一种伯克氏菌株、其有机磷酯水解酶和基因及其在有机磷农药降解中的应用

摘要

本发明公开了一种鉴定为伯克氏属(Burkholderia jiangsuensis)的菌株ECU1088，其保藏号为CGMCC No.9028；该菌种表达的有机磷酯水解酶及其基因，含有该基因的重组表达载体和重组表达转化体，其重组酶及其制备方法，以及利用该有机磷酯水解酶或重组有机磷酯水解酶降解有机磷农药的方法。本发明的有益效果在于：利用本发明提供的伯克氏菌株及其重组有机磷酯水解酶降解有机磷农药具有催化效果好、反应条件温和、对环境友好等显著优点。

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一株伯克氏属新种菌株Burkholderia jiangsuensis ECU1088，其保藏号为CGMCC9028，该伯克氏新菌株表达的有机磷酯水解酶及其基因，含有该基因的重组表达载体和重组表达转化体，及其重组酶的制备方法，还涉及有机磷酯水解酶或其重组酶作为催化剂降解有机磷农药的应用。 

背景技术

有机磷农药是乙酰胆碱酯酶的抑制剂，对人体具有较高毒性，威胁人类健康。农药残留是大量施用农药后的必然现象，如果超过最大残留限量，会对人畜产生不良影响，或通过食物链对生态系统中的生物造成毒害。农药的发明和使用虽然大大提高了农作物的产量和效益，但随着科学技术的发展和人们生活水平的提高，农药残留对环境及人类健康造成的负面影响日益显露出来。 

大量研究表明，土壤微生物对环境中的农药降解起着重要作用，筛选农药降解菌株无疑是控制农药残留量，保护生态环境及人类健康的有效手段，有机磷农药降解菌主要是从有机磷农药污染的土壤、水体或污泥等环境中直接分离筛选或经过富集培养获得。目前已报道的有机磷农药降解菌主要为真菌和细菌，崔中利等人首次从Pseudomonas sp.M6的基因文库中克隆了一种新的有机磷酯水解酶基因mpd(Appl.Environ.Microbiol.,67:4922-4925)，得到MPH酶，其粗酶液催化甲基对硫磷的活力仅为0.96U/ml，而后，人们分别从Pseudomonas,Bacillus,Stenotrophomonas等种属的微生物中克隆出mpd基因，得到MPH酶。武汉病毒所周宁一等人从Pseudomonas sp.WBC-3中克隆出mpd基因，得到MPH酶，其粗酶液催化甲基对硫磷的比活力为12.7U/mg(Biochem Biophys Res Commun.,334:1107-1114)，纯酶液为50.5U/mg(Research in Microbiology.,158:143-149)，目前研究报道的重组有机磷酯水解酶催化活力还有待提高，且降解菌株的多样性和新颖性也有待丰富。 

发明内容

因此，本发明要解决的技术问题就是丰富降解菌株的多样性，并从中挖掘新的有机 磷农药降解酶。 

为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案之一是： 

1.本发明提供了一株伯克氏新菌株Burkholderia jiangsuensis CGMCC9028，是发明人从浙江、江苏、上海、陕西等地区的150多份有机磷农药污染的土壤样品中，经过初筛、复筛及分离纯化，得到的产有机磷酯水解酶的新菌株。 

2.筛选菌株所用的培养基为本领域常规使用的培养基，本发明所述培养基优选配方为： 

(1)富集培养基(MSM)配方：(NH₄)₂SO₄1.0g·l^-1,K₂HPO₄0.8g·l^-1,KH₂PO₄0.2g·l^-1,MgSO₄0.2g·l^-1,CaSO₄0.08g·l^-1,FeSO₄·7H₂O0.005g·l^-1,Na₂MoO₄·2H₂O0.0033g·l^-1,用自来水配制，pH7.0，第一轮添加终浓度为25mg·l^-1的甲基对硫磷(MP)，每一轮逐步增加MP的浓度，直至底物浓度达到200mg·l^-1； 

(2)丰富培养基(PY)配方：蛋白胨10.0g·l^-1，酵母膏5.0g·l^-1，氯化钠5.0g·l^-1，用自来水配制，pH7.0； 

3.本发明所述菌株的筛选方法包括以下步骤： 

(1)富集培养：从浙江、江苏、上海、陕西等地不同环境中采取土壤样品。取1g土样加入到5mL第一轮富集培养基中，30℃,180rpm培养3天后，按5％的接种量转接到5mL第二轮富集培养基中，相同条件下继续培养3d，不断传代，至MP浓度为200mg·l^-1； 

(2)纯种分离：富集培养后，取400μl样品加入二倍体积的二氯甲烷进行萃取，分离萃取液，待二氯甲烷挥发完全后，加入20μl乙腈，然后用薄板层析法定性检测底物是否有减少或是否有产物生成，将有明显底物减少或产物生成的富集培养液取样划线于含有200mg/L底物的MSM培养基固体平板上，30℃下倒置培养。置于30℃恒温养箱中培养1～2d，观察菌落的生长速率和水解圈的大小，初步判断其降解能力，选择水解圈大的，根据菌落颜色、大小、形态进行单菌落的分离，分离后的单菌落于-20℃保藏用于初筛。 

(3)菌株初筛：挑取少量平板分离得到的单菌落，接入装有5mL底物终浓度为200mg·l^-1的PY培养基的试管(15×150mm)中，于30℃，180rpm恒温通风培养5d。培养结束后取400μl培养液加入二倍体积的二氯甲烷进行萃取，12,000rpm离心2min，弃上层水相，下层有机相待二氯甲烷挥发完全后，加入20μl乙腈重新溶解。采用薄板层析法定性检测各菌株的活性大小，根据底物斑点是否明显变淡或消失，淘汰没有活性或者活性相对较低的菌株，将活性高的菌株取一定体积的菌液分装至事先灭菌的菌种保存管， 以1:1(v/v)的量加入50％的无菌甘油，置于-20℃保藏用于复筛。 

(4)菌株复筛：将初筛得到的活性较高的菌株接种到装有5ml PY培养基的试管中，于30℃，180rpm培养24h，至生长对数期OD₆₀₀约为0.6-0.8，将菌液于8000rpm，离心5min，用无菌水洗涤两次，加入无菌水调整OD₆₀₀＝1.0即为种子液，分别以1％的接种量接入装有5ml丰富培养基PY的试管中，添加底物MP终浓度为200mg·l^-1，于30℃，180rpm恒温通风下反应。定时取样，取200μl反应液加入二倍体积的二氯甲烷萃取产物和底物，待有机相完全挥发后，加入200μl乙腈重新溶解，滤膜过滤后，即可通过高效液相色谱测定底物的降解速率。根据降解速率的检测结果，淘汰性能较差的菌株，催化性能较好的菌株取一定体积的种子液分装至事先灭菌的菌种保存管，以1:1(v/v)的量加入50％的无菌甘油，置于-70℃保藏用于进一步研究。复筛菌株降解效果如表1所示。 

表1.复筛菌株对MP降解状况 

(5)16S rDNA鉴定 

1)16S rDNA扩增 

挑取30号的单菌落进行培养，采用常规方法提取菌株的基因组DNA，以所述菌株基因组为模板，使用16S rDNA通用引物进行PCR扩增，具体方法请参考Int J Syst Bacteriol.,41:240-246。 

2)T/A克隆 

经琼脂糖凝胶电泳检测，扩增出大约1500bp大小的目的片段，将PCR产物利用北京天根生化公司的琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行纯化回收后，与pMD-18T(大连宝生物有限公司)载体连接、转化、培养、质粒抽提、测序(上海美吉生物生物医药科技有限 公司)，得到1498bp的16S rDNA目的片段。 

3)序列提交及比对 

该序列已提交GenBank(登录号为KJ400396)。将该序列在EzTaxon网站(http://www.eztaxon.org)上进行比对，比对结果为与该菌株16S rDNA同源性最高的为Burkholderia grimmiae R27^T(98.45％)，接着为Burkholderia zhejiangensis OP-1^T(98.19％),Burkholderia choica LMG22940^T(97.54％)，Burkholderia glathei ATCC29195^T(97.35％),Burkholderia terrestris LMG22937^T(97.23％)，以及Burkholderia telluris LMG22936^T(96.96％).根据16S rRNA比对结果，猜测其具有成为新种的可能，并对其进行进一步新种鉴定。 

(6)本发明中Burkholderia jiangsuensis CGMCC9028菌株的特征如下： 

1)微生物学特征： 

a、形态大小 

革兰氏阴性菌、无孢子生成、杆状、宽0.6-0.9μm、长1.3–1.6μm，有鞭毛 

b、适宜生长环境 

适宜生长的温度为15–45℃(最适30℃)，pH5–9(最适pH7)，NaCl浓度为0–1％(最适0.5％) 

c、平板培养菌落特性 

在30℃，PY平板上培养2d后，形成圆形、微黄、潮湿、透明且边缘规则的菌落。 

2)系统发育分析：进行了16S rDNA、gyrB和recA序列的克隆及其进化树分析，系统发育树表明该菌株为Burkholderia属，但不与同属的其它模式种聚为一支。 

3)G+C含量测定：G+C含量为62.55％。 

4)化学分类特征：对其细胞壁脂肪酸、极性酯及醌成分进行测定，其主要的脂肪酸为C_18:1ω7c/C_18:1ω6c(23.33％),C_16:0(16.82％),cyclo-C_17:0(14.99％),C_16:1ω7c/C_16:1ω6(8.50％),cyclo-C_19:0ω8c(8.12％),C_16:1iso I/C_14:03-OH(5.70％),C_16:03-OH(5.63％)以及C_16:02-OH(5.06％)。主要极性酯成分为磷脂酰甘油(PG)，磷脂酰乙醇胺(PE)，氨脂质(AL)，磷脂(PL)。主要的类异戊二烯醌为泛醌Q-8。 

5)DNA杂交：其与16S rDNA相似度较高的菌株Burkholderia grimmiae R27^T(98.45％)，Burkholderia zhejiangensis OP-1^T(98.19％)，Burkholderia glathei ATCC29195^T(97.35％)的DNA杂交值分别为26.8％、37.4％和24.6％。 

综上鉴定特征，确认该菌株为伯克氏菌属的一个新种，命名为Burkholderia jiangsuensis ECU1088。该新种的发现为微生物分类学做出了贡献，丰富了微生物的种类，进一步完善了Burkholderia属的菌种，且该新种基因组中含有降解有机磷农药的功能基因片段，可以利用该新菌株降解有机磷农药，具有很大的环境效益。 

(7)菌株保藏：该菌株于2014年4月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101。该菌株的分类命名为Burkholderia jiangsuensis，保藏编号为：CGMCC No.9028. 

本发明采取的技术方案之二是：一种分离的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。 

其中所述的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.2所示的蛋白质可以从Burkholderia jiangsuensis CGMCC9028中分离获得，也可以从重组表达该蛋白质的重组表达转化体中分离获得，也可以人工合成获得。 

本发明采取的技术方案之三是：一种分离的核酸，其是如下(1)或(2)的核酸： 

(1)核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.1所示的核酸； 

(2)编码具有SEQ ID No.2所示氨基酸序列的蛋白质。 

本发明所述核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的核酸可以从Burkholderia jiangsuensis CGMCC9028基因组DNA中分离获得，也可以从含有该SEQ ID No.1所示的核苷酸序列的重组表达载体中或重组转化体中分离获得，也可以全基因人工合成获得。 

本发明所述核苷酸的来源较佳地为：设计如下引物： 

mpdA：5'-GAATTCATATGGCCGCACCGCAGGTGCGCACCTCG-3' 

mpdB：5'-GAATTCTCGAGCTTGGGGTTGACGACCG-3' 

其中，mpdA引物下划线部分为Nde I酶切位点，mpdB引物下划线部分为Xho I酶切位点，以Burkholderia jiangsuensis CGMCC9028基因组DNA为模板，通过聚合酶链式反应(PCR)进行DNA扩增，获得核苷酸序列。 

本发明采取的技术方案之四是： 

本发明提供一种包含有机磷酯水解酶基因的核苷酸序列的重组表达载体。其可通过本领域常规方法将本发明的有机磷酯水解酶基因的核苷酸序列连接于各种合适载体上构建而成。所述载体可以是本领域的各种常规载体，如市售的质粒、粘粒、噬菌体或病毒载体等，所述载体优选质粒，更优选质粒pET28a。所述有机磷酯水解酶基因可以操作性 连接于表达合适的调控序列，以实现所述有机磷酯水解酶的组成型或诱导型表达。 

本发明采取的技术方案之五是： 

本发明提供一种包含有机磷酯水解酶基因或其重组表达载体的重组表达转化体，可通过将本发明的重组表达载体转化至宿主细胞中来制得所述重组表达转化体。所述宿主细胞可以是本领域的各种常规宿主细胞，前提是能使所述重组表达载体稳定地自行复制，且其所携带的有机磷酯水解酶基因可被有效表达。本发明优选大肠杆菌，更优选大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)，所述重组表达转化体命名为BL21(DE3)/pET-BjMPH。 

本发明采取的技术方案之六是：一种重组有机磷酯水解酶的制备方法，其包括如下步骤：培养如上所述的重组表达转化体，从培养物中获得重组表达的有机磷酯水解酶BjMPH。 

其中，所述的重组表达转化体的制备同前述介绍，可通过将本发明的重组表达载体转化至宿主细胞得到。所述的培养重组表达转化体中所用的培养基可以是本领域常规的任何可使转化体生长并产生本发明的重组有机磷酯水解酶的培养基，对于大肠杆菌菌株，优选LB培养基(其配方为：蛋白胨10g·l^-1,酵母膏5g·l^-1,NaCl10g·l^-1,pH7.0)。培养方法和培养条件没有特殊限制，可以根据宿主类型和培养方法等因素的不同按本领域普通知识进行适当的选择，只要能使转化体生长并产生本发明的重组有机磷酯水解酶即可。 

对于本发明所述菌株大肠杆菌BL21(DE3)/pET-BjMPH，培养方法优选地包括：将本发明所述的重组大肠杆菌接种至含有卡那霉素的LB培养基中，30～40℃，150～200rpm培养，培养液的吸光密度OD₆₀₀较佳地为0.5～0.7，优选地为0.6，加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)进行诱导，培养基中IPTG的终浓度较佳地为0.01～1.0mmol/L，优选地为0.2mmol/L，诱导温度优选地为25℃，诱导时间较佳地为10～24h，优选地为12～16h. 

所述的重组有机磷酯水解酶的制备方法还包括：诱导表达结束后，培养液离心，得到静息细胞，将细胞重悬于缓冲液中，在冰浴状态下超声破碎，离心收集上清液，即得重组水解酶的粗酶液，所述缓冲液较佳地为Tris-HCl缓冲液。将所得粗酶液放入-80℃冰箱预冻过夜，真空条件下冷冻干燥，即得重组有机磷酯水解酶粗酶粉。 

所述重组有机磷酯水解酶活力的测定方法包括如下步骤：890μl Tris-HCl缓冲液(50mM,pH9.0)中加入10μl底物甲基对硫磷(50mM)，使底物终浓度为0.5mM，再加入100μl适量稀释的制备的粗酶液，混匀，30℃条件下，在405nm处检测吸光值的变化率。 在上述反应条件下，每分钟生成1.0μmol对硝基苯酚所需要的酶量，定义为一个酶活力单位(U)。 

本发明采取的技术方案之七是：如上所述的有机磷酯水解酶在降解有机磷农药中的用途。 

其中所述降解有机磷农药较佳地包括：上述重组水解酶作为催化剂，以有机磷农药为底物进行水解反应。其中所述有机磷农药包括甲基对硫磷、甲胺磷、毒死蜱、三唑磷、氧乐果、敌敌畏和二嗪磷。所述有机磷酯水解酶的较优反应温度为30～35℃，较优反应pH为8.5～9.5。 

附图说明

图1为Bjmpd基因的PCR扩增DNA片段电泳图谱，其中：1.DL5,000DNA Marker(北京天根生化科技有限公司)；2.Bjmpd基因的PCR扩增产物。 

图2为BjMPH的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳图。其中：1.蛋白电泳Marker；2.重组BjMPH在E.coli BL21(DE3)中表达的破碎上清粗酶液；3.重组BjMPH在E.coli BL21(DE3)中表达的破碎上清纯酶液。 

图3为重组表达质粒pET-BjMPH的构建示意图。其中：Nde I,Xho I:限制新内切酶酶切位点；Bjmpd:有机磷酯水解酶基因；pET-BjMPH:重组表达质粒。f1origin为f1复制起始位点；ori为质粒复制起始位点；Kan为卡那霉素抗性基因；lac I为乳糖操作子。 

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，均按照常规方法和条件或按照试剂说明书进行。 

实施例1伯克氏新菌株(Burkholderia jiangsuensis CGMCC9028)的摇瓶培养 

在250mL摇瓶中装入50mL培养基，其培养基组成如下：葡萄糖5g·l^-1，酵母膏5g·l^-1，NaCl1g·l^-1，KH₂PO₄1_g·l^-1，MgSO₄0.2g·l^-1，CaCl₂0.1g·l^-1，pH7.0，自来水配制，121℃高温灭菌20min。将菌株ＣGMCC9028接种到摇瓶中，在30℃，180rpm条件下预培养12h作为种子液，将种子液以1％(v/v)的接种量接入装有100mL相同培养基的500mL 摇瓶中，在30℃，180rpm条件下培养24h，培养结束后，于9000rpm离心得到含有机磷酯水解酶的湿菌体。 

实施例2伯克氏新菌株(Burkholderia jiangsuensis CGMCC9028)的发酵培养 

种子培养与实施例1相同。在5L发酵罐中装入3L培养基，其组成如下：葡萄糖60g，蛋白胨30g，酵母膏30g，KH₂PO₄3g，MgSO₄1.5g，NaCl3.0g，自来水3L，pH7.0。培养基灭菌后，接入预培养12h的种子液200ml，在30℃，400rpm和1vvm通气条件下发酵，其间在4～12h匀速流加甘油(8mL/h)，若产生泡沫则滴加泡敌(1％水溶液，w/v，购自上海飞达贸易有限公司)，进行消泡。发酵12h后放罐。培养结束后，于9,000rpm离心得到含有机磷酯水解酶湿菌体。 

实施例3有机磷酯水解酶基因Bjmpd的克隆 

合成引物如下： 

mpdA：5'-GAATTCATATGGCCGCACCGCAGGTGCGCACCTCG-3' 

mpdB：5'-GAATTCTCGAGCTTGGGGTTGACGACCG-3' 

其中，mpdA引物(其序列如序列表中如SEQ ID No.3所示)下划线部分为Nde I酶切位点，mpdB引物(其序列如序列表中如SEQ ID No.4所示)下划线部分为Xho I酶切位点，以Burkholderia jiangsuensis CGMCC9028基因组DNA为模板，通过聚合酶链式反应(PCR)进行DNA扩增。20μl PCR反应体系：dd H₂O7μl，基因组1μl，mpdA1μl，mpdB1μl，2×Taq Mix10μl。混合均匀后，放入PCR仪中，按下列程序进行反应：(1)95℃，预变性5min；(2)94℃，变性1min；(3)61℃，退火40s；(4)72℃延伸1min30s；(2)-(4)进行30个循环；(5)72℃，延伸10min。PCR后，用琼脂糖凝胶电泳检测，将750～1000bp区间的条带进行切胶回收，其电泳图谱如图1所示。获得一条完整的伯克氏菌株Burkholderia jiangsuensis CGMCC9028有机磷酯水解酶全长基因序列DNA片段，经DNA测序，全长为894bp，将基因命名Bjmpd，其碱基序列如序列表中SEQ ID No.1所示。 

实施例4有机磷酯水解酶BjMPH重组表达质粒和重组表达转化体的制备 

实施例3所得的有机磷酯水解酶基因DNA片段在37℃用限制性内切酶Nde I和XhoI双酶切6h，经琼脂糖凝胶电泳纯化，利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(北京天根生化 科技有限公司)回收目标片段。将目标片段在T4DNA连接酶的作用下，与同样经Nde I和Xho I双酶切质粒pET-28a(+)(上海Novagen公司)，在4℃下连接过夜得到重组表达质粒pET-mpd，所述重组表达质粒pET-BjMPH的构建策略如图3所示。 

将上述重组表达质粒转化到大肠杆菌(E.coli)DH5α感受态细胞，冰浴30min，42℃热激90s。继续冰浴5min之后接入800μl LB培养基，180rpm，37℃培养1h，8000rpm离心2min，弃500μl培养基，将剩余的300μl培养基重悬，涂平板，37℃培养12h。平板长出菌落后，挑取单菌，分别接入到含LB培养基(Kan，50μg/ml)的试管中，37℃培养12h。挑取单克隆，筛选阳性重组体，菌落PCR验证阳性克隆，PCR条件如实施例3所述。培养重组菌，待质粒扩增后提取质粒，将重组质粒转化到大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)感受态细胞，转化液涂LB平板后在37℃培养12h。挑取单菌，分别接入到含LB培养基(Kan，50μg/ml)的试管中，37℃培养12h，菌落PCR验证阳性克隆。 

实施例5重组有机磷酯水解酶BjMPH的表达 

将实施例4所得的含重组质粒的重组菌E.coli BL21以10％(v/v)的接种量接入100ml LB培养基(Kan，50μg/ml)中，培养2h后(OD₆₀₀在0.6-0.8之间)，加入20μl IPTG(1M)使其终浓度为0.2mM，25℃诱导表达12h。收集诱导后的菌液，12,000rpm离心3min，离心后得到静息细胞。将静息细胞重新悬浮于10ml Tris-HCl缓冲液(50mM,pH9.0)中，在冰浴中超声破碎，破碎后12,000rpm离心10min收集上清，即为重组有机磷酯水解酶的粗酶液。 

所述重组有机磷酯水解酶活力的测定方法：890μl Tris-HCl缓冲液(50mM,pH9.0)中加入10μL底物甲基对硫磷(50mM)，使底物终浓度为0.5mM，再加入100μL适量稀释的制备的粗酶液，混匀，30℃条件下，在405nm处检测吸光值的变化率。在上述反应条件下，每分钟生成1.0μmol对硝基苯酚所需要的酶量，定义为一个酶活力单位(U)。 

经检测，所得重组有机磷酯水解酶BjMPH粗酶液的活力为28.8U/ml。 

实施例6重组有机磷酯水解酶BjMPH的纯化 

利用镍柱亲和层析纯化BjMPH，所得粗酶液和纯酶液经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳图分析，其结果如图2所示。 

实施例7重组有机磷酯水解酶BjMPH与Pseudomonas sp.WBC-3的MPH的活力比较 

虽然BjMPH与来自Pseudomonas sp.WBC-3的MPH同源性高达98.99％，仅有三个氨基酸不同，分别位于166、281和301三个位点，BjMPH三个位点的氨基酸分别为丝氨酸(Ser)、缬氨酸(Val)和丙氨酸(Ala)，而Pseudomonas sp.WBC-3的MPH三个位点的氨基酸分别为天冬酰胺(Asn)，丙氨酸(Ala)和丝氨酸(Ser)，但BjMPH催化甲基对硫磷的活力却是Pseudomonas sp.WBC-3的MPH活力的2.53倍，结果如表2所示。因此这三个位点的改变对酶活的影响较大，该有机磷酯水解酶BjMPH较来源于Pseudomonas sp.WBC-3的MPH相比降解活力得到了提高，使其更好地应用于甲基对硫磷的降解中。 

表2BjMPH与MPH对甲基对硫磷的活力比较 

实施例8温度、pH对重组有机磷酯水解酶BjMPH活性的影响 

温度对酶活的影响在20～60℃下按标准方法测定：将反应体系置于不同温度下保温2min后加入酶液测活。温度对重组有机磷酯水解酶BjMPH活性的影响如表3所示。 

表3温度对重组有机磷酯水解酶BjMPH活性的影响 

pH对酶活的影响在pH6.0～11.0范围内按标准方法测定。缓冲溶液分别为MES(6.0～6.5),PIPE(6.5～7.5),HEPES(7.0～8.5),TAPS(8.0～9.0),CHEX(9.0～10.0),CAPS(10.0～11.0)。pH对重组有机磷酯水解酶BjMPH活性的影响如表4所示。 

表4pH对重组有机磷酯水解酶BjMPH活性的影响 

实施例9重组有机磷酯水解酶BjMPH对其它有机磷农药的降解效果检测 

测定了有机磷酯水解酶BjMPH对几种常见有机磷底物的降解效率。测定方法为：990μl Tris-HCl缓冲液(50mM,pH9.0)中加入10μl200mM底物母液(终浓度2mM)以及0.5U纯酶，30℃条件下反应30min。取反应液稀释过滤后进行高效液相色谱检测。检测条件及检测结果如表5所示。 

表5重组水解酶BjMPH对有机磷农药降解效果 

有机磷酯水解酶BjMPH对所测试的有机磷农药均能降解，其中对甲基对硫磷、甲胺磷等表现出了非常好的降解效果。