棉花品种‘中棉所49号’的DNA指纹检测方法

摘要

本发明提供一种棉花品种‘中棉所49号’的DNA指纹检测方法，该方法利用SSR标记技术，使用选自CIR246、DPL0917、BNL3033、BNL1053、NAU3839、HAU0878、DPL0176、NAU3424、Gh132和BNL1154中的至少一种特征引物进行PCR检测，该方法包括如下步骤：DNA提取、SSR-PCR扩增、电泳和银染检测。本发明方法简单快速、准确稳定，仅需2d即可完成1份‘中棉所49号’样品的纯度与真伪检测。

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体地说，涉及棉花品种‘中棉所49号’的DNA指纹检测方法。 

背景技术

‘中棉所49号’系中国农业科学院棉花研究所选育的常规早中熟陆地棉品种。该品种是西北内陆棉区主栽棉花品种之一。2006～2013年，连续8年被农业部推荐为西北地区棉花主导品种；2008～2013年，连续6年被列为国家西北内陆棉区棉花早中熟组区域试验对照品种；2007～2013年，连续7年被列为自治区棉花早中熟组区域试验对照品种；2005～2012年在南疆和东疆累计推广面积3207.1万亩，年均400万亩，占当地棉花面积30%左右。并因原棉品质稳定而优异，被选为国家原棉实物标样。 

然而，随着棉花品种数量的日益增加和遗传基础的日益狭窄，使得完全根据形态性状进行棉花品种的辨别越来越困难，给种子生产、经营、管理、维权等诸环节带来不同程度的困难，造成诸如品种多、乱、杂的现象。近年来，分子生物学的发展使品种鉴定进入到基因水平，与传统的形态学方法和蛋白质电泳技术相比，DNA标记技术能揭示更多的多态性，具有准确可靠、简单快速、易于自动化的优点，是品种鉴定技术的发展趋势。与其它分子标记相比，以微卫星序列为基础的简单重复序列（SSR）标记在DNA指纹鉴定上显示了独特的优越性：SSR标记数量丰富，覆盖整个基因组，揭示的多态性高，以孟德尔方式遗传，呈共显性。SSR标记已成为品种鉴定首选技术之一，并已在玉米，水稻等作物上初步应用。 

目前，我国棉种的真实性与品种纯度鉴定仍依靠田间小区种植鉴定方法，需投入大量的人力、物力，成本高、耗时长，时效性差。武耀廷，张天真，郭旺珍等进行了陆地棉品种SSR标记的多态性及用于杂交种纯度检测的研究；马轩，杜雄明，孙君灵等进行了18个彩色棉 品系的SSR指纹分析；殷剑美，陈旭升，狄佳春等进行了杂交棉苏杂118的SSR指纹图谱构建研究。研究者普遍认为，利用分子标记进行棉花品种鉴定是可行的。但利用现有的分子标记技术进行品种鉴定缺乏系统性研究，存在鉴别能力不够高、操作步骤较多、耗费时间较长、实验成本较高等问题，不能完全适应实践检测的需要。因此，有必要针对限制棉花DNA指纹鉴定实用化的因素，迅速开展我国棉花品种DNA指纹鉴定的研究工作，建立高效准确、经济简便的以SSR技术为基础的DNA指纹鉴定体系，在此基础上开发棉花品种纯度和真伪DNA指纹检测专用试剂盒，为棉花品种质量监控及品种权保护提供有利的工具。 

发明内容

本发明的目的是提供棉花常规种‘中棉所49号’的DNA指纹检测方法。 

为了实现本发明目的，本发明首先提供用于检测棉花品种‘中棉所49号’的特异性PCR引物，所述PCR引物选自CIR246、DPL0917、BNL3033、BNL1053、NAU3839、HAU0878、DPL0176、NAU3424、Gh132和BNL1154中的至少一对引物（表1）。 

表1  特异性PCR引物 

本发明还提供棉花品种‘中棉所49号’的DNA指纹检测试剂盒，其包括表1中列出的用于检测棉花品种‘中棉所49号’的特异性PCR引物中的至少一对引物。优选地，所述试剂盒中包括表1中列出全部引物的组合。更优选地，所述试剂盒还包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg²⁺、PCR反应缓冲液中的至少一种。 

本发明还提供棉花品种‘中棉所49号’的DNA指纹检测方法，包括以下步骤： 

1）提取待测棉花的基因组DNA； 

2）以待测棉花的基因组DNA为模板，利用表1中的至少一对引物进行PCR扩增； 

3）检测PCR扩增产物。 

20μL PCR反应体系中包括：添加Mg²⁺的10×反应缓冲液2.0μL，2.5mM dNTPs1.6μL，20μM上、下游引物各0.15μL，2.5U/μL Taq DNA聚合酶0.4μL，20ng/μL基因组DNA2.0μL，余量为ddH₂O。 

PCR扩增程序为：94℃预变性4min；94℃变性45s，55℃退火45s，72℃延伸45s，32个循环；72℃延伸12min，4℃保存。 

前述方法中，优选使用银染法检测PCR扩增产物。 

本发明进一步提供所述试剂盒在检测棉花品种‘中棉所49号’中的应用。 

本发明通过对特征引物筛选、DNA快速提取法、分子检测试验体系等环节的研究，从实践上解决了限制DNA指纹技术商业化的关键技术问题，建立了快速准确、经济简便、稳定可靠的棉花DNA指纹鉴检测实验体系，并在此基础上开发一种适用于棉花常规种‘中棉所49号’的DNA检测专用试剂盒，采用该试剂盒不仅检测结果稳定可靠，而且操作简单方便，成本低廉，有利于技术的标准化。 

（1）特征引物的筛选 

以包括‘中棉所49号’在内的12个来源于我国现阶段三大棉区的 主导棉花品种为特征引物的筛选材料，包括长江流域棉区的4个品种：‘鄂杂棉10号’、‘苏杂3号’、‘湘杂棉10号’与‘中棉所63号’；黄河流域棉区的5个品种：‘中棉所70号’、‘鲁棉研21号’、‘鲁棉研28号’、‘中植棉2号’与‘中棉所50号’；新疆棉区的3个品种：‘中棉所49号’、‘新陆早33号’与‘新陆早42号’。 

从3000多对候选SSR引物中筛选出在’中棉所49号’上表现为独特基因型的特征引物共10对：DPL0917、CIR246、BNL3033、BNL1053、NAU3839、HAU0878、DPL0176、NAU3424、Gh132和BNL1154。使用其中任一特征引物均可实现对‘中棉所49号’进行纯度检测，不同特征引物的检测结果可相互验证，同时使用还可对‘中棉所49号’进行真伪检测。 

（2）利用上述筛选出的特征引物对‘中棉所49号’进行指纹检测，包括以下步骤： 

1）DNA快速提取 

采用全自动样品快速研磨仪将去壳棉种充分粉碎后，加入800μLSDS提取液，漩涡充分后，65℃水浴30min，间隔10min左右轻摇一次。加入等体积800μL酚、氯仿和异戊醇的混合液（其体积比依次为25:24:1），混匀至不分层，10000rpm离心10min。取上清。重复抽提一次后离心取上清，加入0.7倍体积异丙醇，待DNA成团析出后，70%乙醇洗涤DNA沉淀2次，加入200μL TE或ddH₂O充分溶解DNA，备用。该方法相比常规的以叶片为材料的CTAB提取法不仅能获得高质量的DNA，而且简单快速，省去了育苗时间和液氮研磨等环节，降低实验成本的同时大大提高了工作效率。 

2）SSR-PCR扩增体系 

20μL SSR-PCR反应体系包括：添加Mg²⁺的10×反应缓冲液2.0μL，2.5mM dNTPs1.6μL，20μM上、下游引物各0.15μL，2.5U/μL Taq DNA聚合酶0.4μL，20ng/μL基因组DNA2.0μL，余量为ddH₂O。 

反应程序：94℃预变性4min；94℃变性45s，55℃退火45s，72℃延伸45s，32个循环；72℃延伸12min，4℃保存。该SSR-PCR扩增体系稳定可靠，确保了实验结果的可重复性。 

3）电泳 

PCR扩增产物采用6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，恒功率90W电泳1h。相比非变性胶和琼脂糖凝胶电泳，6%变性胶更适于高分辨率的棉种DNA指纹鉴定，不仅有效提高品种指纹鉴别能力，而且缩短了电泳时间。 

4）银染检测 

采用快速银染法，流程如下： 

①固定液（10%乙醇，0.5%冰醋酸）固定5min；②双蒸水快速漂洗1次；③0.2%AgNO₃溶液染色5min；④双蒸水快速漂洗1次；⑤显影液（3%NaOH，0.5%甲醛）显影5min；⑥固定液（10%无水乙醇，0.5%冰醋酸）定影5min。该银染法操作简单，背景容易掌握，灵敏度高，且减少了冰醋酸的使用量，30分钟内即可获得背景清晰的染色效果。 

本发明建立了快速准确、经济简便、稳定可靠的棉花DNA指纹检测体系，并在此基础上开发出专用于棉花常规种‘中棉所49号’DNA指纹检测的试剂盒，利用该试剂盒对棉花常规种‘中棉所49号’进行检测，一份样品从送样到出结果仅需2d，且检测结果稳定可靠，容易统计，只需具备常规的分子生物学设备即可达到检测目的，易于基层推广使用。对于口岸物种检验工作及品种资源鉴别、种质资源保护具有重大意义。 

附图说明

图1为本发明实施例1中利用特征引物CIR246对48个‘中棉所49号’种子样品纯度检测图谱。 

图2为本发明实施例1中利用特征引物DPL0917对48个‘中棉所49号’种子样品纯度检测图谱。 

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册（Sambrook J&Russell DW,Molecular cloning:a laboratory manual,2001），或按照制造厂商说明书建议的条件。 

实施例1  棉花品种‘中棉所49号’的DNA指纹检测方法 

对‘中棉所49号’种子样品进行纯度检测包括以下步骤。其中，本方法中所用引物序列信息见表1，所用的试剂配制见表2。 

1、DNA提取 

（1）将单粒棉花种子去壳，置于2ml离心管，加入100μL超纯水和1个钢珠，置于全自动样品快速研磨仪中，60赫兹30s充分粉碎。 

（2）加入800μL DNA提取液(1%SDS，0.01M EDTA8.0，0.7M NaCl，0.05M Tris-HCl，0.5%山梨醇，1%PVP，1%β-巯基乙醇)，漩涡至充分混匀后，65℃水浴30min，间隔10min左右轻摇一下。 

（3）水浴结束后，加入等体积800μL苯酚、氯仿和异戊醇的混合液（其体积比依次为25:24:1），上下颠倒混匀至不分层，10000rpm离心10min。 

（4）吸取上清液转移到另一2mL离心管中，加入等体积800μL的苯酚：氯仿：异戊醇（25:24:1），上下颠倒混匀至不分层，10000rpm离心10min。 

（5）将上清液转移到另一2mL离心管中，加入0.7倍体积异丙醇缓慢摇动几次，静置30min，絮状DNA成团析出。 

（6）用剪口枪头吸取DNA转移至盛有70%乙醇的离心管中，洗涤两次。 

（7）倒掉乙醇，自然通风干燥DNA，加入200μL TE（pH8.0）或ddH₂O，充分溶解备用。 

（8）紫外检测DNA浓度，用ddH₂O将DNA原液稀释至使用浓度20ng/μL，4℃保存备用。 

表2  试剂配制 

2、SSR-PCR扩增 

选用特征引物DPL0917与CIR246，PCR反应体系见表3。 

表3  PCR反应体系（总体积20μL） 

反应程序：94℃预变性4min；94℃变性45s，55℃退火45s，72℃延伸45s，共32个循环；72℃延伸12min；4℃保存待用。 

利用其余8对引物进行SSR-PCR扩增，使用的反应体系及反应程序同以上描述。 

3、电泳检测 

(1)清洗玻璃板：用自来水沾上洗涤灵把玻璃板反复擦洗干净，用纯水擦洗一遍，再用95%酒精擦洗一遍。在方板上涂上1mL Binding Silane(0.5%)，凹板上涂上1mL Repel silane（2%）。操作过程中防止两块玻璃板互相污染。 

(2)6%胶的制备：见表4。 

表4   6%胶的配方 

注：40%PA胶:190g丙烯酰胺+10g双丙烯酰胺用水稀释至500mL。 

TEMED和10%APS在灌胶前加入。 

（3）灌胶：灌胶过程中防止出现气泡，轻轻插入梳子，使其聚合2小时以上。 

（4）变性：20μL PCR样品中加入5μL6×上样缓冲液，混匀后，在PCR仪上运行变性程序：95℃变性5分钟，4℃冷却10分钟。 

（5）电泳：用移液器吹吸加样槽，清除气泡，擦入样品梳子，每个加样孔点加入3μL样品。90W恒功率电泳1小时。电泳结束后，小心分开两块玻璃板，胶会紧贴在涂Binding silane的玻璃板上。 

4、银染 

固定：10%无水乙醇+0.5%冰醋酸固定液，固定5min分钟； 

漂洗：双蒸水快速漂洗； 

染色：0.2%AgNO₃溶液中染色5分钟； 

漂洗：双蒸水快速漂洗； 

显影：3%NaOH+0.5%甲醛显影液，显影5min； 

定影；固定液中定影5分钟； 

5、数据统计与分析 

依据SSR扩增产物在电泳凝胶上的相对位置及带型特征，对引物生成的不同基因型直接编号，建立其DNA分子指纹图谱。 

图1所示为特征引物CIR246对48个‘中棉所49号’种子样品纯度检测图谱，编号1-48为种子样品泳道，编号M为分子量Marker泳道。 48个样品表现为两种基因型，编号为42的样品表现为一种基因型，其他47个样品均表现为另一种主要基因型，其中，主要基因型为‘中棉所49号’的真实基因型，编号为42的样品为杂株基因型。即‘中棉所49号’种子的纯度为97.9%。 

图2所示为特征引物DPL0917对同样的48个‘中棉所49号’种子样品纯度检测图谱，编号1-48为种子样品泳道，编号M为分子量Marker泳道。48个样品表现为两种基因型，编号为42的样品表现为一种基因型，其他47个样品均表现为另一种主要基因型，其中，主要基因型为‘中棉所49号’的真实基因型，编号为42的样品为杂株基因型。即‘中棉所49号’种子的纯度为97.9%。两个特征引物检测的结果得到了相互验证，且结果完全一致。 

利用其余8对引物进行SSR-PCR扩增，电泳结果与上述2对引物的相同，表明引物间检测结果的一致性。 

实施例2棉花品种‘中棉所49号’的DNA指纹检测方法的应用 

鉴定市面上正在热销的常规棉品种X是否为主导棉花品种‘中棉所49号’。 

按照实施例1的步骤，随机挑取待测品种X与对照品种中棉所49干种子各24粒进行DNA制备，同时使用DPL0917、CIR246、BNL3033、BNL1053、NAU3839、HAU0878、DPL0176、NAU3424、Gh132和BNL1154共10对特征引物进行PCR扩增、电泳及银染检测。 

结果分析：通过以上检测，获得两个品种在10个位点上的DNA指纹图谱，进行比较，若两个品种在10个特征引物位点上指纹完全相同，表明X品种是常规棉品种中棉所49；若两个品种在大于等于2个特征引物位点上指纹不相同，表明X品种不是常规棉品种中棉所49；若两个品种仅在1个特征引物位点上指纹不相同，表明X品种是常规棉品种中棉所49的近似品种。 

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。 

参考文献： 

[1]武耀廷,张天真,郭旺珍，等.陆地棉品种SSR标记的多态性及用于杂交种纯度检测的研究[J].棉花学报,2001,13(3):131-133. 

[2]马轩,杜雄明,孙君灵.18个彩色棉品系的SSR指纹分析[J].植物遗传资源学报,2003,4(4)305-310. 

[3]殷剑美,陈旭升,狄佳春，等.杂交棉苏杂118的SSR指纹图谱构建[J].江苏农业科学,2007,4:29-31。