包含灭活的基孔肯雅病毒株的疫苗组合物

摘要

公开了用于预防和治疗基孔肯亚病毒感染的疫苗组合物，其能够针对基孔肯亚病毒的任何基因型变异体给予免疫力。更特别地，本发明公开了特定的核苷酸序列和其翻译的蛋白质，所述蛋白质可被表达为用作抗基孔肯亚病毒感染的疫苗抗原的病毒样粒子。本发明中公开的组合物对可被该疾病的任何适合载体包括白纹伊蚊和埃及伊蚊所传播的基孔肯亚病毒的任何基因型变异体也具有保护作用。

说明书

发明领域

本发明涉及用于对基孔肯亚（Chikungunya）病毒引起的任何感染的预 防和治疗的稳定的免疫原性组合物。本发明特别涉及基孔肯亚病毒（此后 称为CHIKV）株的组合物和其病毒的亚单位抗原用于人类中基孔肯亚感染 的预防、治疗处理和诊断的用途。尤其是，本发明涉及用于基孔肯亚病毒 的任何基因型或抗原性变异体或突变体的预防和治疗的稳定的免疫原性 疫苗组合物，所述免疫原性疫苗组合物给予对基孔肯亚病毒的任何基因型 变异体或突变体的血清保护足够的抗体滴度。本发明也涉及用于对基孔肯 亚病毒联合选自以下列表的其它细菌性和病毒性感染的免疫的疫苗组合 物，该列表包括但不限于日本脑炎病毒疫苗、登革热疫苗、西尼罗河病毒 疫苗和金迪普拉（Chandipura）病毒疫苗和狂犬病疫苗。与其它病毒疫苗 的组合也在本发明的范围之内。

发明背景

基孔肯亚病毒（CHIKV）是科披膜病毒科（Togaviridae）的甲病毒。 它是引起特征为高热和多发性关节痛突然发病的通常非致死性感染的正 链RNA病毒。自从2005年的复活感染以来，报告了迄今未与CHIKV感 染关联的包括癫痫（seizure）、淋巴结病、暴发性肝炎和结膜炎的出血性和 神经系统表现（Sourisseau等人，2007；Kannan等人，2007）。基于部分 E1结构糖蛋白序列的系统发育分析已经确认了三个CHIKV谱系，西非、 亚洲以及东部、中部和南部非洲（ECSA）（Power等人，2000）。亚洲谱系 在印度和东南亚传播，直至它被ECSA基因型代替，后者在印度洋岛的 2005-2006年爆发期间出现（Yergolkar等人，2006）。本地建立的ECSA株 的亚谱系被旅行者从地方性区域传播至非洲、亚洲和欧洲并引起当地爆发 （Powers和Logue，2007）。在2006年，将近一百三十九万基孔肯亚病毒 感染疑似病例发生于印度。（印度国家载体传播疾病控制项目（National  Vector Borne Disease Control Programme，NVBDCP），2007）这由携带 E1-226A的ECSA株引起（Arankalle等人，2007）。增加通过白纹伊蚊（Aedes  albopictus）的传播性的E1-A226V适应性突变对自从那时病毒的广泛地理 传播负责（de Lamballerie等人，2008）。在自从2005年以来基孔肯亚病毒 的爆炸性爆发中牵涉到宿主免疫压力和导致的在CHIKV基因组的人白细 胞抗原（HLA）1类限制性元件中的位点特异性突变（Tong等人，2010）。 本领域已知的现有技术不包括任何来源于ECSA株的疫苗候选者。Bharat  Biotech International Limited早些时候开发了（公开于WO2008/026225） 带有E1-226A的2006ECSA株和它在抗基孔肯亚病毒感染的潜在疫苗的开 发上的用途。

城市（流行性）传播周期的基孔肯亚病毒株显示了比地方流行性（森 林型（sylvatic））周期的病毒株更高的进化率，两种传播周期的进化动力 学上的区别受决定病毒-宿主相互作用的几个因素影响，例如载体多样性和 丰度、载体幼虫栖息地和人群中的群体免疫力（herd immunity in the  population）（Volk等人，2010）。虫媒病毒如基孔肯亚与节肢动物和脊椎动 物宿主都相互作用，且对于包膜糖蛋白的选择压力受对载体适应的偏爱和 脊椎动物宿主免疫防卫机制驱动。病毒进化趋向于选择参与中和的抗原决 定簇以及参与载体/宿主适应的那些残基的突变。

开发中的疫苗例如WO2008030220和Akahata等人2010中公开的疫 苗利用西非基因型和E1-A226V分离株。另一个CHIKV疫苗开发是与本 发明中公开的疫苗范围不同的DNA疫苗（Mallilankaraman等人，2011）。 为减毒活疫苗的较早的原型疫苗使用病毒的亚洲基因型（Edelman等人， 2001）。目前DNA疫苗在人类预防性疫苗接种中还不成功，CHIKV减毒 活疫苗在接受疫苗的人类受试者中引起副作用（Edelman等人，2001）。用 于早期疫苗开发中的CHIKV株（WO2008/026225）为带有E1-226A的2006 ECSA株。如本发明所公开的在2009-2010年从印度分离的株属于ECSA 谱系内的不同的亚谱系并携带在E2和E1包膜糖蛋白处的新突变。研究中 报告的所有分离株中的E1糖蛋白中的突变之一定位在决定宿主载体特异 性并在对埃及伊蚊（Aedes aegypti）的增强适应的显著正选择之下的区域， 埃及伊蚊是区域中且事实上在基孔肯亚病毒感染的流行现在是地方性的 热带国家中最丰富的蚊载体。也公开了迄今未报告的其它新突变。因此期 望制备将对基孔肯亚病毒的ECSA株的新开发的和不同的亚谱系给予免疫 力、也将对载体埃及伊蚊传播的ECSA株的其它突变株给予免疫保护的疫 苗组合物。本申请中的发明人在长期的研究后在本申请中公开了包括与较 早的疫苗（WO2008/026225）相比具有其它额外优势的这样的有效疫苗， 其它额外优势例如灭活病毒的新方法和使用增强灭活病毒疫苗的免疫原 性的新佐剂的改进制剂和重组亚单位疫苗和在此也包括在本发明中的病 毒体（virosome）。

发明目标

本发明的一个目标是提供能够预防以及提供治疗基孔肯亚病毒引起 的感染的稳定疫苗组合物。所述疫苗组合物适用于基孔肯亚病毒的任何基 因型变异体的预防和其治疗。

本发明的另一个目标是提供能够预防以及提供治疗由任何适当的载 体传播的基孔肯亚病毒引起的感染的稳定疫苗组合物，其包括预防和治疗 由刚好是基孔肯亚病毒最常见的适应性载体的载体白纹伊蚊和埃及伊蚊 传播的基孔肯亚感染。

本发明的又另一个目标是提供对基孔肯亚病毒特别是ECSA株和其适 用的特别不同和独特的亚谱系的任何基因型变异体有效的稳定的疫苗组 合物。

本发明的又一个目标是提供其中疫苗的抗原成分包括整个灭活病毒 粒子或者能被表达为病毒样粒子（此后称为VLP）的重组CHIKV病毒株 的亚单位抗原联合适当的药学可接受载体、稳定剂和佐剂的稳定的疫苗组 合物。

本发明的又另一个目标是提供制备能够引起足以预防以及提供治疗 由基孔肯亚病毒的任何基因型突变体或变异体引起的感染的免疫应答的 稳定的疫苗组合物的方法，所述方法包括CHIKV病毒灭活和以适当的量 与佐剂混合。

本发明的另一个目标是提供对于人类中基孔肯亚病毒感染的诊断有 用的针对基孔肯亚病毒株或其亚单位抗原如此产生的抗体。

本发明的又一个目标涉及提供适合作为有效疫苗候选者的基孔肯亚 病毒的主要抗原决定簇和其公开的核苷酸和蛋白质序列。

本发明的又另一个目标包括用于预防和治疗由基孔肯亚病毒引起的 感染和选自下列列表的其它细菌性和病毒性感染有效的组合疫苗组合物 （combined vaccine compositions），列表包括但不限于疫苗日本脑炎病毒疫 苗、登革热疫苗、西尼罗河病毒疫苗和金迪普拉病毒疫苗和狂犬病疫苗。

发明概述

根据本发明的一个方面，本发明包括具体地包含CHIKV病毒株的灭 活全病毒粒子或亚单位抗原的疫苗组合物。本发明的组合物更具体地涉及 能够针对基孔肯亚病毒感染引起保护性抗体和强T细胞应答的疫苗。

本发明的另一个方面是提供灭活的重组CHIKV疫苗连同提供高保护 效力的适当佐剂。

本发明的又另一个方面更具体地涉及能够针对基孔肯亚病毒感染引 起保护性抗体和强T细胞应答的疫苗。

本发明的另一个方面涉及制备和使用表达为用于引起保护性免疫应 答的重组蛋白、病毒样粒子和病毒体的具有确定序列的基孔肯亚病毒 （CHIKV）抗原的方法。这样的亚单位疫苗的效力与由使用试剂灭活的 CHIKV灭活全病毒粒子组成的疫苗在给予疫苗高免疫原性的条件下所引 起的效力相当。

本发明的另一个方面涉及病毒灭活的方法，其包含热、γ射线、紫外 线或化学灭活的在稳定制剂中的基孔肯亚病毒分离株的全病毒粒子。两种 或多种灭活剂的组合也被使用并具有相似效果。本发明中公开的病毒分离 株被用于疫苗开发，并且所有方法均适用于基孔肯亚病毒的任何基因型或 基因型的变异体/血清型/株/突变体。

本发明的另一个方面是提供在哺乳动物中优选在人类中胃肠外施用， 优选皮内、肌肉内或皮下施用时引起强免疫应答，并且当粘膜内和以其它 途径例如口服途径施用时有效的针对基孔肯亚病毒的疫苗组合物。

本发明的又另一个目标是提供用于在哺乳动物优选人类中治疗和诊 断基孔肯亚病毒感染的抗基孔肯亚病毒或其亚单位抗原的抗体。

本发明的另一个方面是提供用于单独或与本发明的范围内包括的其 它疫苗联合时引起保护性抗体和强T细胞应答的组合物。联合的其它疫苗 是但不限于疫苗日本脑炎病毒疫苗、登革热疫苗、西尼罗河病毒疫苗和金 迪普拉病毒疫苗和狂犬病疫苗。

附图简述

图1：

检测了几种灭活方法灭活的CHIKV全病毒粒子抗原的免疫原性的效 力。实施例2提供了灭活程序的详情。在4-6周龄Balb/c小鼠（每组8只） 以间隔为0、7、21天的三次肌肉内注射检测了15μg灭活病毒疫苗的效力， 在最后一次剂量施用后7天采血。仅仅单个剂量的活病毒被施用用于比较。 通过PRNT₅₀估计中和抗体的滴度来检测疫苗制备物的效力。

图2：

在4-6周龄Balb/c小鼠（每组8只）以间隔为0、7、21天的三次肌肉 内注射检测了带有和不带有佐剂的CHIKV疫苗制备物的免疫原性，在最 后一次剂量施用后7天采血。实施例5中提供了带佐剂的疫苗制剂的组成。 通过PRNT₅₀估计中和抗体的滴度来检测疫苗制备物的效力。

发明详述

由于序列多样性还未报告关于CHIKV血清型的进化的详细研究。我 们首次报告了CHIKV的ECSA株对埃及伊蚊的适应性进化，如在从印度 的2009-2010病毒分离株所发现。偶然地，埃及伊蚊是印度和实际上几个 热带国家最普遍的载体。除了本发明中报告的分离株中的独特突变，病毒 株还交叉中和CHIKV的亚洲基因型和各种ECSA亚谱系，表明它们是疫 苗开发的好的候选者。使用更好适应于本地区最普遍载体的病毒株或来源 于其这样株的抗原，而不是使用现在比起ECSA基因型不是如此广泛流 行的西非或亚洲基因型的株对于疫苗开发是重要的。甚至在ECSA基因 型中，使用候选者例如携带作为增加在白纹伊蚊中的传播性的适应性突变 的E1-A226V突变的来自留尼汪岛的LR2006分离株是更不利的，因为在 印度白纹伊蚊载体仅仅在沿着印度的西海岸例如Kerala州和南部海岸 Karnataka是广泛流行的，然而在该国其他地区最丰富的蚊载体是埃及伊 蚊。本发明中分离和报告的病毒株的独特之处在于它们显示了对埃及伊蚊 的适应性进化，同时也感染白纹伊蚊。除了增加对埃及伊蚊的适应性的独 特突变外，本发明的优势是病毒分离株还交叉中和亚洲基因型和各种 ECSA变异体株，因此是好的候选疫苗。因此，来源于这些分离株的病毒 抗原或重组抗原的亚单位疫苗也是好的疫苗候选者，因为重组疫苗抗血清 也交叉中和不同的基因型和基因型变异体。

因此，使用对埃及伊蚊显示独特适应性并也感染白纹伊蚊的印度病毒 株比使用西非、亚洲或ECSA E1-226A和其它变异体株有优势，因为埃及 伊蚊是在世界上具有CHIKV感染最高发生率的在印度最广泛流行的载体。

本发明范围内的基孔肯亚病毒分离株是属于其结构多蛋白序列包含 衣壳、E3、E2、6K和E1（C-E3-E2-6K-E1）蛋白的ECSA（东部、中部和 南部非洲）基因型的那些。从2009-2010年印度流行中获得的分离株在目 前为止报告的序列中是独特的。包含C-E3-E2-6K-E1蛋白的结构多蛋白序 列已经在2010年4月27日被存放在公共序列库（GenBank）中并已经分 配登录号HM159385到HM159390。在提交临时专利申请的日期后，序列 被发表于2012年3月。在本发明中报告的独特的核苷酸序列是SEQ ID  NO.1(分离株TN01610)、SEQ ID NO.2(分离株TN15110)、SEQ ID NO.3 (分离株TN06210)、SEQ ID NO.4(TN06310)、SEQ ID NO.5(TN06410) 和SEQ ID NO.6(AP0109)，当翻译后其对应的蛋白质序列分别是SEQ ID  NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12和 SEQ ID NO.13。CHIKV株CHIKV/03/06具有SEQ ID NO.7的结构多蛋白 并在2006年印度流行期间被分离，对应的蛋白序列是SEQ ID NO.14。括 号中提供了病毒分离株的名称。SEQ ID NO.15到SEQ ID NO.20中提供了 本发明的以上提到的病毒的分离株的全长基因组RNA序列。

除了与S27非洲原型(Gen Bank登录号AF369024)相比的其它氨基酸 变化以外，本发明中公开的分离株的序列具有独特的遗传特征例如在结构 多蛋白序列上T1766C(E2-V264A)+A3058G(E1-K211E)+3104C (E1-226A)的组合。括号中表明了结构多蛋白的核苷酸替换的位置和多蛋白 内单个蛋白中对应的氨基酸变化。报告的其它独特突变是TN06310中的衣 壳-A232V、TN15110中的E3-D40N、TN06210中的E2-K47N、TN01610 和AP0109中的E2-G55R、TN064110中的E2-K66E、AP0109中的E1-P58L 以及TN15110和TN06310中的E1-G195R。通过对ECSA株的“ω”（非同 义替换与同义替换的比例）的最大似然估计的逐个密码子分析显示本发明 中报告的分离株中（SEQ ID NO.8到SEQ ID NO.13）的氨基酸突变 E1-K211E在显著的正选择之下（后验概率≥0.97;p<0.05）并暗示在伊蚊载 体，特别是在埃及伊蚊中增加感染性的适应性突变。氨基酸残基E1-211E 在通过埃及伊蚊传播的CHIKV亚洲基因型中是保守的。本发明公开的其 它突变例如三个新突变E2-K47N、E2-G55R和E2-K66E也聚集在被报告 在埃及伊蚊中增加辛德比斯（Sindbis）病毒的感染性的E2蛋白的同样区 域。E2氨基酸52-82区域被暴露在突起的顶端，突起是与细胞受体的接触 点。通过SLAC（单一祖先似然计算(Single Likelihood Ancestor Counting)）、 eFEL（固定效应似然(Fixed Effects Likelihood)）、iFEL(内部固定效应似然 (internal Fixed Effects Likelihood))和REL（随机效应似然(Random Effects  Likelihood)）对“ω”的逐个密码子最大似然估计确认了显著纯化选择下跨衣 壳和结构糖蛋白的氨基酸位点。在被负选择的氨基酸位点中，E2-199Y残 基被所有四种似然估计（通过REL，后验概率>0.99，通过iFEL，p<0.01, 通过SLAC，p=0.001，以及通过eFEL，p=0.00）选择作为在最显著纯化选 择下的遗传位点。E2-199Y是确定病毒在蚊中适应性的基孔肯亚病毒的重 要残基。

病毒进化倾向于选择参与中和作用的抗原决定簇以及参与载体/宿主 适应性的那些残基里的突变。因为它的高免疫学特异性，血清中和性试验 经常是金标准，对照其评价了其它血清学技术的特异性。针对本发明中报 告的病毒分离株培养的抗血清中和了亚洲和ECSA谱系的病毒分离株和包 括E1-A226V ECSA变异体株在内的ECSA基因型的几个变异体株，表明 它们是好的疫苗候选者，因为它们具有广泛的中和活性。

基孔肯亚病毒粒子作为免疫原的特性，病毒在宿主细胞系中向高滴度 的适应性和增殖，通过RT-PCR确定病毒的身份（identity），纯化和灭活病 毒的方法，在适合于人类中施用的药学可接受载体中对稳定疫苗制剂的制 备，在动物模型中对疫苗效力的病毒测定和试验也在本发明的范围内。从 感染患者中获得或从病毒驻留的病毒载体中分离的病毒粒子在细胞系中 适应并在细胞培养中经过几代传代体外增殖。

CHIKV株在灭活全病毒粒子疫苗的开发中的用途是本发明的一个方 面。基孔肯亚病毒株感染哺乳动物细胞系以产生病毒粒子。哺乳细胞包括 但不限于Vero细胞（ATCC CCL-81），MRC-5或适合于人类使用疫苗生产 的任何其它细胞系。

从细胞培养中获得的全病毒粒子用不同灭活剂灭活。在灭活过程中的 最佳时间、温度和稳定剂例如糖如蔗糖、乳糖、海藻糖和其它糖和糖组合 的使用，和单独或与不同糖联合使用添加糖醇例如甘露醇和山梨醇，单独 或与糖、氨基酸和糖醇联合使用添加人血清白蛋白是在本发明的范围内。 在保留疫苗制备物的高免疫原性的条件下，通过热、伽马辐照或紫外光或 通过化学方法使用福尔马林和β-丙内酯（BPL）以及其它方法灭活使病毒 成为非感染性的。病毒灭活的条件被优化并展示在实施例2中。化学灭活 剂选择自下列列表中，其包括但不限于：福尔马林、β-丙内酯、戊二醛、 N-乙酰基乙烯亚胺、二乙烯亚胺、三乙烯亚胺（tertiary ethyleneimine）、抗 坏血酸、辛酸、补骨脂素、包括非离子去污剂的去污剂等被加至病毒悬浮 液以灭活病毒。或者单用或者以不同组合使用的糖、糖醇、人血清白蛋白 和氨基酸的浓度位于浓度范围0.01%到20%，优选0.1%到10%，最优选 0.1%到5%。在稳定剂的存在下灭活的时间和温度从2-8℃到37℃之间， 在变化的时间段例如30分钟到20天内优化。这样的疫苗制剂是高度免疫 原性的并引起保护性中和抗体。

基孔肯亚病毒的结构糖蛋白C-E3-E2-6K-E1是主要抗原决定簇。因 此，结构糖蛋白是用于CHIKV感染的预防的亚单位疫苗的优秀的疫苗候 选者。结构蛋白的序列定义于SEQ ID NO.8到SEQ ID NO.14中。重组 非结构蛋白也是免疫原性的并是好的候选疫苗。选择的真核表达系统包括 哺乳动物细胞、昆虫细胞中的杆状病毒，和任何种的酵母细胞，最优选巴 斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）或酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。 编码亚单位抗原的基因也使用任何适合的原核表达载体在原核细胞例如 大肠杆菌（E.coli）中表达。作为重组表达宿主，巴斯德毕赤酵母在工业 规模是有优势的，因为与其它真核表达系统相比它对于大规模生产是有成 本效益的。来源于巴斯德毕赤酵母的重组蛋白已经被成功商业化并被发现 对人类使用安全。具有本申请中公开的序列的结构蛋白例如 C-E3-E2-6K-E1能够组装成为“病毒样粒子”（VLP）。可选地，VLP仅含 有E3-E2-6K-E1或E2-6K-E1或仅仅E2-E1蛋白，并且是有免疫原性的并 当在动物中施用时引起保护性免疫应答。包含E3-E2-6K-E1或E2-6K-E1 的亚单位抗原也能够组装成病毒体因为CHIKV是一种包膜病毒。包含 E3-E2-6K-E1或E2-6K-E1或仅仅E2-E1的病毒体也是免疫原性的。脂质 体和病毒体可包含脂溶性物质和病毒包膜蛋白的不同组合，脂溶性物质包 括但不限于胆钙化醇、胆固醇、磷脂等。对任何包膜病毒是适用的病毒体 制备的方法例如使用去污剂或短链磷脂溶解病毒粒子，并在去除离液剂和 非包膜蛋白和RNA后对包膜蛋白的重构，也适用于CHIKV。

通过物理或化学方法并优选两者组合来达到病毒的纯化。物理方法利 用病毒的物理特性例如密度、大小、质量、沉降系数等并包括任何以下技 术但不限于：超速离心、密度梯度离心、超滤等。通过化学方法纯化利用 方法例如通过化学或物理化学反应的吸附/解吸例如离子交换层析、亲和层 析、疏水作用层析、凝胶过滤层析、羟基磷灰石基质、用无机盐加盐 （salting），一个此类例子是硫酸铵，以及使用专有的Himax^TM技术，有机 盐和有机化合物例如聚乙二醇。通过上述方法的任何一个或两个或更多的 组合来达到对病毒或重组病毒抗原的纯化。

以上提到的CHIKV候选疫苗的抗原组合物，例如灭活全病毒粒子疫 苗或重组疫苗在药学可接受载体中配制用于在哺乳动物优选人类中免疫。 基孔肯亚病毒疫苗制剂是加佐剂的，佐剂选自以下列表，其包括但不限于： 明矾（Alum）；磷酸钙；任何多晶型形式的菊粉，优选γ菊粉；含有与其 它有机和无机化合物例如氢氧化铝、磷酸铝、硫酸铝磷酸盐和磷酸钙联合 的菊粉的佐剂；脂质体、壳聚糖和复杂碳水化合物例如葡聚糖、糊精、淀 粉、菊粉、甘露聚糖和葡甘露聚糖、半乳甘露聚糖、β-葡聚糖、肝素、纤 维素、果胶和果胶酸盐(pectinates)、凝集素和合成或来源于任何来源的任 何其它碳水化合物，任何可生物降解和生物相容的聚合物，例如聚丙交酯 和聚（丙交酯共聚乙交酯；PLG）或PLGA；任何乳剂包括但不限于水包 油乳剂，一个这样的例子是ASO3，其它基于角鲨烯的佐剂例如MF59等， 任何油包水乳剂；胆钙化醇作为成分之一和其它脂溶性化合物制备的脂质 体；其它组成的脂质体；RIBI佐剂系统，皂素包括但不限于QS-21、QuilA、 番茄苷、ISCOM、ISCOMATRIX等、脂肽、糖肽、脂多糖、胞壁酰二肽 和任何基于肽的佐剂，寡核苷酸，作为佐剂的TLR配体，任何细胞因子， 维生素和非毒性细菌毒素等。最相容和性能价格比高的佐剂在检测了免疫 原性后被选择在最终疫苗制剂中，其中免疫原性因佐剂的加入而加强。除 了上面说的以外，任何其它具有好的免疫增强活性的有机和无机物质也能 或者单独或者联合用作佐剂以增强基孔肯亚病毒疫苗的免疫原性。除了灭 活的全病毒粒子疫苗，以前提到的佐剂或佐剂组合对于使用重组亚单位抗 原的重组基孔肯亚病毒疫苗也是有效的，重组亚单位抗原或者当呈递为病 毒体、病毒样粒子（VLP），或者当表达、纯化和配制为单个重组蛋白时。 在疫苗制剂中使用适当的佐剂降低要求的抗原的量并帮助生产低成本疫 苗，从而带来经济优势。

制剂中使用的缓冲液是磷酸或磷酸-柠檬酸缓冲液或任何其它药学可 接受的缓冲液。疫苗任选地含有防腐剂、稳定剂等。赋形剂选自包括但不 限于以下的列表：还原和非还原糖、糖醇例如山梨醇和甘露醇、甘油、氨 基酸、人血清白蛋白、菊粉、硫柳汞，以及从前述佐剂列表中的佐剂的选 择。对于液体制剂，赋形剂以0.01%到20%的范围被添加，对于冻干制剂， 赋形剂可达总固体的60%。疫苗制剂也被呈递为乳剂，或者作为油包水乳 剂或者作为水包油乳剂。这样的疫苗抗原乳剂包含防腐剂和稳定剂和其它 佐剂。以液体或冻干形式的免疫原的这样的稳定制剂，在用药学可接受的 缓冲液或水重构后适合于在人类宿主中胃肠外施用，并且也被配制为粘膜 施用。疫苗制剂是高度免疫原性的并中和同源和异源性CHIKV株。

对于疫苗的效力检测，疫苗制剂在Balb/c小鼠和兔中检测。得到的血 清通过体外中和试验测定，并通过ELISA确定抗体滴度。在用本发明中描 述的疫苗制剂免疫的动物中观察到血清转换。重组疫苗在提供保护性免疫 应答上的效力与全病毒粒子疫苗是相当的，中和性抗体反应的滴度通过血 清中和试验（SNT），蚀斑减少中和试验（PRNT₅₀）和ELISA以及其它方 法确定。疫苗抗体的被动免疫提供了对病毒感染的好的保护，表明CHIKV 抗体的治疗用途。在感染患者样品中的病毒的存在使用CHIKV抗体被精 确测定。通过包括在本发明的范围内的方法获得的基孔肯亚病毒疫苗与其 它疫苗联合使用引起强中和抗体。能被包括在组合中的疫苗选自包括但不 限于以下疫苗的下列列表：日本脑炎病毒疫苗、登革热疫苗、西尼罗河病 毒疫苗和金迪普拉病毒疫苗和狂犬病疫苗。与其它病毒疫苗的组合也在本 发明的范围内。如本领域技术人员所知，二价或多价疫苗和通过混合从两 个或多个CHIKV株产生的疫苗来制备，基于抗原含量以适当比例被混合。 这样的混合为防止感染提供了具有广泛抗原谱的疫苗制备物。

根据本发明，本发明的CHIKV株的方法和组合物适用于任何CHIKV 株。本发明的疫苗提供了对于除了疫苗生产中使用的病毒株以外的多个 CHIKV株的好的免疫保护。研究中报告的CHIKV分离株具有广泛的中和 活性，因为它们交叉中和CHIKV的不同基因型/基因型变异体/株，对开发 灭活全病毒粒子疫苗或含有来源于这些病毒分离株的抗原的重组疫苗是 理想的疫苗候选者。本发明中公开的方法适用于基孔肯亚病毒的任何基因 型/基因型变异体/血清型/株，如所表明的对于病毒的多个基因型/基因型变 异体提供好的交叉保护。

本发明进一步描述在下列实施例中。应被注意的是，除非与其不相容， 否则连同发明的特定的方面、实施方案或实施例描述的特征、整数、特性、 范围、化合物和/或基团应被理解为适用于本文描述的任何其它方面、实施 方案或实施例，并应被考虑在本发明的范围内。

实施例1：病毒株的分离

病毒株从2009-2010年在印度的流行爆发中的获取知情同意的发热患 者中采集的血液样品中分离。血液样品采集于当患者报告高热、急性多发 性关节痛和关节疼痛性肿胀和皮疹时的基孔肯亚病毒感染的急性期。患者 的血清样品在干冰上被运送至实验室。大约0.05ml的血清被用于感染 25²cm烧瓶中含有1%胎牛血清（FBS）的含有DMEM（Dulbecco改良的 Eagle培养基，Sigma-Aldrich目录号D5523）的培养基中的Vero细胞 （ATCC No.CCL-81）。烧瓶在34℃至37℃温育。病毒在感染后48小时收 获。病毒的扩大培养在细胞架（cell stacks）或在细胞工厂（cell factories） 或在液体培养中的生物反应器中进行。通过特异性IgM ELISA（印度国立 病毒学研究所，Pune）所有血液样品对于登革感染是阴性的。在病毒粒子 在乳鼠大脑中被传代一次或在蚊细胞系例如C6/36细胞中传代后，以及还 有在病毒在体外细胞培养中重复传代后，病毒的感染滴度增加了超过10 倍。

实施例2：CHIKV病毒的纯化和灭活

通过初始超滤以去除细胞碎片，并通过经300kD膜过滤和浓缩并随后 通过离子交换和凝胶过滤柱层析纯化，从来自扩大培养物中的感染的Vero 细胞单层纯化了TN01610和TN15110两个病毒分离株。在从45℃到60℃ 的范围内在不同温度从30分钟到4小时并最佳地在56℃共30分钟进行了 病毒的热灭活。在254nm以不同长度的时间从30-120分钟并最佳地40分 钟在冰上进行了紫外（UV）光灭活。基孔肯亚病毒被福尔马林在达到福尔 马林：病毒1:3000比率下在2℃-8℃长达7天有效灭活，被β-丙内酯在 1:1000到1:2500（β-丙内酯：病毒）长达7天在2℃-8℃下有效灭活。在两 种情况下，当在室温+20-25℃下进行时灭活时间被降至24-48小时。通过 透析移除福尔马林和β-丙内酯。在灭活中，添加剂例如甘氨酸、甘露醇、 山梨醇和糖以及糖的组合的使用增加了疫苗制备物的稳定性。使用的糖可 选自从0.5%到5%的不同浓度的蔗糖、乳糖、海藻糖、麦芽糖。通过伽马 辐照灭活病毒通过暴露病毒样品于来自⁶⁰Co源(Ms.Gamma Agro-Medical  Processings Pvt.Ltd.Hyderabad)的10kGy(Kilo Grea)到25kGy最佳20kGy的 剂量来进行。通过所有以上方法进行的病毒样品的完全灭活通过在Vero 细胞中三次连续传代不存在病毒细胞病变效应，和另外当通过脑内途径在 2日龄小鼠脑中接种时无生长异常和死亡来确认。灭活病毒抗原作为候选 疫苗被检测效力。

实施例3：反转录酶-聚合酶链式反应（RT-PCR）和测序

在单次传代后，从感染的Vero细胞（ATCC CCL-81）中，使用Absolutely  RNA Miniprep试剂盒(Stratagene,La Jolla,CA)分离了病毒RNA。根据试剂 盒方案，使用AccuScript高保真第一链cDNA合成试剂盒（Stratagene）进 行了RT-PCR，使用PfuUltra高保真DNA聚合酶（Stratagene）扩增了3,747bp 结构多蛋白基因。基于S27-非洲原型（AF369024）和印度2006分离株 （HM159384）的共有序列设计了PCR引物，并用该引物扩增结构多蛋白 基因的重叠序列。PCR反应由以下组成：在95℃进行1分钟的初始变性， 随后进行在94℃持续40秒，在52-65℃（依赖于引物对）退火30秒，在 70℃延伸3分钟的32个热循环步骤，随后是在70℃最后延伸10分钟。在 1%琼脂糖凝胶上分离后，PCR产物用QIA快速凝胶提取试剂盒（QIAGEN， Hilden，德国）纯化并用于DNA测序。通过BigDye终止子v3.1反应 (Applied Biosystems,Foster City,CA)在DNA的两条链上对CHIKV结构多 蛋白基因凝胶纯化的PCR产物的核苷酸序列进行了测序，使用Sequencher  v4.7(GeneCodes,Ann Arbor,MI)分析了序列数据。在提交临时专利申请前 在2010年4月27日将序列存入GenBank,并在2012年3月2日被GenBank 公布。本发明中报告的独特核苷酸序列是SEQ ID NO.1(分离株 TN01610)、SEQ ID NO.2(分离株TN15110)、SEQ ID NO.3(分离株 TN06210)、SEQ ID NO.4(TN06310)、SEQ ID NO.5(TN06410)和SEQ ID  NO.6(AP0109)，当翻译后其对应的蛋白质序列分别是SEQ ID NO.8、SEQ  ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12和SEQ ID NO.13。 CHIKV株CHIKV/03/06具有序列SEQ ID NO.7的结构多蛋白基因并在 2006年印度流行期间被分离，对应的蛋白序列是SEQ ID NO.14。括号中 提供了病毒分离株的名称。对于完全的基因组RNA序列，使用合成测序 （SBS）技术在Illumina GAIIx(Genotypic Technology Pvt.Ltd.Bangalore) 上进行了测序反应。以上提到的病毒株的病毒基因组RNA的完全核苷酸 序列（以cDNA的形式）被提供于SEQ ID NO.15到SEQ ID NO.20。根据 株S27-非洲原型（AF369024）确认的突变被定位于单个的结构蛋白并展示 于表1。

表1.本研究中报告的基孔肯亚病毒结构基因中的独特突变。

在来自Tamil Nadu和Andhra Pradesh州的2009-2010CHIKV分离株的衣 壳、E1、E2和E3结构糖蛋白中确认的独特突变。

“.”与参考株S27-非洲原型（AF369024）相同的氨基酸。来自Tamil Nadu 的分离株的GenBank登录号是HM159385(TN01610)、HM159386 (TN15110)、HM159387(TN06210)、HM159388(TN06310)、HM159389 (TN06410)，来自Hyderabad,Andhra Pradesh的是HM159384(CHIKV/03/06) 和HM159390(AP0109)。

实施例4：选择压力的系统发育分析和推测

在系统发育分析前，对本研究中报告的序列和从GenBank中检索的序 列通过遗传算法重组检测(GARD)(Kosakovsky Pond等人2006)进行了重组 筛选。使用Kimura-2核苷酸替换参数模型以1000引导程序（bootstrap） 重复在MEGA5(Tamura等人2007)进行了进化分析。使用ClustalW2.0.3 进行了多序列比对。在推测ECSA谱系的选择压力中使用了从GenBank中 检索的从2005-2010的ECSA结构多蛋白序列和本研究中报告的序列。从 GenBank中检索的58个序列中通过Hyphy(Pond等人2005)初选了大约52 个独特序列用于分析。通过随机效应似然（REL）、固定效应似然（eFEL） 推测了ω的基于密码子的最大似然估计或dN/dS（非同义和同义置换的比 例），使用HyPhy中的内部固定效应似然（iFEL）方法检验了沿着系统发 育的内部分支的选择。在似然方法中，如果一个位点的似然比检验（LRT） 的p值小于0.05或者当贝叶斯（Bayes）因子等于或大于100，正选择被推 测为显著的。通过HyPhy中的单个似然祖先计数（SLAC）方法推测了作 用于整个蛋白的正选择的统计检验。使用Selecton v2.2(Stern等人2007) 进行了使用LRT（似然比检验）通过经验贝叶斯方法对ω的推测，MEC （机械经验组合）模式用于正选择，M8a模式用于纯化和中性选择。伴随 的表II中提供了在显著正选择和纯化选择下CHIKV结构蛋白的氨基酸位 点。

表II.在显著正选择和纯化选择下CHIKV结构蛋白的氨基酸位点

使用HyPhy包通过随机效应似然（REL）和通过内部固定效应似然 （iFEL）方法推测了2009-2010印度CHIKV分离株中的衣壳（C）和E1、 E2和E3糖蛋白中正选择下的氨基酸。E1和E2蛋白中的显著正选择和纯 化选择下的氨基酸位点分别（贝叶斯因子>500，后验概率≥0.97以及p<0.05） 用加粗标示。贝叶斯因子是该位点对于正选择（dN>dS）的后验概率/事 前概率的统计估计。

实施例5：结构多蛋白序列的克隆和表达

本专利中报告的病毒分离株被用作克隆和表达所有病毒抗原的来源。 SEQ ID NO.1编码的基孔肯亚病毒结构多蛋白的完全开放阅读框通过病毒 基因组RNA的使用引物CHKVCPFP作为正向引物和CHKVE1RP作为反 向引物的RT-PCR进行扩增以获得～3747bp的PCR片段。用于PCR扩增 的PCR引物的序列是：

CHKVCPFP:

5’ACAGAATTCATATGGAGTTCATCCCAACCCAAAC3’

CHKVE1RP:

5’AATTGGATCCGCGGCCGCTTAGTGCCTGCTGAACGACACGC3’

PCR片段用Nde1和BamH1进行消化并克隆入原核表达载体pET-11B的Nde1 和BamH1位点，含有插入片段的重组质粒在大肠杆菌DH5a中被转化。从 DH5a分离的重组质粒DNA被用来转化大肠杆菌株BL21（DE3）。PCR基因 片段用EcoR1和Not1进行消化，通过标准方案进行凝胶纯化并克隆入酵母 表达载体pPIC3.5K(Invitrogen公司,Carlsbad,USA)的EcoR1和Not1位点 并在大肠杆菌DH5a中被转化。从大肠杆菌克隆中分离的重组质粒DNA使 用BglII进行线性化，并根据生产商的方案转化入巴斯德毕赤酵母GS115 (Invitrogen)。基因已经被克隆入AOX1基因座并通过甲醇诱导在AOX1启动 子下表达。重组毕赤酵母株的克隆、筛选、分离和使用甲醇对克隆基因的 诱导根据毕赤酵母表达试剂盒，目录号K1710-01,Invitrogen公司,Carlsbad, USA)的用户手册“在巴斯德毕赤酵母中表达重组蛋白的方法手册”版本M 2002年1月来进行。

实施例6：疫苗制剂的体内效力试验：

使用不同的佐剂检测了疫苗制剂中的灭活病毒样品的效力。检测的佐 剂（在每个单个人类剂量的浓度下）包括a)氢氧化铝（0.5mg铝含量）b) 磷酸铝（0.5mg铝含量）c)γ菊粉（10mg），d）algammulin（氢氧化铝和γ 菊粉的组合）10mg，e)油包胆钙化醇，每剂量0.75mg，f）水包油乳剂 OWEM1，在10mM磷酸-柠檬酸缓冲液中含有4.3%角鲨烯、0.5%吐温-80 和0.5%Span-85(Sigma Aldrich产品号S7135)，f）水包油乳剂OWEM2， 在磷酸-柠檬酸缓冲液中含有9.5mg角鲨烯、1mg吐温-80、1mg Span-85、 11mgα生育酚，g）水包油乳剂OWEM3，含有与OWEM2中同样浓度的 赋形剂，除了α生育酚被1-10mg胆钙化醇代替。配制和加佐剂的疫苗制 备物被肌肉内注射入小鼠，在首次剂量施用后第7天和第21天施用加强 剂量。在首次剂量施用后28天采集血液。从每个试验组的混合血清在56℃ 下约30分钟灭活补体。所有制剂含有在含150mM NaCl的pH6.8-7.2的 40mM磷酸缓冲液中的15μg病毒抗原。血清样品被用来估计中和抗体和通 过ELISA估计抗体滴度。当在静脉内/腹膜内施用攻击病毒后72小时期间 监测时，免疫动物对病毒攻击剂量为10^4.5pfu/ml的病毒血症给予完全保护。 在另一个实验中，在4-6周龄Balb/c小鼠中静脉施用PRNT₅₀滴度为640 的兔抗血清的被动免疫对用10^4.5pfu/ml的攻击病毒攻击时的病毒血症给予 完全保护。对于血清型分析，抗CHIKV/03/06的抗血清中和了亚洲基因型 （GenBank登录号EF027140，1963年分离于Kolkata）、ECSA(E1-A226V, E1-211K，GenBank登录号FJ000069,2007年分离于Kerala)和 ECSA(E1-226A,E1-K211E,GenBank登录号HM159386,2010年获得自 Tamil Nadu)的异型病毒分离株，中和抗体滴度≥40，表明对基因型变异体 的异型保护，也表明未进化出不同的血清型。

实施例7：空斑降低中和测定

在测定前一天，用每孔2.5x10³Vero细胞（ATCC CCL-81）接种6- 孔板，板在5%CO₂培养箱中在37℃温育。向含有2%胎牛血清的MEM中 的血清样品的4倍稀释物中，加入等体积的标准化病毒（10⁵pfu/ml）并在 5%CO₂中在37℃温育90分钟。细胞用1x PBS pH7.4(10mM磷酸和150 mM NaCl)洗涤两次，血清-病毒混合物的0.3ml每个稀释物被加至对应的 孔并在5%CO₂培养箱中在37℃温育90分钟。每个测定一式三份进行。细 胞用2ml含有10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素和1%L-谷氨酰胺的MEM 中的0.85%甲基纤维素覆盖。板在5%CO₂培养箱中在37℃温育5天。在 温育结束时，用10%福尔马林固定空斑，用1x PBS pH7.4洗涤，用0.1% 结晶紫使之可见。引起由对照病毒样品形成的空斑的50%降低的血清最高 稀释度被估计为PRNT₅₀滴度。进行PRNT₅₀测定以检测通过各种灭活方法 的疫苗制备物，以及佐剂化的CHIKV疫苗和与JEV疫苗的疫苗组合的效 力。

实施例8：疫苗组合

检测了由β-丙内酯灭活的CHIKV疫苗与福尔马林灭活的日本脑炎病 毒（JEV）疫苗的组合。检测了在明矾（0.5mg铝/剂量）中配制的15μg CHIKV 疫苗抗原与含有也在明矾中配制的6μg日本脑炎病毒全病毒粒子抗原的灭 活JE（JEV）病毒疫苗的组合。疫苗组合被注射入具有适当对照的8只Balb/c 小鼠中，对照包括单独的任一种抗原，也有接受等量明矾的对照动物。在 首次免疫后7天和21天加强免疫动物。在最后一次加强注射后7天采集 血液。从每组的混合血清在56℃下约30分钟灭活补体。对于CHIKV和 JEV，血清样品被用来通过PRNT₅₀估计中和抗体。在所有制剂中使用的缓 冲液为含有150mM NaCl的pH6.8-7.2的40mM磷酸缓冲液。以上公开的 所有方法适用于基孔肯亚病毒的任何基因型/基因型变异体/血清型和毒 株。

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