，闪烁计数法测胞外多糖量。 

结果发现Streptococcus mutans HT120211CCTCC M2013211生物膜内水不溶性的胞外多糖较UA159少，两者之间差异具有统计学意义(p<0.05)(图27)。 

“Streptococcus mutans HT120211CCTCC M2013211与变异链球菌UA159”致龋毒力因子基因表达的体外研究 

取上述菌悬液1.5ml培养物，加入3mlRNA稳定剂(QIAGEN)，混匀5sec，室温放置5min。4℃12000rpm离心2分钟收集菌体，仔细去除所有培养基上清。用含有30mg/ml溶菌酶的200μlTE缓冲液彻底重悬菌体，37℃孵育10min。采用Trizol法提取。样品使用Nano Vue Plus分光光度计测量所提取RNA的纯度与浓度。按照PrimeScript RT reagent Kit With gDNA Eraser(TaKaRa)说明书提供方法进行逆转录反应。 

根据SYBR Premix Ex Taq II(TaKaRa)说明书提供的方法进行反应体系加样和两步法PCR扩增程序进行目的基因的real-time PCR扩增，扩增后获得各目的基因Ct(cycle threshold)值。本实验采用相对定量的方法，通过2^-ΔΔCt法对目的基因的相对表达水平进行计算分析，获得变异链球菌UA159与Streptococcus mutans HT120211目的基因的表达差异，通过独立样本T检验(independent-sample T test)方法对差异进行统计分析(p<0.05为差异具有统计学意义)。 

体外实验中RT-PCR结果显示S.mutans UA159与Streptococcus mutans HT120211 CCTCC M2013211相比，Streptococcus mutans HT120211CCTCC M2013211的gtfB、vicRKX基因的表达水平明显上调，gtfC、gtfD、ftf和gbpB基因的表达水平也略有上调(图2829)。 

实施例2：本发明“Streptococcus mutans HT120211CCTCC M2013211”在人类龋病大鼠模型中和父本株变异链球菌UA159的致龋能力的差异比较 

1.人类龋病大鼠模型中，变异链球菌UA159和Streptococcus mutans HT120211CCTCC M2013211接种于10ml BHI(补充1％蔗糖)过夜培养后，离心，弃上清后重悬于10ml新鲜的BHI培养基中。吸取菌悬液100μl于2ml BHI培养基中继续培养至光密度值0.4(OD600)。 

体内实验中菌株定植成功后动物连续饲养3周，CO₂窒息法处死大鼠，取下颌骨标本，灭菌的生理盐水轻轻的冲洗3次。右侧下颌骨室温条件下放入装有5mlRNA组织样品保护液的灭菌15ml试管中1h。超声波细胞破碎仪将牙面上的菌斑震落(脉冲幅度10S,功率7W)，将含有颌骨的菌斑悬浊液4℃离心20min(5500g)，弃上清，小心取出颌骨，将沉淀转移至灭菌的1.5ml离心管，用于RNA的提取。 

主要仪器和分析软件 

NanoVue Plus Spectrophotometer(GE Healthcare,England) 

ABI PRISM^TM3730XL DNA Analyzer(Applied Biosystems,USA) 

1.1细菌总RNA提取与纯化 

取上述菌悬液1.5ml培养物，加入3mlRNA稳定剂(QIAGEN)，混匀5sec，室温放置5min。4℃12000rpm离心2分钟收集菌体，仔细去除所有培养基上清。用含有30mg/ml溶菌酶的200μlTE缓冲液彻底重悬菌体，37℃孵育10min。采用Trizol法提取RNA。按照PrimeScript RT reagent Kit With gDNA Eraser(TaKaRa)说明书提供方法进行逆转录反应。 

1.2实时定量PCR 

SYBR Green I嵌合荧光法进行Real-time PCR扩增。共扩增6个目的基因(引物序列如表1-1)，采用ABI PRISM7300按照两步法进行PCR扩增程序。 

表1-1Real-time PCR引物序列 

体内实验发现，与野生株UA159相比，突变株Streptococcus mutans HT120211CCTCC M2013211的gtfB、gtfC、gtfD、ftf和gbpB基因的表达水平明显上调，与前期的体外实验结果趋势相同，但上调的程度要高于前期实验(图3031)。 

2.突变株Streptococcus mutans HT120211CCTCC M2013211致龋能力的评价 

将第7步中除去牙菌斑的左右侧下颌骨用2.5％戊二醛固定24h后，酒精梯度脱水，包埋，修整组织包埋块，固定在硬组织切片机上。用超薄金刚砂片冷却状态下沿下颌骨磨牙牙合面近远中向矢状半切，体视显微镜下观察患龋情况,根据Keyes经典评分方法对大鼠磨牙光滑面和窝沟龋损进行分级并记分，该过程由另两名实验者盲法完成(1人记录Keyes评分，另1人核对)。采用统计软件SPSS13.0中的One-Way ANOVA分析各组差异，在F值有意义情况下，再进行各组的两两比较(S-N-K检验)。α＝0.05。 

结果发现，对于窝沟釉质龋损和牙本质浅层龋损(图32-34)，阳性对照组(变异链球菌野生株UA159)的记分显著高于突变株Streptococcus mutans HT120211CCTCC M2013211组和阴性对照组(P<0.05)，而突变株Streptococcus mutans HT120211CCTCC M2013211组和阴性对照组的龋坏记分无统计学差异(P>0.05)。对于光滑面釉质龋损，阴性对照组、野生株UA159组和突变株Streptococcus mutans HT120211CCTCC M2013211组记分无统计学差异(P>0.05)，见表1-2。试验结果表明：添加本发明“Streptococcus mutans HT120211CCTCC M2013211”具有明显降低人类龋病大鼠模型的窝沟釉质龋损和牙本质浅层龋损的发生率的效果。 

变异链球菌rnc基因突变株核苷酸序列见序列表。 

CGATCCAAATTATCCTGAGTCTGTGTTAGCTTAGACTGCGTCTCTTTTTTACGTGTTTTGTATTTTAAGACACCGGCTGCTTCTTCAAAAATTGAACGACGCTCTTCTGGTTTACTATTAAAAATCTCTTCCACACGTCCTTGAGAAATAATGGAAAAGGAATCACGCCCCAAACCAGTATCCATAAACAAATCGTGAATATCGCGCAGGCGTACTTTTTTACCATCAATAAGATAATCACTGTCCCCATTACGATAAATATGGCGTTCAATGCGAATCTCCTCTTGAGCGTCTTTGATAAAGGCATCGCTATTATCTAAAATAACCGTTACTTGAGCGTAATTGAGTGGCTTTCGATTTTCAGTTCCTGCAAAAATCACGTCTGGCATCTTACCGCCACGCAGGCTCTTGGCACTTGACTCACCCAAAGCCCAGCGTAAACTCTCCGTAATATTACTCTTTCCTGAACCATTTGGTCCAACAACGGCTGTCACTCCTCTGTCGAACTCAACCTTGGTCTTATCAGCAAAAGATTTAAATCCCTGCATTTCAATTTCTTTTAAAAACATTAAGAACCTCGTTGAAGTTTTTCAAGCGCATTTTTAGCAGCCTCTTGCTCTGGGCGCGCCCCGGGCCCAAAATTTGTTTGATTTGTATCTTAAAATTTTGTATAATAGGAATTGAAGTTAAATTAGATGCTAAAAATTTGTAATTAAGAAGGAGTGATTACATGAACAAAAATATAAAATATTCTCAAAACTTTTTAACGAGTGAAAAAGTACTCAACCAAATAATAAAACAATTGAATTTAAAAGAAACCGATACCGTTTACGAAATTGGAACAGGTAAAGGGCATTTAACGACGAAACTGGCTAAAATAAGTAAACAGGTAACGTCTATTGAATTAGACAGTCATCTATTCAACTTATCGTCAGAAAAATTAAAACTGAATACTCGTGTCACTTTAATTCACCAAGATATTCTACAGTTTCAATTCCCTAACAAACAGAGGTATAAAATTGTTGGGAGTATTCCTTACCATTTAAGCACACAAATTACTAAAAAAGTGGTTTTTGAAAGCCATGCGTCTGACTTCTATCTGATTGTTGAAGAAGGATTCTACAAGCGTACCTTGGATATTCACCGAACACTAGGGTTGCTCTTGCACACTCAAGTCTCGATTCAGCAATTGCTTAAGCTGCCAGCGGAATGCTTTCATCCTAAACCAAAAGTAAACAGTGTCTTAATAAAACTTACCCGCCATACCACAGATGTTCCAGATAAATATTGGAAGCTATATACGTACTTTGTTTCAAAATGGGTCAATCGAGAGTATCGTCAACTGTTTACTAAAAATCAGTTTCATCAAGCAATGAAACACGCCAAAGTAAACAATTTAAGTACCGTTACTTATGAGCAAGTATTGTCTATTTTTAATAGTTATCTATTATTCAACGGGAGGAAATAATTCTATGAGTCGCTGCCGACTGGCCGGCCGTTTAGGAGGCGATGCTCATTAGCATAACTAGTATGAGTAAAGGCAGTTTCCAATAATTCCTTGTCAGAAAAGACGATCTTAAAGTCTTCTGCCAGTTTTTTTTCTAATGTTTTCATATAAATCCTTTCTTTTATCCTTAGACCTTTCTATTATAGCAAAAATCACCCAGAACAACCATTTCCGAGTAATCTTTGTTTTTCATTCTTCCTTTTAAGCTGTCCACTAGATTTTTGCTAATGGTAAAGCAGTATCTGGCGAGGTATCATAAATCTTAAAATCATGATCTACAGCCAAATCTGCCTGCATGAGAGCATTCTTCATCGTCATATGGGCTAATTCTTTGACATTGTTTTCTTTGCTGAGATGTCCCAAATAAATCTTTTTTGTTTTATTCCCCAAAGTTCGAACCATTGTTTCTGCACCATCATCATTTGATAGGTGTCCTTTATCGGATAAAATACGCTGTTTTAAACTCCAAGGGTAGATACCTGAGCGTAAAATTTCAATATCATGATTGGACTCAATCAGATAACCATCAGCATTTTCAATCAGATCTGCCATACGATCACTGACATAACCTGTATCCGTCAATATAACAAAGCTCTTGCCGTCTTTCATCAGGCGGTAAAACTGTGGTTGAGCAGCATCATGGCTGACACCAAAACTTTCAATATCAATATCCCCAAAAGTGATGGT