一种含工厂下脚料羽毛粉的细菌培养基产品

摘要

本发明提供了一种含工厂下脚料羽毛粉的细菌培养基产品，该产品为工厂下脚料羽毛粉代替LB培养基中的蛋白胨研制而成，能够有效的液体摇瓶发酵模式大肠杆菌和枯草芽孢杆菌及其他革兰氏阴性和阳性细菌。产品所用羽毛粉为羽毛酸解提取部分氨基酸的工厂下脚料中和浓缩而成。其无论部分或全量代替LB培养基中的蛋白胨，均能够有效的液体发酵供试菌株。同时羽毛粉新型培养基能显著提高模式大肠杆菌和枯草芽孢杆菌稳定期时的生物量。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，提供了一种工厂下脚料羽毛粉研制的细菌培养基 产品。

背景技术

羽毛粉是羽毛经物理或化学方法加工处理后制成的粉状物质，经过处理羽毛 形态结构及化学结构发生变化，角蛋白的双键也随之发生变化，变为动物可消化 吸收的蛋白质。羽毛粉的开发研究，在国外已有50多年的历史，世界各地特别 是工业化国家已建立起各种规模的羽毛粉加工业。日本年产羽毛粉蛋白质16万 吨，美国1969年羽毛蛋白质的使用量就达18万吨。我国也开始重视羽毛蛋白资 源，大量的企业将羽毛经过各种处理后从中提取可溶性蛋白作为动物饲料。同时 有大量关于如何将羽毛酸解或高温高压水解后提取氨基酸研究的报道和相关专 利的申报，也有大量的企业利用该类技术生产氨基酸，或从中提取某些氨基酸。 但羽毛经过工厂酸水解或高温高压水解处理，提取出目标氨基酸后，会产生大量 的富含氨基酸的下脚料，如何将这些下脚料进行资源化利用成为迫切需要解决的 难题。

LB培养基被广泛用来培养细菌，其由酵母膏、蛋白胨和氯化钠组成。但是 其中蛋白胨成本较高，如果能够找到一种低价的蛋白胨替代品，则适用LB培养 基工厂化大规模液体发酵的成本将大幅降低，为企业带来更大的利润空间。

发明内容

本发明的目的在于针对LB培养基中蛋白胨成本较高和羽毛酸解提取氨基 酸后下脚料（羽毛粉）无法高效资源化利用的难题，开发出一种利用羽毛粉替代 蛋白胨的新型细菌培养基（HF），从而在高效资源化该类废弃资源的同时，降低 了细菌培养的成本。

本发明通过以下技术方案实现：

一种含羽毛粉的细菌培养基，用羽毛粉部分或全部代替LB培养基中的蛋白 胨研制而成。

其中，羽毛粉代替蛋白胨的代替量优选为10wt%～100wt%，进一步优选 50wt%～100wt%。

本发明所述羽毛粉为羽毛经过酸水解处理后，提取脯氨酸、甘氨酸和亮氨酸 中的一种或多种后，干燥成的下脚料，为粉状物质，含水量为6.6%左右，pH为 3.64。

本发明所述的细菌培养基（HF）在工厂化大规模液体发酵细菌中的应用。

有益效果

本发明提供一种工厂下脚料羽毛粉研制的新型细菌培养基，用于微生物的液 体发酵，既能为细菌的增殖提供足够的营养、增加菌体产量，同时能高效利用该 类工厂下脚料资源，减少环境污染，降低微生物发酵成本。

羽毛粉新型培养基具有以下特点：

1）羽毛粉新型培养基中羽毛粉取代蛋白胨作为氮源，羽毛粉含氮量高并且 含有种类丰富的游离氨基酸，能为微生物的生长提供充足的营养。

2）羽毛粉作为加工业的副产物，容易获得且成本较低，将羽毛粉用于微生 物的培养，高效利用了羽毛粉资源，同时也会工厂化大规模培养微生物提供了方 便，有效降低了生产成本。

附图说明

图1羽毛粉不同替代量对模式种大肠杆菌和枯草芽孢杆菌增殖的影响

A：枯草芽孢杆菌B：大肠杆菌

图2两种培养基条件下模式种大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的生长曲线

A：枯草芽孢杆菌B：大肠杆菌，其中LB代表LB培养基；HF代表羽毛粉新 型培养基。

生物材料保藏信息

NJN-6，分类命名为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis，保藏于中国微生物菌种保藏 管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生 物研究所，保藏日期为2009年7月9日，保藏编号为CGMCC No.3183。

具体实施方式

1羽毛粉所含氨基酸含量的分析

对购于新沂市汉菱生物工程有限公司的下脚料羽毛粉进行检测，含水量为 6.67%，总氮含量为17.91%，电导率为49.32ms/cm；对羽毛粉所含游离氨基酸 进行了提取并测定，提取方法参考GB/T18246-2000，测定选择氨基酸自动分析 仪Biochrom30。结果表明，羽毛粉含大量的游离氨基酸，总量达到44.31%（干 重），同时种类丰富，含常见游离氨基酸14种。

表1羽毛粉各游离氨基酸的含量

2羽毛粉代替蛋白胨培养模式细菌枯草芽孢杆菌和大肠杆菌

为验证羽毛粉代替蛋白胨制成的培养基能否有效发酵细菌，首先选择两模式 菌株枯草芽孢杆菌和大肠杆菌（图1）进行液体培养，选择比浊法在波长600nm 处比色测定菌液的吸光值。具体操作步骤如下：

1）根据LB培养基配方（每升含蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl5.0g，PH7.0）， 将培养基中的蛋白胨用羽毛粉代替，代替量：10%、25%、50%、75%、100%， PH调为7.0，设置LB培养基为对照，每个试验培养基设3个重复。

2）挑取单菌落接入LB培养基中，30℃、170r/min培养18h得到种子液， 按照1%的接种量将种子液转接至试验培养基中，30℃，170r/min培养24h。

3）依次将试验培养液稀释10倍，分别用稀释10倍的未经过培养的液体培 养基调零，在波长600nm处比色测定菌液的吸光值。

羽毛粉不同代替量对枯草芽孢杆菌菌液的吸光值影响如图1A所示，结果表 明：羽毛粉代替量在50%-100%，处理间差异不显著，但均显著高于对照CK； 羽毛粉代替量为10%、25%的两个处理的菌液的吸光值与CK的吸光值差异不显 著，说明羽毛粉可以代替蛋白胨进行枯草芽孢杆菌的培养，羽毛粉的代替量大于 50%时对枯草芽孢杆菌的增殖具有促进作用。

羽毛粉不同代替量对大肠杆菌菌液的吸光值影响如图1B所示，含羽毛粉处 理的菌液的吸光值都高于对照，其中羽毛粉代替量为10%、75%和100%的3个 处理的吸光值显著高于对照，并且代替量为100%的处理的吸光值显著高于其他 所有处理。所以羽毛粉代替蛋白胨进行大肠杆菌的培养是可行的，并且代替量为 100%时对菌体产量的增加最显著。

表2菌株编号及其基本性质

3羽毛粉代替蛋白胨培养其他革兰氏阴性细菌

为验证羽毛粉代替蛋白胨制成的培养基发酵细菌的普遍性，选择其他5株革 兰氏阴性菌进行试验，试验方法同上，其中由于菌株D-2培养的特殊性，菌液未 稀释10倍，直接测定吸光值。结果表明：羽毛粉作为一种较理想的氮源物质， 代替蛋白胨进行细菌的培养是完全可行的，羽毛粉对大部分菌株的生长具有促进 作用，另外，5株革兰氏阴性菌培养结果都表明：羽毛粉代替量在100%时，菌 液的OD值显著高于对照的，所以选择羽毛粉代替量为100%时的培养基配方为 本发明的新型培养基配方。

表3羽毛粉不同替代量培养基对革兰氏阴性菌株生长的影响

4羽毛粉代替蛋白胨培养其他革兰氏阳性细菌

为研究羽毛粉代替蛋白胨对其他革兰氏阳性细菌液体发酵的影响，选择其他 3株革兰氏阳性细菌进行培养试验，结果如表4所示：含羽毛粉的试验培养基的 吸光值几乎都高于对照，除菌株SQR9外，随着羽毛粉代替量的增加，菌液的 OD₆₀₀值在上升，说明羽毛粉对大部分革兰氏阳性细菌的生长具有促进作用，另 外当羽毛粉的代替量为100%时，菌液的的吸光值显著高于对照，据此同样选择 羽毛粉代替量为100%时的培养基配方为本发明的新型培养基配方。

表4羽毛粉不同代替量培养基对革兰氏阳性菌株生长的影响

5羽毛粉新型培养基对菌株生长过程的影响

为验证羽毛粉新型培养基是否会对细菌生长过程产生影响，选择2株模式菌 株枯草芽孢杆菌和大肠杆菌为试验对象，以LB培养基为对照，监测菌株在两种 培养基培养条件下的生长曲线。具体操作步骤如下：

挑取单菌落接入LB培养基中，30℃，170r/min培养过夜（约10h）制成种 子液，按1%的比例将种子液转接至装有液体培养基的试管中，每根试管含3ml 培养基，30℃，170r/min条件下培养。分别在2h、4h、6h、8h、10h、12h、14h、 16h、24h、28h取出试管在波长600nm处比色测定菌液的吸光值，每个处理3 个重复，根据吸光值制作生长曲线。

枯草芽孢杆菌生长曲线结果表明：在生长前期，菌株在羽毛粉新型培养基中 的生长比在LB培养基中迟缓，在12h时，菌株在羽毛粉新型培养基中的生物量 超过在LB培养基中的，并且在羽毛粉新型培养基中，枯草芽孢杆菌的对数生长 期延长，进入稳定期后，其生物量显著高于在LB培养基中的生物量，所以羽毛 粉对枯草芽孢杆菌的增殖具有促进作用。

大肠杆菌生长曲线结果表明：在两种培养基中，大肠杆菌的生长趋势基本一 致，两者到达稳定期的时间基本相同。在生长前期，菌株在羽毛粉新型培养基中 的生长比在LB培养基中稍延迟，在8h后，菌株在羽毛粉新型培养基中的生物 量超过在LB培养基中的，并且在稳定期，大肠杆菌在羽毛粉新型培养基中的生 物量显著高于在LB培养基中的生物量。

综上所述，羽毛粉新型培养基用于培养微生物是可行的，不会对菌株生长产 生不利影响，并且在菌株生长后期，羽毛粉对菌株增殖的促进作用较显著。

实施例中使用的羽毛粉为羽毛酸解提取氨基酸后的工厂下脚料，购于新沂市 汉菱生物工程有限公司，含大量的游离氨基酸且种类丰富。

实施例中使用的供试菌株为4株革兰氏阳性菌和6株革兰氏阴性菌，包含模式 种大肠杆菌和枯草芽孢杆菌。具体如下：

Pigmentiphaga sp.D-2，革兰氏阴性细菌，具有降解啶虫脒的功能（Hongxing  Yang,Xiang Wang,Jie Zheng,Guangli Wang,Qing Hong,Shunpeng Li,Rong Li, Jiandong Jiang.Biodegradation of acetamiprid by Pigmentiphaga sp.D-2and the  degradation pathway.International Biodeterioration and Biodegradation,2013,85: 95-102）。

Burkholderia sp.AM70（伯克霍尔德氏菌属）,革兰氏阴性细菌，具有降解 阿维菌素的功能（李荣，管晓进，陈荣宗，朱彬，Shinawar Waseem Ali1， 李顺鹏，蒋建东.阿维菌素降解菌株AW70的分离鉴定及降解特性研究.土壤, 2009,41(4):607～611）。

Arthrobacter sp.scl-2(节杆菌属)，革兰氏阳性细菌，具有降解有机磷农药 的功能（Li,Rong,Xinqiang Guo,Kai Chen,Jianchun Zhu,Shunpeng Li,and  Jiandong Jiang.Isolation of an isocarbophos-degrading strain of Arthrobacter sp.scl-2 and identification of the degradation pathway.J.Microbiol.Biotechnol.2009,19(11), 1439-1446）。

Pseudomonas putida KT2440和Escherichia coli DH5αλpir为模式菌株，革兰氏 阴性（Rong Li,Guangli Wang,Bin Shen,Rong Wang,Yao Song,Shunpeng Li, Jiandong Jiang.Random transposon vectors pUTTns for the markerless integration of  exogenous genes into gram-negative eubacteria chromosomes.Journal of  Microbiological Methods79(2009)220-226）。

Bacillus subtilis168为模式菌株，革兰氏阳性细菌（张晓舟，博士论文，枯 草杆菌新型表达系统和遗传操作体系的建立及应用）。

Paracoccus sp.Lgjj-3(副球菌属)，革兰氏阴性细菌（Rong Li,Jingwei Zheng, Rong Wang,Yao Song,Qiming Chen,Xiujuan Yang,Shunpeng Li,Jiandong Jiang. Biochemical degradation pathway of dimethoate by Paracoccus sp.Lgjj-3isolated  from treatment wastewater.International Biodeterioration and Biodegradation,2010, 64:51-57）。

Diaphorobacter sp.TPD-1（戴尔福特菌属），革兰氏阴性细菌，具降解三唑 磷能力（Chengli Yang,Rong Li,Yao Song,Kai Chen,Shunpeng Li,Jiandong Jiang. Identification of the biochemical degradation pathway of triazophos and its  intermediate in Diaphorobacter sp.TPD-1.Current Microbiology,2011, 62:1294-1301）。

Bacillus amyloliquefaciens NJN-6，为植物根际促生菌，分别分离至香蕉根际 土壤。染色阳性，专利寄存于中国微生物菌种保存管理委员会普通微生物中心， 菌种保藏号为CGMCC NO.3183（见授权发明专利ZL200910183361.3，防除连作 香蕉巴拿马枯萎病的拮抗菌及其微生物有机肥料。）。

Bacillus amyloliquefaciens SQR9为植物根际促生菌，分离至黄瓜根际土壤 （Jun Weng,Yang Wang,Juan Li,Qirong Shen,Ruifu Zhang.Enhanced root  colonization and biocontrol activity of Bacillus amyloliquefaciens SQR9by abrB  gene disruption.Appl Microbiol Biotechnol(2013)97:8823–8830）。

以上使用的微生物只是为了举例说明本发明培养基的效果，不应该因此而限 定本发明的保护范围。凡是适用于使用LB培养基进行培养的微生物，均适用于 本发明提供的细菌培养基。