韩国假单胞菌及其制备内消旋酒石酸或其盐的方法

摘要

本发明提供一种韩国假单胞菌BK-9，具有如SEQIDNO:1所示的16SrDNA序列，命名为韩国假单胞菌Pseudomonaskoreensis，已保藏于CGMCC，保藏登记号为CGMCCNo.8395。本发明提供的一种韩国假单胞菌通过水解将反式环氧琥珀酸或其盐转化为内消旋酒石酸或其盐，且获得较高的产量，充分满足市场需求，具有实用性。

说明书

技术领域

本发明属于生物工程领域，涉及一种韩国假单胞菌及其生产内消旋酒石酸或其盐的方法。 

背景技术

内消旋酒石酸是一种有机酸，主要用于制备防盐结块剂,也可用于制备药物、果子精油、焙粉以及媒染剂、鞣剂等，其需求量正在逐年递增。目前已报道的生产内消旋酒石酸的方法主要有3种，一是以顺丁烯二酸为原料，以钼酸盐或钨酸盐为催化剂，使顺丁烯二酸和过氧化氢反应生成中间产物顺式环氧琥珀酸，进而合成内消旋酒石酸；二是L(+)-酒石酸在强碱条件下加热，发生分子内部空间结构上的转变，生成内消旋酒石酸；三是生物合成法，采用具有反式环氧琥珀酸水解酶的微生物来生产内消旋酒石酸或其盐：即以反丁烯二酸酐为原料加水得到反丁烯二酸，再以钨酸或钨酸盐为催化剂，使反丁烯二酸与过氧化氢反应制得反式环氧琥珀酸，最后利用具有反式环氧琥珀酸水解酶的微生物将反式环氧琥珀酸或其盐水解为内消旋酒石酸或其盐。 

目前报道的具有反式环氧琥珀酸水解酶的微生物只有恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)、黄杆菌(flavobacterium)属。 

发明内容

本发明的目的是提供一种新的韩国假单胞菌菌株(Pseudomonas koreensis BK-9)，具有如SEQ ID NO:1所示的16S rDNA序列，该韩国假单胞菌命名为韩国假单胞菌Pseudomonas koreensis，已于2013年10月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称：CGMCC)，保藏登记号为CGMCC No.8395，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院中国科学院微生物研究所(邮编：100101)。 

本发明的另一个目的是提供韩国假单胞菌菌株在制备内消旋酒石酸或其盐中应用，通过以下步骤实现：先在种子培养基中培养所述韩国假单胞菌的种子液；然后将所述韩国假单胞菌的种子液转接入产酶培养基中，培养获得韩国假单胞菌细胞；最后利用所述韩国假单胞菌细胞对反式环氧琥珀酸或其盐进行水解生成内消旋酒石酸或其盐。 

本发明制备内消旋酒石酸或其盐的优选具体步骤是：将保存于斜面培养基上的韩国假单胞菌BK-9(CGMCC No.8395)接种于装有50ml种子培养基的250ml三角瓶中,30℃、200rpm振荡培养24h，得到所述韩国假单胞菌的种子液；然后取3ml上述韩国假单胞菌的种子液接种于装有300ml产酶培养基的1000ml三角瓶中，30℃、200rpm振荡培养48h，获得相应的韩国假单胞菌细胞；接着7000rpm、15min离心收集韩国假单胞菌细胞，将该韩国假单胞菌细胞加入到300ml的浓度为0.8M的反式环氧琥珀酸或其盐中，37℃振荡培养，反应48h，得到转 化液；最后向转化液中加入过量的CaCl₂，形成内消旋酒石酸钙沉淀，过滤得到沉淀并水洗，再对内消旋酒石酸钙依次进行硫酸酸解、阴、阳离子交换柱精制、减压浓缩、结晶、分离和烘干得到内消旋酒石酸或其盐的成品。 

其中反式环氧琥珀酸盐为反式环氧琥珀酸与各种阳离子所形成的盐，阳离子选自钠、钾、铵、钙。 

斜面培养基：葡萄糖5g，牛肉膏5g，氯化铵1g，硫酸镁0.1g,磷酸二氢钾0.6g,琼脂粉15g，加水至1000ml，pH7.0。 

种子培养基：葡萄糖5g，牛肉膏5g，氯化铵1g，硫酸镁0.1g,磷酸二氢钾0.6g,加水至1000ml，pH7.0。 

产酶培养基组成为：葡萄糖10g，牛肉膏5g，磷酸二氢钾1g，硫酸镁0.1g，氯化铵1g,反式环氧琥珀酸钠10g，加水至1000ml，pH7.0。 

本发明的发明人经过长期和深入的研究，从田园土中分离获得了一种新的微生物菌株，它能将反式环氧琥珀酸或其盐转化为内消旋酒石酸或其盐。该新的菌株经鉴定为韩国假单胞菌(Pseudomonas koreensis)。本发明的韩国假单胞菌菌株可用于对反式环氧琥珀酸或其盐进行水解生成内消旋酒石酸或其盐，获得的内消旋酒石酸经过了详细的鉴定。 

本发明提供了一种新的可用于内消旋酒石酸或其盐生产的韩国假单胞菌菌株(Pseudomonas koreensis)，且使用本发明韩国假单胞菌BK-9通过对反式环氧琥珀酸或其盐进行水解生成内消旋酒石酸或其盐，并可达到较高的产量，充分满足市场需求，具有实用性。 

生物材料样品的保藏信息 

保藏的生物材料样品：韩国假单胞菌(Pseudomonas koreensis)BK-9；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称：CGMCC)；保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院中国科学院微生物研究所(邮编：100101)；保藏日期：2013年10月25日；保藏登记号：CGMCC No.8395。 

具体实施方式

在本发明通过实施例作进一步的说明。 

以下实施例中，所用的斜面培养基和种子培养基的组成如下： 

(1)斜面培养基：葡萄糖5g，牛肉膏5g，氯化铵1g，硫酸镁0.1g,磷酸二氢钾0.6g,琼脂粉15g，加水至1000ml，pH7.0。 

(2)种子培养基：葡萄糖5g，牛肉膏5g，氯化铵1g，硫酸镁0.1g,磷酸二氢钾0.6g,加水至1000ml，pH7.0。 

(3)产酶培养基：葡萄糖10g，牛肉膏5g，磷酸二氢钾1g，硫酸镁0.1g，氯化铵1g,反 式环氧琥珀酸钠10g，加水至1000ml，pH7.0。 

(4)筛选培养基：反式环氧琥珀酸钠10g，酵母提取物1g,磷酸二氢钾1g，硫酸镁0.1g，氯化铵1g，加水至1000ml,PH7.0。 

实施例1：韩国假单胞菌(Pseudomonas koreensis)BK-9的筛选 

称取5g田园土样品，置于装有50ml筛选培养基的250ml三角瓶中，30℃、200rpm振荡培养3天。取一环培养液，并在固体筛选培养基平板上划斜线，30℃倒置培养2天。挑取平板上的单菌落，接种于装有50ml产酶培养基的250ml三角瓶中，30℃、200rpm下振荡培养48h。7000rpm下离心15min，收集细胞，于4℃放置备用。将离心收集的细胞用10ml0.8M pH7.0反式环氧琥珀酸钠悬浮，30℃振荡反应1天后，用高效液相色谱法鉴定反应液中有无内消旋酒石酸产生。本发明田园土样品来源于杭州市。 

本发明总共对535个菌株进行了筛选，得到了一株具有将反式环氧琥珀酸或其盐水解为内消旋酒石酸或其盐特性的菌株，经CGMCC证明存活。该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏登记号为CGMCC No.8395，命名为：韩国假单胞菌(Pseudomonas koreensis)BK-9，保藏日：2013年10月25日，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院中国科学院微生物研究所(邮编：100101)。 

实施例2：韩国假单胞菌BK-9(Pseudomonas koreensis BK-9)的鉴定 

步骤1：变性 

在斜面培养基中挑取韩国假单胞菌BK-9CGMCC8395于10ul无菌水中，变性后离心取上清作为模板。变性条件为：99℃,10min。 

步骤2：PCR扩增 

使用细菌16S rDNA PCR鉴定试剂盒(购于TaKaRa公司，货号D310)，进行PCR扩增韩国假单胞菌BK-9CGMCC8395的16S rDNA片段。 

其中，PCR反应体系为：步骤1所得的变性反应液1μl，PCR Premix25μl，Forward primer(20pmol/μl)0.5μl，Reverse primer(20pmol/μl)0.5μl，16S-free H₂O23μl，总体积50μl。 

PCR反应条件如下所示： 

步骤3：PCR产物的回收和测序 

取5μl步骤2所得的PCR产物进行3％琼脂糖凝胶电泳鉴定，然后使用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(购于TaKaRa公司，货号DV805A)切胶回收目的片段，并以16S Forward、16S Internal和16S Reverse为引物进行DNA测序(TaKaRa公司)。测序结果显示，韩国假单胞菌BK-9CGMCC8395的16S rDNA核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，即本发明的韩国假单胞菌具有如SEQ ID NO:1所示的16S rDNA序列。 

将上述实施例1中得到的具有如SEQ ID NO:1所示的16S rDNA核苷酸序列，用BLAST程序在NCBI数据库中进行比对分析，其比对结果如表1所示。比对结果显示，所测试的菌株属于假单胞菌属(Pseudomonas)。 

表1韩国假单胞菌BK-9CGMCC8395的16S rDNA序列的BLAST比对结果 

实施例3：利用反式环氧琥珀酸钠和韩国假单胞菌BK-9CGMCC8395生产内消旋酒石酸 

在本实施例中，所用的产酶培养基的组成为：葡萄糖10g，牛肉膏5g，磷酸二氢钾1g，硫酸镁0.1g，氯化铵1g,反式环氧琥珀酸钠10g，加水至1000ml，pH7.0。 

本实施例中，样品的红外光谱用Nicolet-Nexus670傅立叶转换式红外光谱仪检测；样品的核磁共振氢谱和碳谱用BRUKER AVIII500M核磁共振仪检测；样品的质谱用LCD Deca xp max离子阱质谱仪检测；样品的旋光度用WZZ-2B旋光仪检测。 

先将韩国假单胞菌BK-9CGMCC8395的菌株保藏在斜面培养基上；然后将斜面培养基上的韩国假单胞菌BK-9CGMCC8395接种于装有50ml种子培养基的250ml三角瓶中，在30℃、200rpm的转速条件下振荡培养24h，得到韩国假单胞菌BK-9的种子液。吸取3ml上述韩国假单胞菌BK-9的种子液接种于装有300ml产酶培养基的1000ml三角瓶中，30℃、200rpm振荡培养48h，以获得相应的韩国假单胞菌细胞。7000rpm、15min离心收集韩国假单胞菌细胞，将该韩国假单胞菌细胞加入到300ml的浓度为0.8M的反式环氧琥珀酸钠中，37℃振荡培养，反应48h，得到转化液。向转化液中加入过量的CaCl₂，对产物进行过滤，将过滤得到的沉淀进行水洗得到75g酒石酸钙，再对酒石酸钙依次进行硫酸酸解、阴和阳离子交换柱精制、减压浓缩、结晶、分离和烘干，得到8.4g固体产物。经红外光谱、核磁共振谱、质谱检测，确定该固体产物为酒石酸。经旋光度检测，该固体产物的比旋光度为0，证明该固体产物为内消旋酒石酸，且纯度为99.9％。 

实施例4：利用反式环氧琥珀酸钾和韩国假单胞菌BK-9CGMCC8395生产内消旋酒石酸 

在本实施例中，产酶培养基的组成为：葡萄糖10g，牛肉膏5g，磷酸二氢钾1g，硫酸镁0.1g，氯化铵1g,反式环氧琥珀酸钠10g，加水至1000ml，pH7.0。 

在本实施例中，样品的红外光谱用Nicolet-Nexus670傅立叶转换式红外光谱仪检测；样品的核磁共振氢谱和碳谱用BRUKER AVIII500M核磁共振仪检测；样品的质谱用LCD Deca xp max离子阱质谱仪检测；样品的旋光度用WZZ-2B旋光仪检测。 

先将韩国假单胞菌BK-9CGMCC8395的菌株保藏在斜面培养基上；然后将斜面培养基上的韩国假单胞菌BK-9CGMCC8395接种于装有50ml种子培养基的250ml三角瓶中，在30℃、200rpm的转速条件下振荡培养24h，得到韩国假单胞菌BK-9的种子液。吸取3ml上述韩国假单胞菌BK-9的种子液接种于装有300ml产酶培养基的1000ml三角瓶中，在30℃、200rpm的转速条件下振荡培养48h，以获得相应的韩国假单胞菌细胞。7000rpm、15min离心收集韩国假单胞菌细胞，将该韩国假单胞菌细胞加入到300ml的浓度为0.8M的反式环氧琥珀酸钾中，37℃振荡培养，反应48h，得到转化液。向转化液中加入过量的CaCl₂，对产物进行过滤，将过滤得到的沉淀进行水洗得到68g酒石酸钙，再对酒石酸钙依次进行硫酸酸解、阴和阳离子交换柱精制、减压浓缩、结晶、分离和烘干后，得到7.8g固体产物。经红外光谱、核磁共振谱、质谱检测，确定该固体产物为酒石酸。经旋光度检测，该固体产物的比旋光度为0，证明该固体产物为内消旋酒石酸，且纯度为99.9％。 

综上可知，本发明的韩国假单胞菌BK-9CGMCC8395具有将反式环氧琥珀酸或其盐水解为内消旋酒石酸或其盐的特性。 

需要说明的是，本发明所述的反式环氧琥珀酸盐为反式环氧琥珀酸和各种金属离子形成的盐，可以是上述的反式环氧琥珀酸钠或反式环氧琥珀酸钾，还可以是反式环氧琥珀酸钙等其他反式环氧琥珀酸的盐。 

<110>  杭州宝晶生物股份有限公司

<120>  韩国假单胞菌及其制备内消旋酒石酸或其盐的方法

<160>  1    

<170>  PatentIn version 3.1

   

<210>  1

<211>  1450

<212>  DNA

<213> 韩国假单胞菌(Pseudomonas koreensis)

<400>  1

ACGCTGGCGG CAGGCCTAAC ACATGCAAGT CGAGCGGATG AAAGGAGCTT GCTCCTGGAT     60

TCAGCGGCGG ACGGGTGAGT AATGCCTAGG AATCTGCCTG GTAGTGGGGG ACAACGTTTC     120

GAAAGGAACG CTAATACCGC ATACGTCCTA CGGGAGAAAG CAGGGGACCT TCGGGCCTTG     180

CGCTATCAGA TGAGCCTAGG TCGGATTAGC TAGTTGGTGA GGTAATGGCT CACCAAGGCG     240

ACGATCCGTA ACTGGTCTGA GAGGATGATC AGTCACACTG GAACTGAGAC ACGGTCCAGA     300

CTCCTACGGG AGGCAGCAGT GGGGAATATT GGACAATGGG CGAAAGCCTG ATCCAGCCAT     360

GCCGCGTGTG TGAAGAAGGT CTTCGGATTG TAAAGCACTT TAAGTTGGGA GGAAGGGTTG     420

TAGATTAATA CTCTGCAATT TTGACGTTAC CGACAGAATA AGCACCGGCT AACTCTGTGC     480

CAGCAGCCGC GGTAATACAG AGGGTGCAAG CGTTAATCGG AATTACTGGG CGTAAAGCGC     540

GCGTAGGTGG TTTGTTAAGT TGGATGTGAA ATCCCCGGGC TCAACCTGGG AACTGCATCC     600

AAAACTGGCA AGCTAGAGTA TGGTAGAGGG TGGTGGAATT TCCTGTGTAG CGGTGAAATG     660

CGTAGATATA GGAAGGAACA CCAGTGGCGA AGGCGACCAC CTGGACTGAT ACTGACACTG     720

AGGTGCGAAA GCGTGGGGAG CAAACAGGAT TAGATACCCT GGTAGTCCAC GCCGTAAACG     780

ATGTCAACTA GCCGTTGGGA GCCTTGAGCT CTTAGTGGCG CAGCTAACGC ATTAAGTTGA     840

CCGCCTGGGG AGTACGGCCG CAAGGTTAAA ACTCAAATGA ATTGACGGGG GCCCGCACAA     900

GCGGTGGAGC ATGTGGTTTA ATTCGAAGCA ACGCGAAGAA CCTTACCAGG CCTTGACATC     960

CAATGAACTT TCCAGAGATG GATTGGTGCC TTCGGGAGCA TTGAGACAGG TGCTGCATGG     1020

CTGTCGTCAG CTCGTGTCGT GAGATGTTGG GTTAAGTCCC GTAACGAGCG CAACCCTTGT     1080

CCTTAGTTAC CAGCACGTAA TGGTGGGCAC TCTAAGGAGA CTGCCGGTGA CAAACCGGAG     1140

GAAGGTGGGG ATGACGTCAA GTCATCATGG CCCTTACGGC CTGGGCTACA CACGTGCTAC     1200

AATGGTCGGT ACAAAGGGTT GCCAAGCCGC GAGGTGGAGC TAATCCCATA AAACCGATCG     1260

TAGTCCGGAT CGCAGTCTGC AACTCGACTG CGTGAAGTCG GAATCGCTAG TAATCGCGAA     1320

TCAGAATGTC GCGGTGAATA CGTTCCCGGG CCTTGTACAC ACCGCCCGTC ACACCATGGG     1380

AGTGGGTTGC ACCAGAAGTA GCTAGTCTAA CCTTCGGGAG GACGGTTACC ACGGTGTGAT     1440

CATGACTGGG      1450