一类具有双重功能的齐墩果酸类衍生物及其制备方法和应用

摘要

本发明公开了一类具有双重功能的齐墩果酸类衍生物及其制备方法和应用，该齐墩果酸类衍生物包括吡唑、异噁唑类齐墩果酸衍生物，喹喔啉类齐墩果酸衍生物，噁唑、噻唑类齐墩果酸衍生物以及吡喃类齐墩果酸衍生物。本发明的齐墩果酸类衍生物，具有抗炎，抗病毒、抗肿瘤，调节免疫功能，抑制血小板凝集等重要的生物医学活性，在制备用于治疗骨质疏松药物中的具有广泛的用途。本发明的齐墩果酸类衍生物的制备方法，通过在齐墩果酸A环引入如喹喔啉，吡唑，异噁唑，噻唑，吡喃环等不同的杂环体系和28位引入不同的取代基，成功制备出一类具有抑制破骨细胞生成及骨吸收活性，促进骨形成活性的双重特性的新型抗骨质疏松齐墩果酸类衍生物，具有很好的实用性。

说明书

技术领域

本发明属于化学与医药技术领域，具体涉及一类具有双重功能的齐墩果酸类衍生物 及其制备方法和应用。

背景技术

骨质疏松症(Osteoporosis)被称为无声无息的流行病，是以骨组织显微结构受损、 骨矿成分和骨基质等比例的不断减少、骨质变薄、骨小梁数减少、骨脆性增加和骨折危 险度升高的一种全身骨代谢障碍疾病。WHO统计表明，目前世界范围内骨质疏松症患 者总数超过2亿人，主要为绝经和老年相关的原发性骨质疏松。每年的10月20日为" 国际骨质疏松日"。骨质疏松症被公认为仅次于心血管疾病的第二大健康杀手，一旦患病 需要长期治疗。

目前骨质疏松治疗药可以从抑制骨吸收和促进骨形成两个方面进行，但是目前主要 是以抑制骨吸收为主。由于绝经等原因造成的雌激素急剧下降引起的女性骨质疏松占患 者的大部分，雌激素是最合适的药物，但有严重的雌激素样副作用，这也是许多女性患 者拒绝使用此类药物的原因；钙制剂对骨质疏松症引起的骨折没有疗效；双膦酸盐为目 前临床一线用药，但长期应用会可过度抑制骨转换，影响骨强度；降钙素、氟化物、雷 洛昔芬等，或价格昂贵、或远期疗效不确切，均不够理想。遗憾的是目前具有促进骨形 成作用的临床药物只有一个甲状旁腺素(PTH1–34)，但必须皮下给药，而且仅能使用 24个月，会引起骨肉瘤的增加，此外不能用于高钙血症、甲状腺功能亢进及Paget病患 者。另外目前还没有兼具抑制骨吸收、促进骨形成双重作用的药物。虽有报道雷尼酸锶 (骨吸收抑制剂)具有促进骨形成的报道，但是动物体内试验证实无该作用。由于一直 认为原发性骨质疏松关联的骨量减少无法恢复，因此发现促进骨形成或具有双重作用的 新型分子具有重大的意义。

发明内容

发明目的：针对上述现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一类具有双重功 能的齐墩果酸类衍生物，使其具有抗炎，抗病毒、抗肿瘤，调节免疫功能，抑制血小板 凝集等重要的生物医学活性。本发明的另一目的是提供一种制备上述齐墩果酸类衍生物 的方法，通过在齐墩果酸A环引入如喹喔啉，吡唑，异噁唑，噻唑，吡喃环等不同的杂 环体系和28位引入不同的取代基，提供一类具有抑制破骨细胞生成及骨吸收活性，促 进骨形成活性的双重特性的新型抗骨质疏松齐墩果酸类衍生物。本发明还有一目的是提 供一种上述齐墩果酸类衍生物在制备用于治疗骨质疏松药物中的应用。

技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：

一类具有双重功能的齐墩果酸类衍生物，为如下结构通式中任意一个：

R¹选自下列基团：

HNCH₂COOCH₃等氨基酸，等；

Het选自下列基团：

其中， R²选自基团：-CH₃，R³、R⁴、R⁵和R⁶均选自基团： H，I，Br，OH，℃H₂CH₂CH₂OH，NO₂，NH₂等；R⁷和R⁸均选自和等；R⁹和R¹⁰均选自和等。

一种制备齐墩果酸类衍生物的方法，反应式如下：

首先以齐墩果酸(OA)为母体，利用钨酸钠双氧水体系氧化合成3-羰基齐墩果酸 (A)，然后在甲醇钠作用下与甲酸乙酯反应合成关键中间体2-醛基-3-羰基齐墩果酸 (B)；化合物(B)分别与羟胺和肼关环生成异噁唑齐墩果酸(1)与吡唑齐墩果酸(2)； 化合物(1)先与二氯亚砜反应生成酰氯，后与一系列胺类化合物分别反应生成异噁唑 类齐墩果酸衍生物(C)；吡唑齐墩果酸(2)与二氯亚砜反应生成酰氯，后与一系列胺 类化合物分别反应生成得吡唑类齐墩果酸衍生物(D)；(D)与一系列磺酰氯或碘甲烷 分别反应得到衍生物(E)；其中，所制备的齐墩果酸类衍生物为吡唑、异噁唑类齐墩果 酸衍生物。

一种制备齐墩果酸类衍生物的方法，反应式如下：

以齐墩果酸(OA)为母体，利用钨酸钠双氧水体系氧化合成3-羰基齐墩果酸(A)， 然后在叔丁醇钾/叔丁醇体系中氧化成2，3-二羰基齐墩果酸(B)；化合物(B)分别与 邻苯二胺类化合物关环生成苯环带有不同取代基的齐墩果酸(G)；化合物(G)先与草 酰氯反应生成酰氯，后与一系列胺类以及醇类化合物分别反应生成苯环带有不同取代基 的齐墩果酸衍生物(H)。其中，所制备的齐墩果酸类衍生物为喹喔啉类齐墩果酸衍生物。

一种制备齐墩果酸类衍生物的方法，反应式如下：

首先以3-羰基齐墩果酸(A)为母体，在乙醚中与5，5-二溴-2，2-二甲基-4，6-二 酮-1，3-二氧杂环己烷反应合成化合物(I)。(I)与硫脲关环生成化合物(J)，化合物(J) 先与草酰氯反应生成酰氯，后与一系列胺类以及醇类化合物分别反应生成苯环带有不同 取代基的齐墩果酸衍生物(K)。其中，所制备的齐墩果酸类衍生物为噁唑、噻唑类齐墩 果酸衍生物。

一种制备齐墩果酸类衍生物的方法，反应式如下：

化合物(F)与三苯基甲基碘化磷经wittig反应制得化合物(L)，(L)分别与烯烃 和炔烃经Diels-Alder环加成反应生成二氢吡喃和吡喃类齐墩果酸(M)与(N)，化合物 (M)，(N)再分别先与二氯亚砜反应生成酰氯，后与一系列胺类类化合物反应生成二 氢吡喃和吡喃类齐墩果酸衍生物(O)，(P)。其中，所制备的齐墩果酸类衍生物为吡喃 类齐墩果酸衍生物。

所述的齐墩果酸类衍生物在制备抗炎或抗病毒或抗肿瘤或调节免疫力或抑制血小 板凝集或治疗骨质疏松药物中的应用。

有益效果：与现有技术相比，本发明的齐墩果酸类衍生物，具有抗炎，抗病毒、抗 肿瘤，调节免疫功能，抑制血小板凝集等重要的生物医学活性，在制备用于治疗骨质疏 松药物中的具有广泛的用途。本发明的齐墩果酸类衍生物的制备方法，通过在齐墩果酸 A环引入如喹喔啉，吡唑，异噁唑，噻唑，吡喃环等不同的杂环体系和28位引入不同 的取代基，成功制备出一类具有抑制破骨细胞生成及骨吸收活性，促进骨形成活性的双 重特性的新型抗骨质疏松齐墩果酸类衍生物，具有很好的实用性。

附图说明

图1和图2均是化合物促进类成骨细胞增殖实验结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。

实施例1

1、化合物1的制备，反应式为：

化合物A的制备

Na₂HPO₄·12H₂O(1.7g，4.8mmol)与NaH₂PO₄·2H₂O(0.75g，4.8mmol)充分溶于 95mL水中，制得磷酸盐缓冲溶液。将Na₂WO₄·2H₂O(4g，12mmol)溶于35％aqH₂O₂(28mL)中，并加入磷酸盐缓冲溶液中。于500mL圆底烧瓶中加入OA(11g，24mmol) 与DMF(50mL)，并加热至90℃，逐滴加入上述Na₂WO₄-H₂O₂磷酸盐缓冲溶液，然 后搅拌反应1小时。反应结束后冷却至室温，乙酸乙酯萃取(100mL×3)，合并有机相， 无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩得化合物A(9.8g，89％)。

化合物B的制备

250mL圆底烧瓶加入化合物A(9.0g，20mmol)，甲苯(100mL)。缓慢加入甲醇钠 (2.8g，50mmol)，室温搅拌3小时后加入甲酸乙酯(4.5g，50mmol)，反应过夜。除去 甲苯，加入1M HCl(200mL)，乙酸乙酯萃取(200mL×3)合并有机相，无水硫酸钠干 燥，过滤，浓缩得化合物B(9.2g，95％)。

化合物1的制备

100mL圆底烧瓶中加入B(1.0g，2.1mmol)，无水乙醇(40mL)和盐酸羟胺(0.2g， 2.9mmol)；回流反应4小时，冷却至室温，除去溶剂，加入饱和NaCl溶液(50mL)， 乙酸乙酯萃取(50mL×3)合并有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩得化合物1(0.9g， 92％)。

2、化合物2的制备，反应式为：

250mL圆底烧瓶中加入B(8.0g，16.8mmol)，无水乙醇(120mL)和盐酸肼(1.6g， 17.4mmol)。回流4小时，冷却，除去溶剂，加入饱和NaCl溶液(150mL)，乙酸乙酯 萃取(150mL×3)合并有机相，干燥，过滤，浓缩得化合物得化合物2(7.0g，90％)。

3、化合物3的制备，反应式为：

25mL圆底烧瓶中加入化合物B(0.1g，0.2mmol)，二氯亚砜(1.0mL)，常温搅拌2 小时后，除去二氯亚砜，加入三乙胺(0.1mL)，二氯甲烷(10mL)，苄胺(32.0mg，0.3mmol)， 常温搅拌2小时。加入饱和氯化铵溶液(20mL)，二氯甲烷萃取(15mL×3)，干燥，过 滤，浓缩，柱层析(乙酸乙酯/石油醚＝4/1)得化合物3(86.0mg，76％)。

4、化合物4的制备，反应式为：

100mL圆底烧瓶中加入化合物B(1.0g，2.0mmol)，二氯亚砜(5.0mL)，常温搅拌 2小时后，除去二氯亚砜，加入三乙胺(1mL)，二氯甲烷(50mL)，苄胺(0.3g，3mmol)， 常温搅拌2小时。加入饱和氯化铵溶液(50mL)，二氯甲烷萃取(30mL×3)，无水硫酸 钠干燥，过滤，浓缩，柱层析(乙酸乙酯/石油醚＝4/1)得化合物4(0.8g，70％)。

5、化合物5的制备，反应式为：

25mL圆底烧瓶中加入化合物4(0.1g，0.2mmol)，碳酸钾(40mg，0.3mmol)，DMF (10mL)，常温搅拌1小时加入碘甲烷(0.2mL)，反应2小时。加入饱和氯化铵溶液 (20mL)，乙酸乙酯萃取(15mL×3)，干燥，过滤，浓缩，柱层析(乙酸乙酯/石油醚＝1/2) 得化合物5(90.0mg，85％)。

6、化合物6的制备，反应式为：

25mL圆底烧瓶中加入化合物4(0.1g，0.2mmol)，三乙胺(0.1mL)，对氯苯磺酰 氯(60mg，0.3mmol)和二氯甲烷(15mL)，反应0.5小时。加入饱和氯化铵溶液(20mL)， 二氯甲烷萃取(15mL×3)，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，柱层析(乙酸乙酯/石油醚 ＝1/5)得化合物6(135.0mg，91％)。

7、化合物7的制备，反应式为：

25mL圆底烧瓶中加入化合物1(0.1g，0.2mmol)，二氯亚砜(1.0mL)，常温搅拌2 小时后，除去二氯亚砜，加入三乙胺(0.1mL)，二氯甲烷(10mL)，3-吗啉丙胺(42.0mg， 0.3mmol)，常温搅拌2小时。加入饱和氯化铵溶液(20mL)，二氯甲烷萃取(15mL×3)， 干燥，过滤，浓缩，柱层析(二氯甲烷/甲醇＝20/1)得化合物7(85.0mg，70％)。

8、化合物8的制备，反应式为：

100mL圆底烧瓶中加入化合物2(2.0g，4.0mmol)，二氯亚砜(10mL)，常温搅拌 2小时后，除去二氯亚砜，加入三乙胺(2.0mL)，二氯甲烷(40mL)，3-吗啉丙胺(0.9g， 6.0mmol)，常温搅拌3小时。加入饱和氯化铵溶液(50mL)，二氯甲烷萃取(30mL×3)， 无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，柱层析(二氯甲烷/甲醇＝20/1)得化合物8(1.8g，75％)。

9、化合物9、10、11、12、13、14的制备，反应式为：

化合物9的制备

25mL圆底烧瓶中加入化合物8(0.1g，0.2mmol)，三乙胺(0.1mL)，对氯苯磺酰 氯(60mg，0.3mmol)和二氯甲烷(15mL)，反应0.5小时。加入饱和氯化铵溶液(20mL)， 二氯甲烷萃取(15mL×3)，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，柱层析(二氯甲烷/甲醇＝15/1) 得化合物9(115.0mg，92％)。

化合物10的制备 与化合物9制备方法相同，化合物8与3，5-二甲基-4-磺酰氯异噁唑(60mg，0.3mmol) 反应得化合物10(116.0mg，90％)。

化合物11的制备

与化合物9制备方法相同，化合物8与3，4-二甲氧基苯磺酰氯(70mg，0.3mmol) 反应得化合物11(120.0mg，90％)。

化合物12的制备

与化合物9制备方法相同，化合物8与对氟苯磺酰氯(60mg，0.3mmol)反应得化 合物12(106.0mg，82％)。

化合物13的制备

与化合物9制备方法相同，化合物8与对叔丁基苯磺酰氯(70mg，0.3mmol)反应 得化合物13(116.0mg，85％)。

化合物14的制备

与化合物9制备方法相同，化合物8与对三氟甲基苯磺酰氯(70mg，0.3mmol)反 应得化合物14(110.0mg，80％)。

10、化合物15的制备，反应式为：

25mL圆底烧瓶中加入化合物1(0.1g，0.2mmol)，二氯亚砜(1.0mL)，常温搅拌2 小时后，除去二氯亚砜，加入三乙胺(0.1mL)，二氯甲烷(10mL)，2-哌啶乙胺(40.0mg， 0.3mmol)，常温搅拌2小时。加入饱和氯化铵溶液(20mL)，二氯甲烷萃取(15mL×3)， 无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，柱层析(二氯甲烷/甲醇＝20/1)得化合物15(82.0mg， 70％)。

11、化合物16的制备，反应式为：

100mL圆底烧瓶中加入化合物2(2.0g，4.0mmol)，二氯亚砜(10mL)，常温搅拌 2小时后，除去二氯亚砜，加入三乙胺(2mL)，二氯甲烷(40mL)，2-哌啶乙胺(0.8g， 6.0mmol)，常温搅拌2小时。加入饱和氯化铵溶液(50mL)，二氯甲烷萃取(50mL×3)， 无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，柱层析(二氯甲烷/甲醇＝20/1)得化合物16(1.6g，68％)。

12、化合物17-26的制备，反应式为：

化合物17的制备

25mL圆底烧瓶中加入化合物16(0.1g，0.2mmol)，三乙胺(0.1mL)，3，4-二甲氧 基苯磺酰氯(70mg，0.3mmol)和二氯甲烷(15mL)，反应0.5小时。加入饱和氯化铵 溶液(20mL)，二氯甲烷萃取(15mL×3)，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，柱层析(二 氯甲烷/甲醇＝15/1)得化合物17(120.0mg，87％)。

化合物18的制备

与化合物17制备方法相同，化合物16与对氯基苯磺酰氯(65mg，0.3mmol)反应 得化合物18(116.0mg，85％)。

化合物19的制备

与化合物17制备方法相同，化合物16与对甲氧基苯磺酰氯(65mg，0.3mmol)反 应得化合物19(122.0mg，90％)。

化合物20的制备

与化合物17制备方法相同，化合物16与对叔丁基基苯磺酰氯(75mg，0.3mmol) 反应得化合物20(124.0mg，88％)。

化合物21的制备

与化合物17制备方法相同，化合物16与3，5-二甲基-4-磺酰氯异噁唑(60mg， 0.3mmol)反应得化合物21(100.0mg，75％)。

化合物22的制备

与化合物17制备方法相同，化合物16与1-甲基-4-磺酰氯咪唑(55mg，0.3mmol) 反应得化合物22(99.0mg，75％)。

化合物23的制备

与化合物17制备方法相同，化合物16与对三氟甲氧基磺酰氯(80mg，0.3mmol) 反应得化合物23.(125.0mg，84％)。

化合物24的制备

与化合物17制备方法相同，化合物16与对三氟甲氧基磺酰氯(75mg，0.3mmol) 反应得化合物24.(120.0mg，85％)。

化合物25的制备

与化合物17制备方法相同，化合物16与对三氟磺酰氯(73mg，0.3mmol)反应得 化合物25(107.0mg，80％)。

化合物26的制备

与化合物17制备方法相同，化合物16与对间甲基磺酰氯(72mg，0.3mmol)反应 得化合物26.(116.0mg，87％)。

13、化合物27的制备，反应式为：

25mL圆底烧瓶中加入化合物1(0.1g，0.2mmol)，二氯亚砜(1.0mL)，常温搅拌2 小时后，除去二氯亚砜，加入三乙胺(0.1mL)，二氯甲烷(10mL)，1-苄基-4-氨基-哌 啶(57.0mg，0.3mmol)，常温搅拌2小时。加入饱和氯化铵溶液(20mL)，二氯甲烷萃 取(15mL×3)，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，柱层析(二氯甲烷/甲醇＝20/1)得化合 物27.(97.0mg，75％)。

14、化合物28的制备，反应式为：

100mL圆底烧瓶中加入化合物1(2.0g，4.0mmol)，二氯亚砜(10mL)，常温搅拌 2小时后，除去二氯亚砜，加入三乙胺(2mL)，二氯甲烷(40mL)，1-苄基-4-氨基-哌 啶(1.1g，6.0mmol)，常温搅拌2小时。加入饱和氯化铵溶液(50mL)，二氯甲烷萃取 (50mL×3)，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，柱层析(二氯甲烷/甲醇＝20/1)得化合物 28(1.5g，59％)。

15、化合物29-38的制备，反应式为：

化合物29的制备

25mL圆底烧瓶中加入化合物28(0.1g，0.2mmol)，三乙胺(0.1mL)，对三氟磺酰 氯(73mg，0.3mmol)和二氯甲烷(15mL)，反应0.5小时。加入饱和氯化铵溶液(20mL)， 二氯甲烷萃取(15mL×3)，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，柱层析(二氯甲烷/甲醇＝15/1) 得化合物29(113.0mg，82％)。

化合物30的制备

与化合物29制备方法相同，化合物28与对氯苯磺酰氯(65mg，0.3mmol)反应得 化合物30(114.0mg，84％)。

化合物31的制备

与化合物29制备方法相同，化合物28与对溴苯磺酰氯(70mg，0.3mmol)反应得 化合物31(110.0mg，80％)。

化合物32的制备

与化合物29制备方法相同，化合物28与对叔丁基苯磺酰氯(75mg，0.3mmol)反 应得化合物32(108.0mg，80％)。

化合物33的制备

与化合物29制备方法相同，化合物28与对三氟甲氧基磺酰氯(75mg，0.3mmol) 反应得化合物33(112.0mg，82％)。

化合物34的制备

与化合物29制备方法相同，化合物28与对三氟甲氧基磺酰氯(80mg，0.3mmol) 反应得化合物34(110.0mg，79％)。

化合物35的制备

与化合物29制备方法相同，化合物28与对甲氧基苯磺酰氯(65mg，0.3mmol)反 应得化合物35(117.0mg，89％)。

化合物36的制备

与化合物29制备方法相同，化合物28与3，4-二甲氧基苯磺酰氯(70mg，0.3mmol) 反应得化合物36(116.0mg，86％)。

化合物37的制备

与化合物29制备方法相同，化合物28与3，5-二甲基-4-磺酰氯异噁唑(60mg， 0.3mmol)反应得化合物37(100.0mg，78％)。

化合物38的制备

与化合物29制备方法相同，化合物28与1-甲基-4-磺酰氯咪唑(55mg，0.3mmol) 反应得化合物38(90.0mg，72％)。

16、化合物39的制备，反应式为：

化合物C的制备

250mL三井瓶中加入化合物A(9.08g，20mmol)，叔丁醇(100mL)，叔丁醇钾(13.4g， 120mmol)，四氢呋喃(12mL)，40℃下反应小时，浓缩，200mL乙酸乙酯溶解，1M盐 酸洗涤(200mL×3)，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，柱层析(石油 醚/乙酸乙酯＝8/1)，得化合物C(7.96g，85％)。

化合物39的制备

250mL圆底烧瓶中加入化合物C(4.68g，10mmol)，邻苯二胺(1.08g，10mmol)， 无水乙醇(100mL)，80℃下回流8h，浓缩，100mL二氯甲烷溶解，1M盐酸洗涤 (100mL×3)，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，柱层析(石油醚/乙酸 乙酯＝4/1)，得化合物39(4.91g，91％)。

17、化合物40-43的制备，反应式为：

化合物40的制备

25mL圆底烧瓶中加入化合物C(468mg，1mmol)，4-碘-邻苯二胺(234mg，1mmol)， 无水乙醇(10mL)，80℃下回流8h，浓缩，20mL二氯甲烷溶解，依次用1M盐酸和饱 和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，柱层析(石油醚/乙酸乙酯＝4/1)，得化 合物40(500mg，75％)。

化合物41的制备

与化合物40制备方法相同，化合物C与4-溴-邻苯二胺(186mg，1mmol)反应得 化合物41(513mg，92％)。

化合物42的制备

与化合物40制备方法相同，化合物C与4-硝基-邻苯二胺(3.06g，20mmol)反应 得化合物42(9.82g，84％)。

化合物43的制备

与化合物40制备方法相同，化合物C与4-羟基-邻苯二胺(124mg，1mmol)反应 得化合物43(422mg，76％)。

18、化合物44的制备，反应式为：

25mL圆底烧瓶中加入化合物42(292mg，0.5mmol)，还原铁粉(168mg，3mmol)， 甲醇(10mL)，水(2mL)，浓盐酸(1mL)，65℃下回流2h，浓缩，50mL二氯甲烷溶 解，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，柱层析(二氯甲烷/甲醇＝100/1)， 得化合物44(439mL，79％)。

19、化合物45的制备，反应式为：

10mL圆底烧瓶中加入化合物40(333mg，0.5mmol)，二氯甲烷(5.0mL)，草酰氯 (120μl，1.25mmol)常温搅拌24小时后，除去草酰氯，二氯甲烷(5mL)，加入三乙胺 (315μl，2.25mmol)，甘氨酸甲酯盐酸盐(69mg，0.55mmol)，常温搅拌8小时。加入 二氯甲烷稀释(30mL)，依次用1M盐酸和饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤， 浓缩，柱层析(石油醚/乙酸乙酯＝4/1)得化合物45(247mg，67％)。

20、化合物46的制备，反应式为：

10mL圆底烧瓶中加入化合物41(309mg，0.5mmol)，二氯甲烷(5.0mL)，草酰氯 (120μl，1.25mmol)常温搅拌24小时后，除去草酰氯，二氯甲烷(5mL)，加入三乙胺 (315μl，2.25mmol)，甘氨酸甲酯盐酸盐(69mg，0.55mmol)，常温搅拌8小时。加入 二氯甲烷稀释(30mL)，依次用1M盐酸和饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤， 浓缩，柱层析(石油醚/乙酸乙酯＝4/1)得化合物46(269mg，78％)。

21、化合物47-a与47-b的制备，反应式为：

25mL圆底烧瓶中加入化合物43(2.78g，5mmol)，二氯甲烷(100mL)，草酰氯(1.2mL， 12.5mmol)常温搅拌24小时后，除去草酰氯，二氯甲烷(100mL)，加入三乙胺(3.15mL， 22.5mmol)，甘氨酸甲酯盐酸盐(690mg，5.5mmol)，常温搅拌8小时。加入二氯甲烷 稀释(200mL)，依次用1M盐酸和饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，柱 层析(石油醚/乙酸乙酯＝4/1)得化合物47-a和47-b(2.35g，74％)。

22、化合物48-56的制备，反应式为：

化合物48的制备

25mL圆底烧瓶中加入化合物39(540mg，1mmol)，二氯甲烷(10mL)，草酰氯(240μl， 2.5mmol)常温搅拌24小时后，除去草酰氯，二氯甲烷(10mL)，加入三乙胺(625μl， 4.5mmol)，4-吗啉丙胺(151mg，1.05mmol)，常温搅拌8小时。加入二氯甲烷稀释 (100mL)，依次用1M盐酸和饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，柱层析 (二氯甲烷/甲醇＝50/1)得化合物48(628mg，94％)。

化合物49的制备

与化合物48制备方法相同，化合物39与1-哌啶乙胺(135mg，1.05mmol)反应得 化合物49(628mg，87％)。

化合物50的制备

与化合物48制备方法相同，化合物39与4-氨基-1-苄基哌啶(200mg，1.05mmol)， 反应得化合物50(576mg，81％)。

化合物51的制备

与化合物48制备方法相同，化合物39与4-(2-氨基乙基)-1-苄基哌啶(229mg， 1.05mmol)反应得化合物51(637mg，86％)。

化合物52的制备

与化合物48制备方法相同，化合物39与1-氨基高哌啶(120mg，1.05mmol)反应 得化合物52(447mg，86％)。

化合物53的制备

与化合物48制备方法相同，化合物39与3-氨基奎宁环二盐酸盐(209mg， 1.05mmol)，反应得化合物53(492mg，76％)。

化合物54的制备

与化合物48制备方法相同，化合物39与2-氨基噻唑(105mg，1.05mmol)，反应 得化合物54(292mg，47％)。

化合物55的制备

与化合物48制备方法相同，化合物39与2-氨基噻唑(165mg，1.05mmol)反应得 化合物55(632mg，98％)。

化合物56的制备

与化合物48制备方法相同，化合物39与1-乙基-3-羟基-四氢吡咯(138mg，1.2mmol) 反应得化合物56(305mg，48％)。

23、化合物57-65的制备，反应式为：

化合物57的制备

25mL圆底烧瓶中加入化合物42(585mg，1mmol)，二氯甲烷(10mL)，草酰氯(240μl， 2.5mmol)常温搅拌24小时后，除去草酰氯，二氯甲烷(10mL)，加入三乙胺(625μl， 4.5mmol)，甘氨酸甲酯盐酸盐(132mg，1.05mmol)，常温搅拌8小时。加入二氯甲烷 稀释(100mL)，依次用1M盐酸和饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，柱 层析(石油醚/乙酸乙酯＝4/1)得化合物57(607mg，92％)。

化合物58的制备

与化合物57制备方法相同，化合物39与4-吗啉丙胺(151mg，1.05mmol)反应得 化合物58(609mg，86％)。

化合物59的制备

与化合物57制备方法相同，化合物39与1-哌啶乙胺(135mg，1.05mmol)，反应 得化合物59(638mg，92％)。

化合物60的制备

与化合物57制备方法相同，化合物39与4-氨基-1-苄基哌啶(200mg，1.05mmol) 反应得化合物60(634mg，84％)。

化合物61的制备

与化合物57制备方法相同，化合物39与4-(2-氨基乙基)-1-苄基哌啶(229mg， 1.05mmol)反应得化合物61(710mg，90％)。

化合物62的制备

与化合物57制备方法相同，化合物39与1-氨基高哌啶(120mg，1.05mmol)反应 得化合物62(447mg，66％)。

化合物63的制备

与化合物57制备方法相同，化合物39与3-氨基奎宁环二盐酸盐(209mg，1.05mmol) 反应得化合物63(168mg，24％)。

化合物64的制备

与化合物57制备方法相同，化合物39与2-氨基噻唑(105mg，1.05mmol)反应得 化合物64(240mg，36％)。

化合物65的制备

与化合物57制备方法相同，化合物39与2-氨基噻唑(165mg，1.05mmol)反应得 化合物65(550mg，80％)。

24、化合物66的制备，反应式为：

25mL圆底烧瓶中加入化合物57(66mg，0.1mmol)，Pd/C(20mg)，甲醇(15mL)， 氢气氛围，室温下16h，过滤，浓缩，50mL二氯甲烷溶解，饱和食盐水洗涤，干燥， 过滤，浓缩，制备薄层层析(二氯甲烷/甲醇＝20/1)，得化合物66(51mg，81％)。

25、化合物67的制备，反应式为：

25mL圆底烧瓶中加入化合物58(72mg，0.1mmol)，Pd/C(20mg)，甲醇(15mL)， 氢气氛围，室温下16h，过滤，浓缩，50mL二氯甲烷溶解，饱和食盐水洗涤，无水硫 酸钠干燥，过滤，浓缩，制备薄层层析(二氯甲烷/甲醇＝20/1)，得化合物67(62mg， 91％)。

26、化合物68的制备，反应式为：

25mL圆底烧瓶中加入化合物59(70mg，0.1mmol)，Pd/C(10mg)，甲醇(15mL)， 氢气氛围，室温下16h，过滤，浓缩，50mL二氯甲烷溶解，饱和食盐水洗涤，无水硫 酸钠干燥，过滤，浓缩，制备薄层层析(二氯甲烷/甲醇＝20/1)，得化合物68(55mg， 82％)。

27、化合物69的制备，反应式为：

25mL圆底烧瓶中加入化合物60(76mg，0.1mmol)，Pd/C(10mg)，甲醇(15mL)， 氢气氛围，室温下16h，过滤，浓缩，50mL二氯甲烷溶解，饱和食盐水洗涤，无水硫 酸钠干燥，过滤，浓缩，制备薄层层析(二氯甲烷/甲醇＝20/1)，得化合物69(21mg， 29％)。

28、化合物70的制备，反应式为：

25mL圆底烧瓶中加入化合物61(79mg，0.1mmol)，Pd/C(10mg)，甲醇(15mL)， 氢气氛围，室温下16h，过滤，浓缩，50mL二氯甲烷溶解，饱和食盐水洗涤，无水硫 酸钠干燥，过滤，浓缩，制备薄层层析(二氯甲烷/甲醇＝20/1)，得化合物70(20mg， 26％)。

29、化合物71的制备，反应式为：

25mL圆底烧瓶中加入化合物62(68mg，0.1mmol)，Pd/C(10mg)，甲醇(15mL)， 室温下16h，浓缩，50mL二氯甲烷溶解，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤， 浓缩，制备薄层层析(二氯甲烷/甲醇＝20/1)，得化合物71(51mg，78％)。

30、化合物72的制备，反应式为：

25mL圆底烧瓶中加入化合物63(70mg，0.1mmol)，Pd/C(10mg)，甲醇(15mL)， 室温下16h，过滤，浓缩，50mL二氯甲烷溶解，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥， 过滤，浓缩，制备薄层层析(二氯甲烷/甲醇＝20/1)，得化合物72(38mg，57％)。

31、化合物73的制备，反应式为：

25mL圆底烧瓶中加入化合物64(67mg，0.1mmol)，Pd/C(10mg)，甲醇(15mL)， 室温下16h，过滤，浓缩，50mL二氯甲烷溶解，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥， 过滤，浓缩，制备薄层层析(二氯甲烷/甲醇＝20/1)，得化合物73(40mg，63％)。

32、化合物74的制备，反应式为：

25mL圆底烧瓶中加入化合物65(69mg，0.1mmol)，Pd/C(10mg)，甲醇(15mL)， 室温下16h，过滤，浓缩，50mL二氯甲烷溶解，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥， 过滤，浓缩，制备薄层层析(石油醚/乙酸乙酯＝4/1)，得化合物74(33mg，50％)。

33、化合物75、76的制备，反应式为：

化合物75的制备

10mL圆底烧瓶中加入化合物A(91mg，0.2mmol)，二氯甲烷(4.0mL)，草酰氯(40μl， 0.5mmol)常温搅拌24小时后，除去草酰氯，二氯甲烷(4.0mL)，加入三乙胺(60μl， 0.9mmol)，1-哌啶乙胺(27mg，0.21mmol)，常温搅拌8小时。加入二氯甲烷稀释(20mL)， 依次用1M盐酸和饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，柱层析(二氯甲烷 /甲醇＝100/1)得化合物75(72mg，64％)。

化合物76的制备

与化合物75制备方法相同，化合物39与4-(2-氨基乙基)-1-苄基哌啶(46mg， 0.21mmol)反应得化合物76(76mg，58％)。

34、化合物77的制备，反应式为：

25mL圆底烧瓶中加入化合物47-a(62.8mg，0.1mmol)，碳酸钾(27.6mg，0.2mmol)， 碘化钠(1.5mg，0.01mmol)，3-溴-丙醇(16.7mg，0.12mmol)，N，N-二甲基甲酰胺(10mL)， 60℃下搅拌16h，加入1M盐酸50mL，乙酸乙酯萃取(15mL×3)，饱和食盐水洗涤，无 水硫酸钠干燥，浓缩，制备薄层层析(二氯甲烷/甲醇＝20/1)，得化合物77(39mg，57％)。

35、化合物78的制备，反应式为：

25mL圆底烧瓶中加入化合物47-b(62.8mg，0.1mmol)，碳酸钾(27.6mg，0.2mmol)， 碘化钠(1.5mg，0.01mmol)，3-溴-丙醇(16.7mg，0.12mmol)，N，N-二甲基甲酰胺(10mL)， 60℃下搅拌16h，加入1M盐酸50mL，乙酸乙酯萃取(15mL×3)，饱和食盐水洗涤，无 水硫酸钠干燥，浓缩，制备薄层层析(二氯甲烷/甲醇＝20/1)，得化合物78(40mg，59％)。

36、化合物39的制备，反应式为：

化合物I的制备

在25mL圆底烧瓶中加入化合物A(113.5mg，0.25mmol)，无水乙醚(5mL)，5， 5-二溴-2，2-二甲基-4，6-二酮-1，3-二氧杂环己烷(90.58mg，0.3mmol)。室温搅拌过 夜。反应完全后，加入水，乙醚萃取3次，有机相合并。NaCl洗，Na₂SO₄干燥，抽干。 柱层析(石油醚/乙酸乙酯＝10:1)得化合物I(67.8mg，51％)。

化合物J的制备

在25mL圆底烧瓶中加入化合物I(133mg，0.25mmol)，无水乙醇2.5mL，硫尿 (38.06mg，0.5mmol)。加热回流3小时。冷却后抽干，柱层析(石油醚/乙酸乙酯＝10:1) 得化合物J(77.0mg，53％)。

化合物79的制备

100mL圆底烧瓶中加入化合物J(1.9g，4.0mmol)，二氯亚砜(10mL)，常温搅拌2 小时后，除去二氯亚砜，加入三乙胺(2mL)，二氯甲烷(40mL)，胺(534.2mg，6.0mmol)， 常温搅拌2小时。加入饱和氯化铵溶液(50mL)，二氯甲烷萃取(50mL×3)，无水硫酸 钠干燥，过滤，浓缩，柱层析(二氯甲烷/甲醇＝20/1)得化合物79(77.3mg，52％)。

37、化合物80-88的制备，反应式为：

化合物80的制备

与化合物79制备方法相同，化合物J与苄胺(642.4mg，6.0mmol)反应得化合物 80(89.91，60％)。

化合物81的制备

与化合物79制备方法相同，化合物J与4-吗啉丙胺(864.7mg，6.0mmol)反应得 化合物81(100.2mg，63％)。

化合物82的制备

与化合物79制备方法相同，化合物J与1-哌啶乙胺(768.8mg，6.0mmol)反应得 化合物82(101.2mg，62％)。

化合物83的制备

与化合物79制备方法相同，化合物J与4-氨基-1-苄基哌啶(1140.8mg，6.0mmol) 反应得化合物83(104.1mg，60％)。

化合物84的制备

与化合物79制备方法相同，化合物J与4-乙氨基-1-苄基哌啶(1140.9mg，6.0mmol) 反应得化合物84(117.2mg，66％)。

化合物85的制备

与化合物79制备方法相同，化合物J与1-氨基高哌啶(684.72mg，6.0mmol)反应 得化合物85(95.5mg，53％)。

化合物86的制备

与化合物79制备方法相同，化合物J与3-氨基奎宁环二盐酸盐(756.72mg，6.0mmol) 反应得化合物86(95.8mg，62％)。

化合物87的制备

与化合物79制备方法相同，化合物J与间甲氧基苯胺(738.42mg，6.0mmol)反应 得化合物87(78.5mg，51％)。

化合物88的制备

与化合物79制备方法相同，化合物J与2-氨基噻唑胺(600.0mg，6.0mmol)反应 得化合物88(94.8mg，61％)。

38、化合物89的制备，反应式为：

化合物L的制备

在50mL圆底烧瓶中加入甲基三苯基碘化磷(2.0g，5mmol)，叔丁醇钾(561.05mg， 5mmol)，甲苯15mL。85℃搅拌20min。加入化合物F(219.17mg，0.5mmol)。继续搅 拌3小时。反应完全后旋干溶剂，加水。乙酸乙酯萃取。饱和NaCl洗涤，干燥，柱层 析(石油醚/乙酸乙酯＝10:1)得化合物L(170mg，80％)。

化合物89的制备

100mL圆底烧瓶中加入化合物L(116.6mg，0.25mmol)，二氯甲烷(10mL)，苯乙 烯(0.3mmol).室温搅拌过夜。反应完毕后旋干，二氯甲烷萃取，饱和NaCl溶液萃取， 浓缩，柱层析(二氯甲烷/甲醇＝10:1)，得化合物89(114.08mg，80％)。

39、化合物90的制备，反应式为：

25mL圆底烧瓶中加入化合物89(570mg，1mmol)，二氯甲烷(10mL)，草酰氯(240μl， 2.5mmol)常温搅拌24小时后，除去草酰氯，二氯甲烷(10mL)，加入三乙胺(625μl， 4.5mmol)，2-氨基乙基哌啶(220，1.05mmol)，常温搅拌8小时。加入二氯甲烷稀释 (100mL)依次用1M盐酸和饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，柱层析 (石油醚/乙酸乙酯＝2/1)得化合物90(620mg，90％)。

40、化合物91的制备，反应式为：

100mL圆底烧瓶中加入化合物L(116.6mg，0.25mmol)，二氯甲烷(10mL)，乙烯 吡啶(31.5mg，0.3mmol).室温搅拌过夜。反应完毕后旋干，二氯甲烷萃取，饱和NaCl 溶液萃取，浓缩，柱层析(二氯甲烷/甲醇＝10:1)，得化合物91(100.0mg，70％)。

41、化合物92的制备，反应式为：

25mL圆底烧瓶中加入化合物91(570mg，1mmol)，二氯甲烷(10mL)，草酰氯(240μl， 2.5mmol)常温搅拌24小时后，除去草酰氯，二氯甲烷(10mL)，加入三乙胺(625μl， 4.5mmol)，2-氨基乙基哌啶(220，1.05mmol)，常温搅拌8小时。加入二氯甲烷稀释 (100mL)依次用1M盐酸和饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，柱层析 (石油醚/乙酸乙酯＝2/1)得化合物92(620mg，90％)。

42、化合物93的制备，反应式为：

100mL圆底烧瓶中加入化合物L(116.6mg，0.25mmol)，二氯甲烷(10mL)，苯乙 炔(30.6mg，0.3mmol).室温搅拌过夜。反应完毕后旋干，二氯甲烷萃取，饱和NaCl 溶液萃取，浓缩，柱层析(二氯甲烷/甲醇＝10:1)，得化合物93(102.3mg，72％)。

43、化合物94的制备，反应式为：

25mL圆底烧瓶中加入化合物93(570mg，1mmol)，二氯甲烷(10mL)，草酰氯(240μl， 2.5mmol)常温搅拌24小时后，除去草酰氯，二氯甲烷(10mL)，加入三乙胺(625μl， 4.5mmol)，2-氨基乙基哌啶(220，1.05mmol)，常温搅拌8小时。加入二氯甲烷稀释 (100mL)依次用1M盐酸和饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，柱层析 (石油醚/乙酸乙酯＝2/1)得化合物94(620mg，90％)。

44、化合物95的制备，反应式为：

100mL圆底烧瓶中加入化合物L(116.6mg，0.25mmol)，二氯甲烷(10mL)，炔 (20.4mg，0.3mmol).室温搅拌过夜。反应完毕后旋干，二氯甲烷萃取，饱和NaCl溶 液萃取，浓缩，柱层析(二氯甲烷/甲醇＝10:1)，得化合物95(113.2mg，82％)。

45、化合物96的制备，反应式为：

25mL圆底烧瓶中加入化合物95(570mg，1mmol)，二氯甲烷(10mL)，草酰氯(240μl， 2.5mmol)常温搅拌24小时后，除去草酰氯，二氯甲烷(10mL)，加入三乙胺(625μl， 4.5mmol)，2-氨基乙基哌啶(220，1.05mmol)，常温搅拌8小时。加入二氯甲烷稀释 (100mL)依次用1M盐酸和饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，柱层析 (石油醚/乙酸乙酯＝2/1)得化合物96(620mg，90％)。

表1 化合物核磁数据

实施例2齐墩果酸类衍生物具体活性实例：

1抑制体外生成的破骨细胞

破骨细胞体外诱导：1)RAW264.7细胞复苏后用一次性细胞刮刀传代2-3次，汇合 度60-70％(RAW264.7细胞完全长满再传代后分化潜能明显降低)，细胞处于对数分裂 期时用细胞刮刀刮下，1000g离心10min用含10％热灭活FBS和30ng/mLRANKL的 无酚红α-MEM重悬，计数，以1X10⁴mL^-1的密度接种于96孔细胞培养板，每孔100 μ细胞液。2)每隔一天更换一半含10％热灭活FBS和30ng/mLRANKL的无酚红 α-MEM培养基。3)培养第二天进行TRAP染色，10X光镜下观察细胞群中90％以上为 TRAP染色阳性的单核细胞，被用作单核破骨前体细胞进行分析。4)培养5天后TRAP 染色，10X光镜下观察，细胞群中70％以上为TRAP染色阳性的多核融合细胞，被用作 成熟的多核破骨细胞进行分析。

齐墩果酸类衍生物抑制破骨细胞生成的活性分析：1)RAW264.7细胞按照上述方法 进行培养和诱导。2)诱导开始的第一天在培养液中加入不同浓度的化合物，只加溶剂 的作为对照。3)每隔一天更换培养基。培养5天后细胞进行TRAP染色，计数多于或 等于含3个细胞核的TRAP染色阳性的细胞。

结果如表2所示。

表2 化合物抑制体外生成的破骨细胞

3促进类成骨细胞增殖实验

1)配置40mL成骨细胞消化液。(0.1％collagenase0.2％dispase0.01M PBS溶解) 及10％FBS的α-MEM培养基。2)25只1-2天的乳小鼠断头处死。3)取出头盖，刮 去软组织。4)放入10mL成骨细胞消化液中，37℃消化10min，每2min摇晃一次。5) 取上清液，2000rpm5min离心收集细胞，α-MEM培养基重悬。6)重复4-5步共4次。 7)将收集的细胞接种到细胞培养瓶中培养3d。8)洗去未贴壁的细胞。剩下的细胞即 为类成骨细胞。9)将不同浓度的化合物加入细胞培养基中，加入0.1％DMSO的组作 为对照。培养72小时。培养48小时时更换培养液。10)MTT法检测细胞活性。结果 如图1和图2所示。

4齐墩果酸类衍生物体内抗骨质疏松活性实验

1)动物实验，大鼠OVX模型的建立

试剂及手术器械准备：大鼠(动物合格证编号0049724)根据体重随机分成7组， 分别为假手术(Sham)组，双侧卵巢切除阴性对照组(OVX)，阳性药对照组(Alendronate) 和三组不同浓度47-a和47-b灌胃组(0.1，1，10，mg·kg^-1·d^-1)，随后大鼠用10％水合 氯醛腹腔注射麻醉、消毒，背侧切口，挑出卵巢，作双侧卵巢摘除。Sham组背部切口 不摘卵巢，仅切除卵巢周围少量脂肪组织，手术后青霉素钠腹腔注射3天。Sham和OVX 组以溶剂(5％乙醇，95％纯水)灌胃，Alendronate组用阿仑膦酸钠(1mg·kg^-1·d^-1)灌 胃，药物组分别用不同浓度47-a和47-b灌胃。灌胃给药，实验结束后，收集尿液，-20℃ 保存。称量体重，处死大鼠，立刻分离子宫组织并称重。心脏穿刺法收集全血，-4℃过 夜凝结，3000rpm离心收集血清。分离左腿股骨，及第4-5节腰椎。

卵巢切除后的大鼠第二天即口服给药2个月，分析化合物的防止作用(模型1)。

卵巢切除两个月后形成骨密度下降，然后口服给药3个月，分析化合物的治疗作用 (模型2)。

2)模型1中骨的pQCT检测

为了进一步研究化合物47-a和47-b在体内抗骨质疏松的活性，利用模型1和pQCT  system XCT Research M(Started Medizintechnik GmbH，Germany)扫描左股骨骨干部 分。扫描最小分辨率为0.08mm，片层厚度为0.5mm。皮质骨阈值为464mg·cm^-3。工 作站在Peel mode20模式下通过自动扫描全骨并根据阈值将自动全骨分成皮质骨和松质 骨。每轮扫描工作站分别扫描股骨上距离股骨胫骨分离点1-5mm的4个横断面，每个 断面厚1mm。根据每个面的横切图组数据分别计算皮质骨和松质骨的骨盐量，骨密度， 以及皮质骨厚度，骨外膜和骨内膜周长。数据处理使用的软件为XCT Research Series  Manual Software Version 5.4。结果如表4所示。

表4 pQCT检测结果

3)模型1中骨代谢标志物的测定

利用模型1，血清钙离子浓度，碱性磷酸酶活性，尿液钙离子及肌酸酐(Cr)浓度 的检测均采用标准比色法，使用商品化试剂盒及Cobas Integra400Plus全自动生化分析 仪(R℃he Diagnostics，Switerland)。血清中骨形成标志物(N-MID-OT)及骨吸收标志 物(CTX-1)，的测定按试剂盒手册进行。结果如表5所示。

表5 骨代谢标志物的测定结果

4)模型1中骨的micrCT检测

利用模型2，将75％乙醇固定的大鼠股骨和椎骨表面擦拭干净，纵向固定于样品台 上。设置实验条件：E＝30k eV，I＝20mA，filter:0.5+1.5+2.0+2.0+2.0+2.0，z＝6.8， u＝0.7，v＝0.1，0.5°/s，Gap＝17，分辨率9μm。采用软件对样本进行2维及3维重建，调 节矩形位置，选取收尾层数，3维重建图像直接用来进行骨小梁微结构分析。采用 VGStudio/Max软件对3维重建的骨小梁进行分析，计算如下参数：骨组织比例(BV/TV)、 骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小梁间隙(Tb.Sp)。股骨结果如表6所示，椎骨结果如表7所 示。

表6 股骨结果

表7 椎骨结果

以上结果综合提示，大多数化合物在2μM和20μM两个浓度下都表现了明显抑制 活性，对细胞均未显示出明显的毒性并且多数化合物能够促进类成骨细胞的增殖。灌胃 对防治骨流失和对骨质疏松大鼠的骨形态恢复具有积极作用。与vehicle(对照)组相比， 卵巢切除后的大鼠经药物作用后，大鼠皮质骨和松质骨密度明显增加，充分说明此类化 合物(47-a，47-b)能有效的防治骨量流失。此外，卵巢切除两个月后的大鼠经药物作 用后，骨比例明显上升，骨小梁厚度明显增加；骨小梁间隙有所减少；所有剂量的化合 物47-a和47-b对骨质疏松大鼠的骨微结构均有改善作用。由此可见，此类化合物具有 明显的抗骨质疏松活性。

齐墩果酸类衍生物体外抑制破骨细胞分化和形成、促进成骨细胞分化活性实验：

1)齐墩果酸类衍生物抑制破骨细胞产生和分化

体外诱导生成的破骨细胞来自RAW264.7细胞。它们在使用RANKL诱导5天后均 能分化成TRAP染色阳性的成熟的破骨细胞。开始诱导时将不同浓度的化合物加入培养 基中共同培养，只加入0.1％DMSO作为对照组。大多数化合物在2μM和20μM两 个浓度下都表现了明显抑制破骨细胞形成和分化的活性，具有抑制骨吸收的作用。

2)齐墩果酸类衍生物促进类成骨细胞分化

为了研究此类化合物具有抑制破骨细胞活性的同时是否能够促进成骨细胞的增殖 的活性。我们使用含0.1％collagenase0.2％dispase的胶原酶消化液从小鼠乳鼠头盖骨中 消化得到类成骨细胞。将2μM浓度的化合物加入到细胞培养液中培养48小时，MTT 法测得的细胞活性数据。多数化合物能够促进类成骨细胞的增殖，显示化合物具有促进 骨形成的作用。

齐墩果酸类衍生物体内抗骨质疏松活性实验：

1)齐墩果酸类衍生物体内预防骨质疏松作用

利用卵巢切除大鼠骨质疏松模型进一步研究具有较好体外活性的化合物47-a和 47-b在体内抗骨质疏松的具体过程。并用pQCT骨密度仪分别扫描其左股骨骨干部分内 外骨膜周长，皮质骨厚度和骨近端部分松质骨、皮质骨的骨密度(BMD)。此外还检测 了大鼠尿液和血清中特异性和一般性的骨代谢指标。结果表明，齐墩果酸类衍生物显著 阻止卵巢切除模型大鼠的骨密度降低，BMD值在1mg/kg/d剂量组下即恢复至假手术 组水平，同时增加卵巢切除模型大鼠的BMD及血清中与骨形成直接相关的N-MID-OT 含量，抑制与骨吸收直接相关的CTX-1含量的降低。同时未见任何雌激素类副作用。 以上结果显示化合物具有抑制骨吸收、促进骨形成的双重作用。

2)齐墩果酸类衍生物体内治疗抵抗骨丢失活性

为了研究齐墩果酸类衍生物(化合物47-a和47-b)对于已经形成的骨质疏松症， 是否具有体内治疗抵抗骨丢失的活性，我们进行了卵巢切除模型大鼠造势两月后灌胃实 验。通过对骨组织形态剂量学的平均骨/组织比例、平均骨小梁厚度、平均骨小梁间隙这 三个指标的考察，结果表明，与vehicle(对照)组相比，齐墩果酸类衍生物明显增加了 骨比例和骨小梁厚度，减少了骨小梁间隙。显示化合物对骨质疏松具有较好的防止作用。