一种大伏革菌及其在防治中国针叶树根腐病上的应用

摘要

本发明公开了一种大伏革菌(Phlebiopsis gigantea)，其在CGMCC的保藏号为CGMCC No.8653；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏时间：2013年12月18日。本发明的大伏革菌可用于防治中国针叶树根腐病，对中国针叶树根腐病病原菌的拮抗率可达到55.83％。

说明书

技术领域

本发明属微生物技术领域，涉及一种生物防治中国针叶树根腐病的菌种及其 应用，特别是涉及一种大伏革菌及在防治中国针叶树根腐病上的应用。

背景技术

针叶树根腐病是北温带地区普遍分布的一种重要病害，在亚热带地区仅局部 分布，危害较小。根据植物病害分布地图，该病害在美国、加拿大、法国、德国、 印度、日本等全球40多个国家均有分布。据调查，该病害在我国东北林区甚为 常见，在四川省西部和云南省西北部高山针叶林区内也比较普遍，在云南铁杉、 黄栎林内有时也能见到。该病害常导致针叶树幼林内大量林木死亡，在成年林或 过熟林内，根白腐常导致干基腐朽，严重影响经济用材的出材率；而且由于根腐 病常引起根部死亡，导致林木生长量的降低，其在经济上的损失更大。

针叶树根腐病的病原菌是异担子菌Heterobasidion，能引起针叶树根腐病的 异担子菌有5个生物种，分别是狭义多年异担子菌H.annosum(Fr.)Bref.sen  sostricto、小孔异担子菌H.parviporum Niemela&Korhonen、冷杉异担子菌H.a bietienum Niemela&Korhonen、异孔异担子菌H.irregulare Garbelotto&Otrosina 和西方异担子菌H.occidentale Otrosina&Garbelotto。虽然，该病害在我国的病 原菌并不是欧洲和北美地区真正的多年异担子菌Heterobasidion annosum，而是 小孔异担子菌H.parviporum，但是，在欧洲和北美引起严重病害的多年异担子 菌随进口原木传入、扩散和定殖我国的风险很大，需要防患于未然。该病害自1 800年发现到现在，很多国家对其防治方法及各种防治方法的生态影响都进行了 深入的研究。到目前为止，主要的防治方法有营林措施防治、化学防治和生物防 治。

营林措施防治包括在营林过程中，避免在有利于异担子菌生长的土壤上造 林，如酸性和营养丰富及砂质土壤；对感染的树种要避免营造纯林；对林分进行 抚育时，选择在冬天进行；对伐桩进行妥善处理；对已发生异担子菌侵染并造成 死亡的树木进行深埋和烧毁等。但是营林防治不能在根本上抑制针叶树根腐病的 发生。

化学防治是利用杂酚油、尿素、硼砂和氯氧化铜等处理已感染病原菌的树干 基部，但是化学防治不能有效控制周围树木的感染，并且化学药剂会对生态环境 造成一定的影响。

生物防治是基于以下原理：自然界中很多腐生真菌在相同生境条件下比异担 子菌生长迅速，能够侵占更多的营养物质和生态位，因此可以抑制异担子菌的侵 染和扩散。生物防治能有效抑制异担子菌对林木的侵染，可以将由异担子菌引起 的干基腐朽高度控制在最低，并且能够控制病原菌的传播速率，不会对生态环境 造成影响，因此生物防治具有更广阔的应用前景。

大伏革菌(Phlebiopsis gigantea)是一种白色腐朽真菌，广泛腐生于针叶树 死树特别是伐桩上，和异担子菌构成营养竞争关系，同时干涉异担子菌菌丝生长， 具有拮抗异担子菌的能力，其产生的胞外纤维素酶能够降解树木细胞壁纤维素结 构，达到快速定殖于伐桩的目的，故胞外纤维素酶活可作为高效生防菌株筛选的 指标之一。

尽管国外已有国家利用大伏革菌防治异担子菌引起的针叶树根腐病，但是针 对我国针叶树根腐病的致病菌小孔异担子菌的生物防治还未见报道。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中存在的问题，提供一种防治中国针叶树根腐 病的大伏革菌高效菌株及其应用。

本发明菌株已于2013年12月18日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通 微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究 所，邮编100101)保藏，分类命名为大伏革菌(Phlebiopsis gigantea)，在CGMCC 的保藏号为：CGMCC No.8653。

本发明的大伏革菌菌株CGMCC No.8653，可以通过下列两种方法分离得到：

1、基质分离法：取采集的大伏革菌子实体下的木组织，将其上、下表面及 四周用刀切掉，露出中间的木材组织，将处理过的木材组织在酒精灯焰上移动几 次进行表面消毒灭菌，然后在无菌条件下将其切成2mm×6mm的长段(片)接 种于麦芽汁培养基(麦芽浸粉20.0g/L，琼脂粉18.0g/L，KH₂PO₄3.0g/L，pH 自然，121℃高压灭菌30min)上，在28℃条件下恒温培养，3–5天后可见白 色菌丝出现，挑取菌丝进行纯化后保存，每个子实体重复3次。

2、孢子喷射法:取采集的大伏革菌子实体，将其在无菌条件下切取长2–2.5 cm，宽0.5cm小块，用透明胶带将切取的子实体小块贴到培养基盖上(子实体 面朝下)，置于室温下培养，24–48h(子实体干燥需放置更长时间)后，检查是 否有孢子喷射并萌发，如果有，需将子实体块移除防止污染，并挑取已萌发的孢 子进行纯化后保存，每个子实体重复3次。如果两种方法分离并纯化后的菌丝是 一样的，则证明分离成功，否则重新分离。

综合大伏革菌的形态学特征、培养特性、生理生化特性和内转录间隔区(ITS) 序列结果，将其鉴定为大伏革菌(Phlebiopsis gigantea)。

本发明另一方面提供一种大伏革菌菌株CGMCC No.8653在防治中国针叶树 根腐病上的应用。

其中，所述大伏革菌以生防制剂的形式实施。

特别是，所述生防制剂通过如下步骤制备而成：将大伏革菌孢子悬浮液与蔗 糖溶液混合后，密封于聚乙烯小袋中，即得。

特别是，所述生防制剂通过如下步骤制备而成：将大伏革菌孢子悬浮液制成 可湿性粉剂，密封于箔衬袋中，即得。

其中，所述大伏革菌孢子悬浮液通过如下步骤制备而成：

将大伏革菌供试菌株在固体培养基上活化；

取适量活化菌种接种于麦芽汁平板培养基上，在28±2℃条件下培养2-4周；

待大伏革菌产生大量孢子后，用无菌水冲洗麦芽汁平板培养基上的孢子，并 用血球计数板标定到1.0×10⁴-1.5×10⁴个大伏革菌孢子/mL，制得大伏革菌孢子 悬浮液。

特别是，所述麦芽汁培养基的成分包括麦芽浸粉、琼脂粉、KH₂PO₄、无菌 水，其中，每升麦芽汁培养基中，所述麦芽浸粉为20.0±2g，琼脂粉为18.0±2g、 KH₂PO₄为3.0±0.5g，其余为无菌水。

特别是，所述生防制剂通过如下步骤制备而成：将大伏革菌孢子和菌丝液接 种于灭菌后的山毛榉木屑中，密封于聚乙烯小袋中，即得。

其中，所述大伏革菌实施对中国针叶树根腐病的方法为：将大伏革菌制剂溶 解稀释后喷洒于伐桩上。

其中，所述大伏革菌实施对中国针叶树根腐病的方法为：将大伏革菌制剂溶 解稀释后喷洒到电锯链条上，用电锯伐树的同时接种伐桩。

本发明具有如下优点：

1、本发明提供的大伏革菌CGMCC No.8653菌株对中国针叶树根腐病病原菌 小孔异担子菌拮抗率达到55.83％，具有良好的抑菌效果。

2、本发明提供的大伏革菌CGMCC No.8653菌株可以抑制小孔异担子菌在树 桩上的定殖，有效防治针叶树根腐病，为中国针叶树根腐病的生物防治提供一种 行之有效的方法。

附图说明

图1为本发明实施例1中大伏革菌CGMCC No.8653的无性孢子图；

图2为实施例3中的葡萄糖标准曲线。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描 述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。 本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技 术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范 围内。

本发明实施例中选用的几种培养基的配方如下：

固体培养基：葡萄糖10.0g/L，麦芽浸粉20.0g/L，琼脂粉18.0g/L，KH₂PO₄3.0g/L，pH自然；

液体培养基：葡萄糖10.0g/L，麦芽浸粉20.0g/L，KH₂PO₄3.0g/L，pH自 然；

筛选培养基：葡萄糖30.0g/L，蛋白胨5.0g/L，KH₂PO₄3.0g/L，MgSO₄·7H₂O 1.5g/L，初始pH4.0；

麦芽汁培养基：麦芽浸粉20.0g/L，琼脂粉18.0g/L，KH₂PO₄3.0g/L，pH 自然。

实施例1大伏革菌CGMCC No.8653的鉴定

综合大伏革菌的形态学特征、培养特性、生理生化特性和内转录间隔区(ITS) 序列等，将其鉴定为大伏革菌(Phlebiopsis gigantea)。具体鉴定结果如下：

1、形态学鉴定

菌丝系统一体系，生殖菌丝具简单分隔，在Melzer和棉蓝试剂中均无变色 反应，菌丝组织在KOH试剂中无变色。菌肉菌丝无色，薄壁到稍厚壁，光滑， 有分枝，近规则排列，直径为2-4μm。近子实层菌丝无色，薄壁，与菌肉菌丝 相似，频繁分枝，近规则排列，直径为2-3μm；子实层中有囊状体，囊状体锥 形，无色，薄壁或厚壁，顶端较尖，中间有一很窄的腔，被结晶体，基部具一简 单分隔，大小为55-86x8-11μm，担子棍棒状或近圆柱状，顶部具4个担孢子梗， 基部具一简单分隔，大小为20.6-29x4-5μm；拟担子与担子相似，略小。担孢 子椭圆形，无色，薄壁，光滑，在Melzer和棉蓝试剂中均无变色反应，大小为 5.5-7x2.5-3.9μm，平均长L＝6.19μm，平均宽W＝3.02μm，长宽比Q＝2.05；无 性孢子砖块形，由菌丝断裂而成。

2、内转录间隔区(ITS)鉴定

提取大伏革菌(Phlebiopsis gigantea)CGMCC No.8653的基因组，材料及方 法如下：

2.1材料

本研究用于DNA提取的样品直接取材于分离纯化后的菌丝。刮取菌丝所用 工具为无菌手术刀片和镊子，使用前在酒精灯火焰上方灭菌即可。

2.2Aidlab试剂盒方法

1)破壁，加入100μL裂解液PL。

2)每个样品共加400μL裂解液PL，摇匀，65℃水浴半小时左右。

3)加入24：1氯仿异戊醇溶液400μL，13000转离心5min。

4)另取干净1.5mL离心管，各取300μL上清液，分别加入450μL结 合液PQ，立即混匀。

5)将溶液移入吸附柱AC中，13000转离心30s，倒掉废液。

6)加400μL抑制物去除液IR，12000转离心30s，倒掉废液。

7)加500μL漂洗液WB，12000转离心30s，倒掉废液。

8)加500μL漂洗液WB，12000转离心30s，倒掉废液。再13000转离 心2min。

9)取出吸附柱AC，转入干净离心管中，开盖晾几分钟，使乙醇充分挥 发。

10)加入50-80μL洗脱液EB，放3-5分钟，12000转离心30s。

2.3PCR扩增引物

ITS5(F):GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG

ITS4(R):TCCTCCGCTTATTGATATGC

2.4ITS-PCR扩增反应体系及反应条件

扩增反应体系见表1。

表1PCR基础扩增反应体系

ITS-PCR反应条件：95℃3min预变性，94℃变性40s，54℃退火45s， 72℃延伸1min，34个循环后；72℃充分延伸10min，4℃保存。

扩增结束后，将扩增产物3μL与3μL溴酚蓝指示剂混合均匀，点样于1.5％ 琼脂糖凝胶上，稳压90V，电泳30min。将所获得的PCR产物用GelExtraction  Kit(OMEGA)回收后由北京华大基因科技服务有限公司测序，将测序结果用 BLAST程序在GenBank中进行序列比对分析，结果显示菌株CGMCC No.8653 与大伏革菌(Phlebiopsis gigantea)的内转录间隔区(ITS)序列相似性达99％ (ITS序列见序列表)。

综合形态学和分子系统学研究结果，将生防菌株CGMCC No.8653鉴定为大 伏革菌(Phlebiopsis gigantea)。

实施例2大伏革菌拮抗小孔异担子菌实验

1)制备孢子悬浮液

将大伏革菌(Phlebiopsis gigantea)供试菌株在固体培养基上活化，取适量 活化菌种接种于麦芽汁平板培养基上，在28±2℃条件下培养3周，待大伏革菌 产生大量孢子后，用无菌水冲洗麦芽汁平板培养基上的孢子，并用血球计数板标 定到10⁴个大伏革菌孢子/mL，制得大伏革菌孢子悬浮液，备用；

将小孔异担子菌(Heterobasidion parviporum)供试菌株在固体培养基上活 化，取适量活化菌种接种于麦芽汁平板培养基上，在28±2℃条件下培养3周， 待小孔异担子菌产生大量孢子后，用无菌水冲洗麦芽汁平板培养基上的孢子，并 用血球计数板标定到4000个小孔异担子菌孢子/mL，制得小孔异担子菌孢子悬 浮液，备用；

其中，所述大伏革菌(Phlebiopsis gigantea)分别为保藏于中国微生物菌种 保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为CGMCC No.8653的大 伏革菌和购于芬兰Verdra公司的大伏革菌生物制剂Rotstop-F；所述小孔异担子 菌(Heterobasidion parviporum)购于北京林业大学微生物研究所。

2)木桩预处理

取3个鱼鳞云杉木桩，分别编号为A、B、C，其中A作为空白对照组，仅 接种小孔异担子菌；B、C作为试验组，其中，木桩B接种大伏革菌CGMCC No. 8653和小孔异担子菌；木桩C接种大伏革菌生物制剂Rotstop-F和小孔异担子菌； 实验设置3个重复。

其中，所述鱼鳞云杉木桩的高度为20cm，直径为30-35cm。

3)分别向木桩B、C的整个表面均匀喷洒50mL大伏革菌CGMCC No.8653 孢子悬浮液和大伏革菌生物制剂Rotstop-F孢子悬浮液，之后静置2小时，木桩 A不做任何处理；

4)待所述大伏革菌孢子悬浮液被木桩B、C完全吸收后，分别向木桩A、B、 C的整个表面喷洒50mL小孔异担子菌孢子悬浮液；

5)将喷洒过小孔异担子菌孢子悬浮液的木桩A、B、C置于潮湿阴凉潮湿处 培养5-6周，至大伏革菌和小孔异担子菌长出菌丝；

6)在培养后的木桩上，沿着垂直于木桩的径向的方向切取样片，接着用蒸 馏水将样片上的杂质冲洗干净，然后将样片置于潮湿处培养1-2周，至木桩上的 大伏革菌和小孔异担子菌产生孢子；

其中，在每个木桩垂直于木桩径向的方向上依次切取3个样片，每个样片的 厚度为3cm。

7)计算拮抗率

对空白对照组和试验组样片上的小孔异担子菌的孢子进行计数，根据计数结 果计算大伏革菌对小孔异担子菌的拮抗率，计算方法如下：

其中，H_(对照)代表空白对照组的小孔异担子菌孢子数，H_(试验)代表试验组 的小孔异担子菌孢子数。

结果表明，大伏革菌CGMCC No.8653对小孔异担子菌的拮抗率可以达到 55.83％；而大伏革菌生物制剂Rotstop-F对小孔异担子菌的拮抗率仅为42.55％。 实施例3大伏革菌胞外酶活性测定实验

1)制备大伏革菌种子悬液

将大伏革菌(Phlebiopsis gigantea)供试菌株在固体培养基上活化，取适量 活化菌种接种于液体培养基中，在温度为28±2℃，摇床转速为150rpm条件下培 养7天，得到一级发酵种子，将液体培养基匀浆后，按体积比为1:10的接种量 接种到液体培养基中，于温度为28±2℃，摇床转速为150rpm条件下培养3天， 得到二级发酵种子，备用；

其中，所述大伏革菌(Phlebiopsis gigantea)分别为保藏于中国微生物菌种 保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为CGMCC No.8653的大 伏革菌和购于芬兰Verdra公司的Rotstop生物制剂Rotstop-F。

2)制备纤维素酶液

将大伏革菌二级液体发酵种子按1:20体积比接种量接种至筛选培养基中， 在温度为28±2℃，转速150r/min条件下培养7天后，取上层发酵液，在转速 12000r/min条件下离心10min，取上层清液即为纤维素酶液，备用；

3)测定纤维素酶活力

采用常规的羧甲基纤维素钠盐(CMC-Na)酶活性测定方法测定纤维素酶活 力：取0.1mL纤维素酶液，加入1.9mL羧甲基纤维素钠溶液，混匀，置于40℃ 水浴锅中保温30min后，立即加入1.5mL DNS试剂，沸水浴5min，取出冷却 至室温，用蒸馏水稀释至25mL，颠倒混匀后，于540nm处测定吸光值，以0.1 mL煮沸的纤维素酶液加1.9mL底物羧甲基纤维素钠溶液做对照，每个处理重 复3次。

纤维素酶活力计算：根据葡萄糖标准曲线，计算CMC-Na被羧甲基纤维素 酶分解的葡萄糖含量，1个酶活单位定义为每分钟生成1umol葡萄糖所需要的酶 量。

葡萄糖标准曲线如图2所示，根据标准曲线计算得到大伏革菌菌株菌株 CGMCC No.8653纤维素酶活力为3494.12U/L；而大伏革菌生物制剂Rotstop-F 纤维素酶活力仅为3332.65U/L。

由于大伏革菌分泌的胞外纤维素酶能够降解树木细胞壁纤维素结构，达到快 速定殖于伐桩的目的，因此，本发明的大伏革菌CGMCC No.8653对于引起中国 针叶树根腐病的小孔异担子菌具有明显的抑制作用。

实施例4大伏革菌生防制剂的制备

1)将大伏革菌(Phlebiopsis gigantea)CGMCC No.8653在固体培养基上活 化，取适量活化菌种接种于麦芽汁平板培养基上，在28±2℃条件下培养3周， 待大伏革菌产生大量孢子后，用无菌水冲洗麦芽汁平板培养基上的孢子，并用血 球计数板标定到10⁴个大伏革菌孢子/mL，制得大伏革菌孢子悬浮液；

上述固体培养基的配制如下：葡萄糖10.0g，麦芽浸粉20.0g，琼脂粉18.0g， KH₂PO₄3.0g，加水至1000mL，pH自然；

麦芽汁培养基的配制如下：麦芽浸粉20.0g，琼脂粉18.0g，KH₂PO₄3.0g， 加水至1000mL，pH自然。

2)将3mL大伏革菌孢子悬浮液与7mL蔗糖溶液(a_w0.854，粘度为816 mPa.s)混合后，密封于聚乙烯小袋中，即得。

实施例5大伏革菌生防制剂的制备

1)大伏革菌孢子悬浮液的制备方法与实施例1相同；

2)将大伏革菌孢子悬浮液浓缩后，自然晾干，制得大伏革菌孢子粉；

3)将大伏革菌孢子粉与硅藻土、甲基纤维素、硝酸钾、十二烷基苯磺酸钠 混合，制成可湿性粉剂；

其中，各组分的重量份配比为：大伏革菌孢子粉1-10、硅藻土80-90、甲基 纤维素0.5-1、硝酸钾0.1-1、十二烷基苯磺酸钠8-10。

4)将可湿性粉剂密封于箔衬袋中，即得。

实施例6大伏革菌生防制剂的制备

1)大伏革菌孢子和菌丝液的制备：

将大伏革菌(Phlebiopsis gigantea)CGMCC No.8653在固体培养基上活化， 取适量活化菌种接种于液体培养基中，在温度为28±2℃，摇床转速为150rpm条 件下培养7天，得到大伏革菌发酵液；

用匀浆机将大伏革菌发酵液匀浆，得到大伏革菌孢子和菌丝液，于4℃保 存备用；

其中，所述液体培养基的配制如下：葡萄糖10.0g/L，麦芽浸粉20.0g/L， KH₂PO₄3.0g/L，pH自然；

2)将5mL大伏革菌孢子和菌丝液接种于5g灭菌后的山毛榉木屑中，待大 伏革菌生长到一定程度后，密封于聚乙烯小袋中，即得。

实施例7大伏革菌生防制剂的实施方法

将实施例4制备的大伏革菌生防制剂10mL溶解于10L自来水中，制成生防 治剂稀释液；

在生防治剂稀释液中加入少量水溶性染料，用于标记喷洒面积；

将添加了染料的生防治剂稀释液喷洒于伐桩上。

其中，每平方米伐桩上喷洒稀释后的大伏革菌制剂1±5％L，喷洒时间为采 伐后24h内，直到采伐树桩水分饱和为止，伐桩喷洒面积为100％，喷洒季节为 每年4-10月。

实施例8大伏革菌生防制剂的实施方法

将实施例4制备的大伏革菌生防制剂10mL溶解于10L自来水中，制成生 防治剂稀释液；

在生防治剂稀释液中加入少量水溶性染料；

将添加了染料的生防治剂稀释液喷洒在电锯链条上，用电锯伐树的同时接种 伐桩。

其中，每平方米伐桩上接种稀释后的大伏革菌制剂1±5％L，接种季节为每 年4-10月。

实施例9大伏革菌生防制剂的实施方法

称取5g实施例5或6制备的大伏革菌生防治剂，加入5L自来水，搅拌混 匀后喷洒于伐桩上。

其中，每平方米伐桩上喷洒稀释后的大伏革菌制剂1±5％L，喷洒时间为 采伐后24h内，直到采伐树桩水分饱和为止，木桩喷洒面积为100％，喷洒季节 为每年4-10月。