一种在弱酸性范围有线性响应的罗丹明基pH值荧光探针及其制备方法

摘要

本发明公开一种在弱酸性范围有线性响应的罗丹明基pH值荧光探针及其制备方法，该种荧光探针具有下列结构通式：

说明书

技术领域

本发明涉及一种在弱酸性范围有线性响应的罗丹明基pH值荧光探针，特别涉及一种在弱酸性范围有线性响应的罗丹明基pH值荧光探针及其制备方法。

背景技术

pH 值是生理学、药物学、病理学等研究中的重要参数。人体细胞内的pH在许多生理、病理过程中起着重要的作用(Nature Rev. Mol. Cell. Biol., 2010, 11(1), 50-61)。酸性或碱性过强会引起细胞功能紊乱，导致心、肺病变或神经类疾病，严重时甚至会有生命危险。因此监测细胞内pH值的变化可以为研究生理和病理过程提供重要信息。测定pH 值一般用玻璃电极，但由于存在电化学干扰、可能的机械损伤等缺陷而不适于活体细胞的 pH 监测（Cell Mol. Biol., 2000, 46(8), 1361-1374）。荧光探针检测细胞pH值属于非侵入性方法，不会破坏样品，同时具有灵敏度高、选择性好，仪器设计灵活，试样量少，操作简单，适用于高通量筛选等特点，是检测细胞pH值的理想方法（Trends in Analytical Chemistry, 2010, 29(9), 1004-1013）。

一般情况下正常的细胞内存在两个主要的pH值范围：细胞质主要处于 6.8-7.4之间，酸性细胞器的pH值为4.5-6.0。针对这两个范围的pH值探针已经有大量文献报道，并已分别用于细胞质pH值的定性研究和酸性细胞器的检测（高等学校化学学报, 2010, 13(6), 1148-1151）。但是对于癌症细胞而言，由于通过糖酵解途径的厌氧代谢异常导致其细胞的pH值比正常细胞平均低0.55个单位，其pH值大概处于5.8-7.7的范围（Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 22 (2012) 2440-2443）。以此异常pH值为靶标的核磁、电化学癌症诊断方法已有文献报道。由于目前在此区间有线性响应的pH值荧光探针较少，所以基于pH值荧光探针的癌症诊断方法鲜见文献报道。因此开发一种在弱酸性范围（pH=5.0-7.0）有线性响应的pH值荧光探针对于癌症研究和癌症诊断具有重要的意义。此外，目前已开发出的pH值荧光探针大多数存在灵敏度较差，线性范围较窄等缺点。因此开发一种在弱酸性范围（pH=5.0-7.0）有线性响应的pH值荧光探针仍然是该领域的研究热点。

罗丹明是含有氧杂蒽结构的染料，具有很高的吸光系数、较长的激发和发射波长、较高的荧光量子产率和良好的光稳定性等优点，作为荧光探针的母体已大量的用于构建pH值荧光探针（Chem. Rev., 2012, 112, 1910-1956）。一般认为当罗丹明基pH值探针的内酰胺结构处于五元螺环状态时，摩尔吸光系数和荧光量子产率非常低，几乎没有荧光，当罗丹明内酰胺的羰基质子化时，可导致探针的五元螺环中的碳氮键断裂，形成开环结构，荧光强度显著增强，从而实现对pH值的选择性响应（Org. Biomol. Chem. , 2014, 12, 526-533）。林伟英等对该识别机理进行研究发现，通过调节罗丹明五元螺环的环张力可以调控罗丹明探针的响应区间（Org. Biomol. Chem., 2011, 9, 1723-1726）。本发明根据这一原理采用大位阻的基团调节罗丹明pH值探针的响应区间，构建了一种在弱酸性范围（pH=5.0-7.0）有线性响应的罗丹明基pH值荧光探针。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种在弱酸性范围有线性响应的罗丹明基pH值荧光探针及其制备方法，该方法制备的荧光探针通过氢离子的络合诱导使罗丹明发生螺环的开环，使得探针分子发生颜色变化（无色到深玫瑰色）和荧光信号的增强，其识别前后的颜色变化可以通过裸眼观察。该探针对氢离子具有高度选择性，其他常见离子均无明显干扰，探针的荧光信号可在pH=5.0-7.0的范围内产生线性响应，具有在生物细胞中检测pH值的应用前景。

本发明的目的之一是提供一种在弱酸性范围有线性响应的罗丹明基pH值荧光探针，其结构式如下：

其中：R₁、R₂、R₃、R₄可以同时氢，或者R₁、R₂、R₃或R₄选自氢、2-6个碳原子烷基或4-8个碳原子环烷基中的一种。

本发明的目的之二是提供一种在弱酸性范围有线性响应的罗丹明基pH值荧光探针的制备方法。该方法包括以下步骤：

（1）按罗丹明类染料与三氯氧磷摩尔比为1：2-5称取罗丹明类染料溶于干燥的有机溶剂中，再缓慢加入配比量的三氯氧磷，升温至回流反应，反应结束后降至室温而形成反应液；

（2）按2,6-二异丙基苯胺与缚酸剂摩尔比为1：10-30称取2,6-二异丙基苯胺、缚酸剂溶于干燥的有机溶剂中而制得溶液，将此溶液逐滴加入步骤（1）所形成的反应液中，升温至回流反应，反应结束后用NaHCO₃溶液洗涤，收集有机层，无水硫酸镁干燥，抽滤，减压蒸除溶剂，柱层析分离得目标化合物。

所述步骤中有机溶剂可以是本领域常规的，优选至少有一种选自1,2-二氯乙烷、乙腈、二氯甲烷、二甲基亚砜、氯仿、N,N-二甲基甲酰胺或四氢呋喃。

所述步骤（2）中缚酸剂采用本领域常规的，缚酸剂优选吡啶或三乙胺。

所述步骤（2）中柱层析所用填料可以是本领域常规的，优选为氧化铝，洗脱剂可以是本领域常规的，优选体积比为20:1的二氯甲烷和乙醇。

具体地说，本发明所述的在弱酸性范围有线性响应的罗丹明基pH值荧光探针的制备方法，包括以下步骤：

1.将1摩尔罗丹明类染料溶于干燥的有机溶剂中，再缓慢加入2-5摩尔三氯氧磷，升温至回流。搅拌反应4-6h后降至室温。

2.将1摩尔2,6-二异丙基苯胺、10-30摩尔缚酸剂溶于干燥的有机溶剂中，将此溶液逐滴加入上述反应体系中，升温至回流，反应3-7h。反应结束后用0.1M NaHCO₃溶液洗涤，收集有机层，无水硫酸镁干燥。抽滤，减压蒸除溶剂，柱层析分离得目标化合物。

所述步骤中有机溶剂为1,2-二氯乙烷、乙腈、二氯甲烷、二甲基亚砜、氯仿、N,N-二甲基甲酰胺、四氢呋喃，或者它们的混合物。

所述步骤2中缚酸剂为吡啶或三乙胺。

所述步骤2中柱层析所用填料为氧化铝，洗脱剂为体积比为20:1的二氯甲烷和乙醇。

本发明在弱酸性范围有线性响应的罗丹明基pH值荧光探针的合成反应式为：

本发明所述的pH值荧光探针在中性、碱性体系中，540-660nm处没有发射峰，说明该探针在此pH范围内处于五元螺环状态。随着pH值的降低，探针在595nm处出现发射峰且荧光强度逐渐加强。紫外吸收光谱变化趋势与荧光光谱一致，溶液由无色变为深玫瑰色，表明在裸眼条件下可以观察到探针对pH值的响应。探针在pH为5.0-7.0区间有良好的线性。探针在pH=5.13时的荧光量子产率可达到0.599。根据Henderson-Hasselbach type方程： (log[(I_max - I)/(I-I_min)]= pKa- pH，计算出探针的pKa为5.826。此探针有望用于生物细胞的pH值检测，尤其是癌症的研究和诊断。

本发明的有益效果是：本发明所述的pH值荧光探针的荧光响应在pH=5.0-7.0区间有良好的线性，这个线性范围可以满足对大多数生物细胞及其细胞器pH值检测的要求。该探针溶液随着pH值的减小颜色由无色变为深玫瑰色，可用于裸眼检测。该探针能选择性识别氢离子，并且不受其它常见阳离子的干扰。该探针灵敏度好，在pH=5.13时的荧光量子产率可达到0.599。该探针有望用于生物细胞的pH值检测，尤其是癌症的研究和诊断。

附图说明

图1为本发明实施例1中荧光探针在不同pH条件下的荧光发射光谱图。探针浓度为50μM，横坐标为波长（nm），纵坐标为荧光强度，激发波长为520nm。

图2为本发明实施例1中荧光探针在595nm处的荧光强度随pH值变化曲线图。（右上角小图：在595nm处的荧光强度与pH值的线性关系图）。探针浓度为50μM，横坐标为波长（nm），纵坐标为荧光强度，激发波长为520nm。

图3为本发明实施例1中荧光探针在不同pH缓冲溶液中的颜色变化图。pH值从左到右依次为2.0、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.2、5.5、5.8、6.0、6.5、7.0、8.0、9.0。

图4为本发明实施例1中荧光探针在pH=2.95时的荧光发射光谱以及在pH=7.4的缓冲溶液中与不同金属离子(10mM)共存时的荧光发射光谱图。探针浓度为50μM，离子浓度为10mM，横坐标为波长（nm），纵坐标为荧光强度，激发波长为520nm。

图5为本发明实施例1中荧光探针在pH=3.0的缓冲溶液中与不同金属离子(10mM)共存时的荧光发射光谱图。探针浓度为50μM，离子浓度为10mM，横坐标为波长（nm），纵坐标为荧光强度，激发波长为520nm，（因为有图，请写个实施例）。

具体实施方式

实施例1

（1）将0.2395g（0.5mmol）罗丹明B溶于15mL干燥的1,2-二氯乙烷，缓慢加入0.15mL（1.6mmol）POCl₃，升温到83℃，回流反应5h，降温至室温。

（2）将0.1314g（0.6mmol）2,6-二异丙基苯胺、2mL（14.3mmol）三乙胺溶于10mL1,2-二氯乙烷中，将此溶液逐滴加入上述步骤（1）反应体系中，升温到83℃，回流反应5h。反应结束后用0.1M NaHCO₃溶液（3×20mL）洗涤，收集有机层，无水硫酸镁干燥。抽滤，减压蒸除溶剂，以中性氧化铝为填料进行柱层析（V_二氯甲烷:V_甲醇=20:1）得目标化合物0.25g，收率83.17%。m.p：305℃。¹HNMR (400 MHz, CDCl₃) δ（ppm）=8.08 (dd, J=6.8, 1.5 Hz, 1H), 7.70-7.60 (m, 2H), 7.36-7.27 (m, 2H), 7.00 (d, J=7.7 Hz, 2H), 6.57 (d, J=8.8 Hz, 2H), 6.31 (dd, J=8.9, 2.6 Hz, 2H), 6.22 (d, J=2.6 Hz, 2H), 3.31 (q, J=7.0 Hz, 8H), 2.43 (dt, J=13.4, 6.7 Hz, 2H), 1.13 (t, J=7.0 Hz, 12H), 0.92 (d, J=6.7 Hz, 6H), 0.47 (t, J=8.4 Hz, 6H)；¹³CNMR (100 MHz, CDCl₃) δ（ppm）=167.35 (s), 156.57 (s), 149.71 (s), 149.48 (s), 148.72 (s), 133.18 (s), 131.99 (s), 130.36 (s), 129.56 (s), 128.85 (s), 128.49 (s), 125.07 (s), 123.71 (s), 123.15 (s), 108.94 (s), 107.60 (s), 98.48 (s), 77.34 (s), 76.91 (d, J=23.1 Hz), 76.71 (s), 69.94 (s), 44.44 (s), 29.67 (s), 26.71 (s), 21.88 (s), 12.62 (s)；HRMS：anal. calcd for C₄₀H₄₇N₃O₂：601.82；found：602.3762 (M+H⁺)；IR(KBr，cm^-1)：2961.46，2926.15，2862.00，1687.00，1615.05，1515.56，1465.77，1353.88，1266.48，1220.38，1118.04，1014.60，785.91，761.03，702.14，543.67.

实施例2

（1）将0.1684g（0.5mmol）罗丹明110溶于15mL干燥的1,2-二氯乙烷，缓慢加入0.15mL（1.6mmol）POCl₃，升温到83℃，回流反应5h，降温至室温。

（2）将0.1314g（0.6mmol）2,6-二异丙基苯胺、2mL（14.3mmol）三乙胺溶于10mL1,2-二氯乙烷中，将此溶液逐滴加入上述步骤（1）反应体系中，升温到83℃，回流反应5h。反应结束后用0.1M NaHCO₃溶液（3×20mL）洗涤，收集有机层，无水硫酸镁干燥。抽滤，减压蒸除溶剂，以中性氧化铝为填料进行柱层析（V_二氯甲烷:V_甲醇=20:1）得目标化合物0.17g。

实施例3

（1）将0.2395g（0.5mmol）罗丹明B溶于15mL干燥的1,2-二氯乙烷，缓慢加入0.15mL（1.6mmol）POCl₃，升温到83℃，回流反应5h，降温至室温。

（2）将0.1314g（0.6mmol）2,6-二异丙基苯胺、1.15mL（14.3mmol）吡啶溶于10mL1,2-二氯乙烷中，将此溶液逐滴加入上述步骤（1）反应体系中，升温到83℃，回流反应5h。反应结束后用0.1M NaHCO₃溶液（3×20mL）洗涤，收集有机层，无水硫酸镁干燥。抽滤，减压蒸除溶剂，以中性氧化铝为填料进行柱层析（V_二氯甲烷:V_甲醇=20:1）得目标化合物0.23g。

实施例4

（1）将0.1684g（0.5mmol）罗丹明110溶于15mL干燥的乙腈，缓慢加入0.15mL（1.6mmol）POCl₃，升温到80℃，回流反应5h，降温至室温。

（2）将0.1314g（0.6mmol）2,6-二异丙基苯胺、2mL（14.3mmol）三乙胺溶于10mL乙腈中，将此溶液逐滴加入上述步骤（1）反应体系中，升温到80℃，回流反应5h。反应结束后用0.1M NaHCO₃溶液（3×20mL）洗涤，收集有机层，无水硫酸镁干燥。抽滤，减压蒸除溶剂，以中性氧化铝为填料进行柱层析（V_二氯甲烷:V_甲醇=20:1）得目标化合物0.16g。

实施例5

以本发明实施例1中荧光探针在不同pH条件下测试荧光发射光谱随pH值的变化情况。图1是处于不同pH值的浓度为50μM的实施例1制得的荧光探针的乙醇/水(v/v, 1:1, pH=7.0)溶液的荧光光谱图。荧光激发波长为520nm。从图中可以看到，在中性、碱性溶液范围，该探针在540-700nm处没有发射峰，说明该探针在此pH范围内处于螺环结构。随着pH值的降低，探针在595nm处出现发射峰且荧光强度逐渐加强，但是当pH值小于5.13后，荧光强度又有所下降。以罗丹明B为基准（Φ=0.89），根据图中数据计算，pH=5.13时该探针的荧光量子产率为0.599。

实施例6

以本发明实施例1中荧光探针在不同pH条件下测试荧光发射强度与pH值的线性关系。图2是处于不同pH值的浓度为50μM的实施例1制得的荧光探针的乙醇/水(v/v, 1:1, pH=7.0)溶液在595nm处的荧光强度随pH值变化曲线图。荧光激发波长为520nm。从图中可以看到，在pH为5.0-7.0区间有良好的线性关系。根据图中数据，按照Henderson-Hasselbach type方程 (log[(I_max - I)/(I-I_min)]= pKa- pH，计算出该探针的pKa为5.826。

实施例7

以本发明实施例1中荧光探针在不同pH缓冲液中进行显色实验。图3为浓度为50μM的实施例1制得的荧光探针的不同pH值缓冲溶液，pH值从左到右依次为2.0、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.2、5.5、5.8、6.0、6.5、7.0、8.0、9.0，放置20分钟后的照片。从图中可以看出，该探针随着pH值的减小，探针溶液逐渐而由无色变为深玫瑰色。表明探针可以在裸眼条件下指示被测体系的酸性变化。

实施例8

以本发明实施例1制得的荧光探针进行对氢离子的选择性实验。图4是浓度为50μM的本发明实施例1中荧光探针在pH=2.95时，以及在pH=7.4的缓冲溶液中与不同金属离子(10mM)共存时的荧光发射光谱图。荧光激发波长为520nm。从图中可以看到，向实施例1制得的荧光探针溶液中加入10mM的K⁺、Na⁺、Ca²⁺、Mg²⁺、Al³⁺、Fe³⁺、Cu²⁺、Ni²⁺、Co²⁺、Mn²⁺、Sn²⁺、Zn²⁺等金属离子时，荧光光谱在550-750nm之间无发射峰。但在pH=2.95时，该探针的荧光光谱在595nm处荧光强度明显增强，出现一个新的发射峰。这说明该探针对氢离子具有良好的选择性。

实施例9

以本发明实施例1制得的荧光探针进行抗干扰实验。图5为本发明实施例1中荧光探针在pH=3.0的缓冲溶液中与K⁺、Na⁺、Ca²⁺、Mg²⁺、Al³⁺、Fe³⁺、Cu²⁺、Ni²⁺、Co²⁺、Mn²⁺、Sn²⁺、Zn²⁺不同金属离子(10mM)共存时的荧光发射光谱图。实验的探针浓度为50μM，激发波长为520nm。从图中可以看到，各种常见金属离子K⁺、Na⁺、Ca²⁺、Mg²⁺、Al³⁺、Fe³⁺、Cu²⁺、Ni²⁺、Co²⁺、Mn²⁺、Sn²⁺、Zn²⁺的存在对该探针的pH响应的干扰很小或几乎没有干扰。说明探针对常见的金属离子具有良好的抗干扰性。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。