六堡茶加工过程中真菌菌群的检测方法

摘要

本发明公开了一种六堡茶加工过程中真菌菌群的检测方法，直接从加工过程中的六堡茶中提取真菌总DNA，然后采用PCR-DGGE技术检测其中的真菌菌群组成。本发明避免了传统培养不能分离鉴定六堡茶中未培养真菌微生物的缺陷，能在较短的时间内得出实验结果，大大减少工作量和工作时间，实验结果真实可信。该法适应于六堡茶及六堡茶加工过程中的茶叶样品，检测的真菌菌群能全面包括六堡茶中的真菌种类，能客观有效地反映茶加工过程中六堡茶真菌菌群动态变化，为有效揭示六堡茶发酵过程中微生物的作用机制和改进六堡茶生产工艺奠定了科学基础。

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，尤其涉及一种六堡茶加工过程中真菌菌群的检测方 法。

背景技术

黑茶生产过程中存在大量微生物，不同黑茶加工中微生物种类不同，可以说是一个以 茶叶为基质的相当复杂的微生态系统。在这个系统中，细菌、真菌、放线菌都是互相依存 或相互拮抗的，而且随着发酵推移，各类微生物也在发生极大的变化，期间产生大量内含 物质，如可溶性多糖、多酚、蛋白酶等。因此，研究黑茶加工中的微生态系统中的微生物 群落结构和多样性，对黑茶的形成、品质的保持和提高具有重要意义。

聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳（PCR-DGGE）技术是直接从环境样品中提取微生 物的DNA进行检测，通过扩增序列、测序和基因库比对，快速确定微生物的种属，其指纹 图谱每个条带代表某个微生物菌群。PCR-DGGE技术灵敏度高，可以检测出环境中含量很 少的微生物（能检测出数量仅占总群落数1～3%的微生物），检测结果更加全面和准确，省 去了分离培养过程，检测时间和工作量大大减少。目前，应用PCR-DGGE技术研究微生物 种群及群落结构主要集中在环境微生态，城市污水和农田土壤等。近年，黑茶微生态研究 逐渐成为热点，相关报道仅仅少量集中在普洱茶，Michiharu等(MICHIHARU A，NAOHIRO T， YOSHITO I，et al.Characteristic fungi observed in the fermentation process for  Puer tea[J].International Journalof Food Microbiology，2008，124：199-203)应用 PCR-DGGE技术发现普洱茶中存在2种优势种群；国内的华南理工大学和云南天士力帝泊洱 生物茶集团有限公司也做了一些研究并申请了相关专利（专利申请号201010622765.0， 201010622769.9，201310020829.3）。

黑茶发酵过程中微生物种类复杂，贯穿整个发酵流程，不同工艺时期、不同种类黑茶 品质形成过程中的微生物种类及其优势种群存在差异，这就决定了不同环境下的茶叶样品 在进行微生物群落构成分析时存在差异。

六堡茶（Liu Pao Tea）是广西梧州特有的历史名茶，是以梧州原产地的中小叶茶树 为原料，采摘一芽二三叶，经摊青、杀青、揉捻、沤堆、干燥制成。根据广西壮族自治区 地方标准“六堡茶”中的定义，六堡茶是在适宜加工的特定区域内，选用适制茶树(Camellia  sinensis L.O.Kunts)的芽叶和嫩茎为原料，采用六堡茶初制工艺和六堡茶精制工艺加工 制成，具有“六堡香”及红、浓、陈、醇等品质特征的黑茶。2011年3月16日，六堡茶 被国家质量监督检验检疫总局批准为地理保护产品。目前针对六堡茶微生物群落结构的检 测与分析方法还是空白。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种快速、灵敏、高效的六堡茶加工过程中真菌菌群 的检测方法。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：六堡茶加工过程中真菌菌群的检测 方法，直接从加工过程中的六堡茶中提取真菌总DNA，然后采用PCR-DGGE技术检测其中的 真菌菌群组成。

上述六堡茶加工过程中真菌菌群的检测方法，包括以下步骤：

<1>取不同发酵过程中的六堡茶样品

<2>收集茶样品的微生物菌体

<3>提取真菌总DNA

<4>真菌18S rRNA的PCR扩增

以待测样品的真菌总DNA为模板，使用带GC夹子的通用引物进行PCR扩增，扩增结 束后，对目的片段进行回收及纯化；

<5>DGGE电泳分析

纯化的PCR产物通过DGGE进行分离，染色后得到DGGE指纹图谱，通过指纹图谱分析 真菌菌群构成及菌群相对数量；

<6>DGGE条带回收及序列分析

从凝胶中回收条带，并以此为模板，使用不带GC夹子的同一通用引物进行PCR扩增， 扩增结束后，对目的片段进行回收、纯化及测序；测序结果和NCBI数据库中的序列进行 比对分析，确定六堡茶的真菌菌群结构。

步骤<1>按以下操作进行：抽取大生产的茶堆的上层、中层和下层的茶叶，然后于无 菌室内将其混匀，制成包含上、中、下层茶叶的混样。

步骤<2>按以下操作进行：采用玻璃珠震荡法，先称量50g混匀的茶叶于500mL的 锥形瓶里面，加少量灭菌过的玻璃珠，再添加0.85％磷酸盐缓冲液450mL，200rpm震荡 15min，然后用双层纱布过滤掉茶叶，滤液使用500mL的离心瓶收集，10000rpm离心 10min，收集沉淀。

步骤<3>按以下操作进行：采用液氮研磨裂解菌体，将沉淀从离心瓶转移至灭菌的研 钵，倒进适量的液氮，用力研磨，反复直至粉末状，转移粉末至50mL离心管，加入15mL 的总DNA提取液，同时加入7.5mL的氯仿、7.5mL的Tris-平衡酚，轻轻上下颠倒混匀， 10000rpm离心10min；取上清转移至另一离心管中，加入等量的氯仿，上下颠倒混匀后， 10000rpm离心10min；取上清，加入等量的异丙醇沉淀，13000rpm，离心15min；收 集的DNA用75％酒精洗涤2遍，加入约0.3mL的ddH₂O溶解，置-20℃保存。

步骤<4>按以下操作进行：

引物为对大多数真菌18S rRNA基因5′末端具有特异性的带GC发夹的通用引物，引 物序列NL1（F）为5’-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3’，引物序列NL1（F）-GC为 5’-CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGGCCCGCCGCCCCCGCCCCGCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3’，引物序 列LS2（R）为5’-ATTCCCAAACAACTCGACTC-3’；

PCR扩增程序为95℃预变性5min，94℃ 50sec，58.4℃ 30sec，72℃ 1min，循环36 次，72℃延伸10min；

PCR扩增体系为Green Master Mix 25μL，引物NL1（F）-GC 1μL（浓度 10μM/L），引物LS2（R）1μL（浓度10μM/L），样品DNA模板1μL，ddH₂O补足至50μL。

步骤<5>中DGGE电泳按以下操作进行：PCR产物通过DGGE进行分离，使用40%丙烯酰 胺/甲叉基双丙烯酰胺溶液（37.5/1）制备聚丙烯酰胺变性梯度凝胶，变性梯度范围为30 ％～70％，使用的电泳缓冲液为1xTAE，电压180V，60℃电泳6h；聚丙烯酰胺凝胶用Gel  Red染料染色，得DGGE图谱。

步骤<6>按以下操作进行：电泳完后用于回收条带的聚丙烯酰胺凝胶用Gel Red染料 染色约30min，去离子水漂洗10s，在紫外灯下用无菌手术刀片切下含有目的片段的胶 块，装入一干净灭菌的1.5mL EP管中；用灭菌枪头将凝胶捣碎，加20μL灭菌双蒸水， 放置4℃冰箱过夜；12000rpm离心10min，取1μL上清为模板，用不带GC夹子的同一 通用引物进行PCR扩增，PCR扩增程序为95℃预变性5min，94℃ 50sec，52℃ 30sec， 72℃ 1min，循环36次，72℃延伸10min；扩增的目的DNA片段送测序；目的条带测序后， 在RDP（Ribosomal Database ProjectII-Release9，http://rdp.cme.msu.edu/）数据库 中用Classifier软件包对序列进行归类，并在GeneBank（http://www.ncbi.nlm.nih.gov） 进行序列同源性比较；序列和所比对的同源性高的序列一起，用MEGA5.0软件按距离矩阵 法中的邻接法（N-J法，Neighbor-joining Method）构建系统进化树，通过自展(bootstrap) 方法重复抽样1000次进行可靠性测试。

研究表明，六堡茶渥堆发酵中起主要作用的微生物以真菌为主（杨锦泉.微生物与六 堡茶渥堆发酵.云南茶叶.1987,(4),32-34）。据此，发明人采用PCR-DGGE技术建立了六堡 茶加工过程中真菌菌群的检测方法，直接从六堡茶中提取真菌总DNA，避免了传统培养不 能分离鉴定六堡茶中未培养真菌微生物的缺陷，能在较短的时间内得出实验结果，大大减 少工作量和工作时间，实验结果真实可信。该法适应于六堡茶及六堡茶加工过程中的茶叶 样品，检测的真菌菌群能全面包括六堡茶中的真菌种类，能客观有效地反映茶加工过程中 六堡茶真菌菌群动态变化，为有效揭示六堡茶发酵过程中微生物的作用机制和改进六堡茶 生产工艺奠定了科学基础。

附图说明

图1是六堡茶真菌总DNA的PCR产物图，图中：M为Marker，第Ⅰ～Ⅵ为不同编号的 抽取茶叶样品。

图2是六堡茶真菌总DNA的PCR产物DGGE电泳图，图中：第Ⅰ～Ⅵ为不同编号的抽 取茶叶样品。

图3是六堡茶真菌DGGE电泳回收条带PCR产物电泳图，图中：M为marker，1～11为 图2中对应标注的回收条带。

图4是六堡茶中真菌DGGE电泳回收条带测序结果图，图中上下两段相同编号合为测 序的结果，1～11为图2中对应标注的回收条带。

图5是DGGE回收条带测序结果的聚类分析结果图，图中：band1～band11为真菌DGGE 电泳回收序列对应的六堡茶真菌。

具体实施方式

实施例1

<1>取不同发酵过程中的六堡茶样品

抽取梧州茶厂2012年第266批次发酵车间的渥堆茶叶，该茶堆重量约20吨。该茶堆 高度约60cm，抽取其上层（包括堆面和面下5cm的茶叶）、中层（距离堆面约20-30cm） 的茶叶、下层（包括堆底和地面上5cm）的茶叶）。上、中、下三层各取其四角和中间点 共5个点，然后于无菌室内将其混匀，制成包含上、中、下层茶叶的茶叶混样。抽取陈化 仓库的刚进入陈化期的大箩茶叶，每件约50kg，用刀劈开取中间部分，共取2件，无菌 室中将其混匀。取样时间依次为发酵前、渥堆第5天、渥堆第13天、渥堆第16天、渥堆 第28天、陈化第3天。茶叶样品抽样情况如表1。

表1 茶叶样品抽样情况

<2>收集茶样品的微生物菌体

采用玻璃珠震荡法，先称量50g混匀的茶叶于500mL的锥形瓶里面，加少量灭菌过 的玻璃珠，再添加0.85％磷酸盐缓冲液450mL，200rpm震荡15min，然后用双层纱布 过滤掉茶叶，滤液使用500mL的离心瓶收集，10000rpm离心10min，收集沉淀。

<3>提取真菌总DNA

采用液氮研磨裂解菌体，将沉淀从离心瓶转移至灭菌的研钵，倒进适量的液氮，用力 研磨，反复直至粉末状，转移粉末至50mL离心管，加入15mL的总DNA提取液，同时加 入7.5mL的氯仿、7.5mL的Tris-平衡酚，轻轻上下颠倒混匀，10000rpm离心10min； 取上清转移至另一离心管中，加入等量的氯仿，上下颠倒混匀后，10000rpm离心10min； 取上清，加入等量的异丙醇沉淀，13000rpm，离心15min；收集的DNA用75％酒精洗涤 2遍，加入约0.3mL的ddH₂O溶解，置-20℃保存。

<4>真菌18S rRNA的PCR扩增（图1）

以待测样品的真菌总DNA为模板，使用带GC夹子的通用引物进行PCR扩增，扩增结 束后，对目的片段进行回收及纯化，具体如下：

引物为对大多数真菌18S rRNA基因5′末端具有特异性的带GC发夹的通用引物，引 物序列NL1（F）为5’-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3’（序列表SEQ.ID.No.1），引物序列 NL1（F）-GC为5’-CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGGCCCGCCGCCCCCGCCCCGCATATCAATAAGCGGAGGAA AAG-3’（序列表SEQ.ID.No.2），引物序列LS2（R）为5’-ATTCCCAAACAACTCGACTC-3’（序 列表SEQ.ID.No.3）；

PCR扩增程序为95℃预变性5min，94℃ 50sec，58.4℃ 30sec，72℃ 1min，循环36 次，72℃延伸10min；

PCR扩增体系为Green Master Mix 25μL，引物NL1（F）-GC 1μL（浓度 10μM/L），引物LS2（R）1μL（浓度10μM/L），样品DNA模板1μL，ddH₂O补足至50μL。 <5>DGGE电泳分析

纯化的PCR产物通过DGGE进行分离，染色后得到DGGE指纹图谱，通过指纹图谱分析 真菌菌群构成及菌群相对数量。

DGGE电泳按以下操作进行：使用40%丙烯酰胺/甲叉基双丙烯酰胺溶液（37.5/1）制 备聚丙烯酰胺变性梯度凝胶，变性梯度范围为30％～70％。点样：凝胶聚合好后拔掉梳子， 用1×TAE清洗胶孔，组装胶板到中心电极后，放入装有电泳缓冲液的电泳槽，加约350mL 1×TAE到上层缓冲液室，盖上盖子，取下上样盖，即可上样。将制备好的样品与等体积的 DGGE电泳上样缓冲液混匀，用移液器将样品加到胶孔。电泳：先将电泳缓冲液预热至60 ℃，中心电极放入电泳槽并加样后，盖上加样盖，打开缓冲液泵开关，调电压至180V电 泳6h。聚丙烯酰胺凝胶用Gel Red染料染色，得DGGE图谱。

结果如图2所示，在渥堆发酵中，最主要的菌群是曲霉属真菌（band1），其次是酵母 菌（band3）。

为得出进一步结论，可按以下操作进行指纹图谱分析：DGGE图谱采用BIO-RAD公司的 图像分析软件Quantity One进行分析；应用Quantity One软件的compare lanes功能对 DGGE图谱进行处理，自动生成各泳道条带的信号强度分布图，对条带对应的真菌进行相对 定量分析，直观地表示六堡茶中不同真菌之间的数量对比和不同样品中同一真菌的数量变 化。

<6>DGGE条带回收及序列分析

从凝胶中回收条带，并以此为模板，使用不带GC夹子的同一通用引物进行PCR扩增， 扩增结束后，对目的片段进行回收、纯化及测序；测序结果和NCBI数据库中的序列进行 比对分析，确定六堡茶的真菌菌群结构，具体如下：

电泳完后用于回收条带的聚丙烯酰胺凝胶用Gel Red染料染色约30min，去离子水漂 洗10s，在紫外灯下用无菌手术刀片切下含有目的片段的胶块(所切的胶块尽可能的细)， 装入一干净灭菌的1.5mL EP管中；用灭菌枪头将凝胶捣碎，加20μL灭菌双蒸水，放 置4℃冰箱过夜；12000rpm离心10min，取1μL上清为模板，用不带GC夹子的同一通 用引物进行PCR扩增（图3）。PCR扩增程序为95℃预变性5min，94℃ 50sec，52℃ 30sec， 72℃ 1min，循环36次，72℃延伸10min。扩增后送华大基因公司测序（图4）；目的条 带测序后，在RDP（Ribosomal Database ProjectII-Release9，http://rdp.cme.msu.edu/） 数据库中用Classifier软件包对序列进行归类，并在GeneBank （http://www.ncbi.nlm.nih.gov）进行序列同源性比较，确定条带对应的微生物的属分 类；序列和所比对的同源性高的序列一起，用MEGA5.0软件按距离矩阵法中的邻接法（N-J 法，Neighbor-joining Method）构建系统进化树，通过自展(bootstrap)方法重复抽样1000 次进行可靠性测试。结果如图5所示，六堡茶中真菌菌落主要由三大类组成，一类是普遍 存在包括普洱茶在内的黑茶中的曲霉属真菌，第二类是酵母菌，第三类是散囊菌。