一种清除大型经济海藻生活史微观阶段杂藻污染的方法

摘要

本发明属于海藻生物技术领域，涉及一种清除大型经济海藻生活史微观阶段杂藻污染的方法。利用海洋中下水层底栖性的水蚤，将污染杂藻的大型海藻生活史微观阶段与水蚤相混合，利用水蚤的自然摄食行为去除污染杂藻。采用本发明能高效、彻底清除各种经济海藻生活史微观阶段的污染杂藻，同时对经济海藻安全无害。

说明书

技术领域

本发明属于海藻生物技术领域，涉及一种清除大型经济海藻生活史微 观阶段杂藻污染的方法。

背景技术

大型海藻主要包括褐藻（brown seaweed）、红藻（red seaweed）和绿 藻（green seaweed）。其中许多经济种类是人工栽培的对象，例如褐藻类 的海带（Saccharina spp.）、裙带菜（Undaria pinnatifida）、羊栖菜 （Sargassum fusiforme），红藻类的紫菜（Pyropia spp.）、红毛菜（Bangia  spp.）、江蓠（Gracilaria spp.）、石花菜（Gelidium spp.）、麒麟菜（Eucheuma  spp.），以及绿藻类的浒苔与石莼（Ulva spp.）。

通过人工栽培获得的海藻产品既可以提供健康食品（如紫菜、红毛菜、 海带、裙带菜、浒苔）、也可用于碘、甘露醇、藻胶等重要化工原料（如海 带、江蓠、石花菜、麒麟菜）、以及海洋药物（如羊栖菜、红毛菜）与蛋白 试剂（如紫菜）的提取原料，具有很高的经济价值。另外，栽培海藻在新 能源（如发酵产乙醇、甲烷）、新材料（如海藻多糖纺织纤维）领域也具有 突出的应用潜力。

大型经济海藻的自然生活史除了宏观阶段（即常见的叶状、管状、分 枝状、膜状、片状藻体），通常还存在微观阶段（例如海带、裙带菜、紫菜 的单列细胞丝状体）。除了自然发育过程，微观阶段还包括在实验室培养或 人工诱导条件下产生的特殊过程（例如石莼、浒苔的丝状体），以及可长期 保存并维持的幼苗期（例如石莼、浒苔的幼苗）。

与陆地植物不同，大型海藻的生活史微观阶段可以独立生活，既可以 长期保存，又易于扩繁增殖形成遗传均一的纯系，由此成为种质保存与种 质扩繁的主要对象；同时，通过发育调控还可进入宏观生活史阶段，体现 植物细胞发育的全能性，因此，也常作为遗传选育（如纯系杂交）、基因工 程等多种海藻生物技术操作的受体材料；尤为重要的是，微观阶段还是部 分经济海藻人工栽培过程的重要环节（例如紫菜贝壳丝状体培育阶段）。可 以说，生活史微观阶段是大型经济海藻栽培生产与科研操作的重要对象。

但是，由于生活史微观阶段的藻体十分微小，在保存和培养过程中极 易受到丝状或单细胞蓝藻、硅藻等微藻的污染，对后续试验或生产造成干 扰。由于微藻在营养吸收与增殖速率等方面具有明显优势，若不及时清除， 往往会将目标藻完全包裹并导致死亡，对生产或科研造成严重影响。

现有解决方法包括：1）通过显微操作对目标藻进行重新分离，这高度 依赖相关设备和操作经验，还需花费时间将目标藻从单一个体开始重新增 殖；2）使用化学试剂选择性控制杂藻生长，例如利用二氧化锗通过干扰硅 代谢抑制硅藻，但是，杂藻自身或通过孢子会产生耐受，因此往往只具有 抑制效果，很难完全清除，另外，化学试剂也会对目标藻产生抑制和伤害； 3）直接丢弃。因此，控制杂藻污染，需要发展新的思路和方法。

发明内容

针对上述在科研和生产过程中出现的突出问题，本发明的目的是提供 一种清除大型经济海藻生活史微观阶段杂藻污染的方法。

为实现上述目的，本发明技术方案如下：

一种清除大型经济海藻生活史微观阶段杂藻污染的方法，利用海洋中 下水层底栖性的水蚤，将污染杂藻的大型海藻生活史微观阶段与水蚤相混 合，利用水蚤的自然摄食行为去除污染杂藻。

进一步的说，以海洋中下水层底栖性水蚤，通过饲喂淡水单细胞绿藻 维持生长并使其增殖；将污染杂藻的大型海藻生活史微观阶段与水蚤相混 合，利用水蚤的自然摄食行为去除污染杂藻。

所述将污染杂藻的大型海藻生活史微观阶段与与水蚤按20-30只/cm²藻体相混合，进行利用水蚤的自然摄食行为去除污染杂藻。其中，水蚤投 放少些仅是清除的慢些而已。

待完全清除杂藻后再将海藻材料与水蚤分离。

所述海洋中下水层底栖性水蚤为日本虎斑猛水蚤（Tigriopus  japonicus）。

所述大型经济海藻生活史微观阶段为绿藻石莼、浒苔的幼苗以及丝状 体，褐藻裙带菜、海带的丝状配子体，红藻紫菜或红毛菜的丝状孢子体。

所述杂藻为单细胞蓝藻、丝状蓝藻与硅藻。

所述淡水单细胞绿藻为雨生红球藻、小球藻。

与现有技术相比，本发明提出了一种新思路，具有如下有益效果：

1.本发明技术不依赖任何设备与试剂。使用海洋中下层底栖性的水蚤， 潮间带均有分布，分布广泛、易于分离获得，容易经高效增殖获得生物量。

2.本发明的杂藻清除方法非常高效，一般只需处理30分钟，而现有显 微分离方法高度依赖相关设备和操作经验，还需花费很长时间将目标藻从 单一个体开始重新增殖。而化学处理法一般需连续处理几天到一周时间。

3.本发明对目标藻完全无害，非常安全。较化学处理等常用现有技术， 依赖水蚤对杂藻的摄食行为进行清除，对目标藻不产生任何影响，而化学 处理法往往会严重抑制目标藻的生长。

4.本发明可对丝状蓝藻、硅藻等污染杂藻进行彻底清除。而化学处理 等现有技术往往只能抑制杂藻生长，杂藻自身或通过孢子会产生耐受，很 难完全清除。

5.本发明技术适用的海藻材料非常广泛，清除杂藻方法具有很高的通 用性。使用的水蚤口器尺寸大于一般常见的丝状蓝藻直径和单细胞蓝藻、 硅藻，小于褐藻、绿藻、红藻等常见海藻微观阶段的尺寸，因此，会选择 性清除污染杂藻。

6.本发明为了避免海洋微藻饲喂的水蚤取用时对目标藻产生二次污 染，使用淡水来源的微藻（例如雨生红球藻）对水蚤进行饲喂，可完全保 证水蚤的正常取食和生长，即使取用时淡水藻污染了目标藻，在海水培养 液中也不会存活。

附图说明

图1为本发明实施例提供的水蚤电镜形态学特征，其中（左.完整个 体；右.口器）。

图2为本发明实施例提供的水蚤光学显微镜形态学特征，其中箭头示 卵囊。

图3为本发明实施例提供的基于CO1基因的系统发育树，其中Sample 为本发明分离的水蚤。

图4为本发明实施例提供的水蚤摄食淡水单细胞绿藻，其中，左.摄 食前；右.摄食后，示消化道内红色，右下角为投喂的雨生红球藻，标尺： 50μm。

图5为本发明实施例提供的水蚤完全去除浒苔幼苗污染的丝状蓝藻， 其中，自左至右示同一个体的去除过程，箭头示杂藻集中分布位置。

图6为本发明实施例提供的水蚤完全去除石莼幼苗污染的硅藻，其中， 上下行分别为两个个体，自左至右示去除过程，箭头示杂藻集中分布位置。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的方法及该方法所达到的效果作进一步详细 说明。

实施例1：水蚤的分离培养以及形态与分子鉴定

1.蚤种分离培养

从青岛海域潮间带采集下层底栖性水蚤，用消毒海水进行冲洗并分离 两个配对个体，通过饲喂底栖硅藻维持生长并增殖群体。

2.形态观察

挑取典型完整个体，利用扫描电镜和光学显微镜观察形态特征并成像， 电镜可见水蚤的口器直径约为10μm，大于常见的丝状蓝藻直径、以及单 细胞蓝藻与硅藻，同时小于常见大型经济海藻微观阶段的细胞尺寸。光镜 可见雌性个体形成卵囊，内含大量卵，有很高的繁殖速率（见图1、图2）。

3.分子鉴定

为了避免外源生物的污染,提取基因组总DNA前使用Tris-EDTA-NaCl 缓冲液反复冲洗样本。参照产品说明书，使用微量组织样品试剂盒 （Qiagen），取整只个体提取DNA。针对甲壳类设计PCR通用引物（正向引 物crcoxf：5’-GGTCCTGTAATCATAAAGAYATYGG-3’，反向引物crcoxr1： 5’-GCGACTACATAATAAGTRTCRTG-3’与crcoxr2：5’-TCTATCCCAACTGTAAATATRT -GRTG-3’）扩增线粒体编码的CO1基因片段。反应采用50μl体系，反应 条件如下：94℃5min;36个循环（94℃1min,46℃30s,72℃1.5min）; 72℃10min。扩增产物经电泳验证后使用凝胶回收试剂盒进行纯化 (Omega)。纯化产物送测序公司双向测序（参见SEQ ID NO.1）。

选择相关参考序列，将水蚤线粒体CO1基因片段利用NJ法构建系统发 育树，发现测得样本序列与日本虎斑猛水蚤Tigriopus japonicus线粒体 CO1基因序列高度同源，与该种参考序列（NCBI Acc No.JN129180.1）相 似度为98%，由此确定分离的水蚤样本为节肢动物门（Arthropoda）、甲壳 纲（Crustacea）、桡足亚纲（Copepoda）、猛水蚤目（Harpacticoida）、虎 斑猛水蚤属（Tigriopus）的日本虎斑猛水蚤（Tigriopus japonicus）（见 图3）。

SEQ ID NO.1为水蚤CO1部分基因序列，

TAAAGATATTGGAACTTTGTATTTAATTGCTGGCGCATGAGCGGGTTTTGTAGGAGCCGCTATAA GTGTTTTAATCCGCCTGGAGTTAGGGCAGTGTGGGAGGTTTTTAGGTAATGATCAGCTTTATAAT GTTCTTGTAACTGCTCATGCTTTCGTAATGATTTTTTTTATGGTTATACCTGTTTTAATTGGAGGAT TTGGTAATTGACTTGTACCCCTGATGCTGGGAGCCCCAGATATGGCTTTTCCACGTCTTAATAAT YTAAGATTTTGGTTTTTGATTCCAGCTTTATTAATGTTATTGTTAAGGAGGGCTGTAGAAGCAGG GGCTGGAACCGGGTGAACTGTGTATCCCCCATTAAGAGCTGTTGGTCATGCGGGAAGTTCGGTT GATTTTGCTATCTTCTCACTTCATTTGGCGGGTGTTTCTTCATTGCTGGGGGCTGTGAATTTTATT AGCACTATTTTTAATTTGCGGGTTTTTGGTTTGTACTTAGATTTGGTTCCTTTGTTTGTTTGGTCC GTGCTCTTAACAGCTATTTTGYTGTTGCTTTCCTTACCTGTCTTGGCTGGTGCCATTACTATGTTG TTGACGGATCGTAACTTGAATTCTTGTTTTTATGATGTGAGGGGTGGGGGAGATCCTATTCTTTA CCAACACTTATTTTGATTTTTTGGGCATCCCGAAGTTTACATTTTAATTCTCCCAGGGTTTGGATT AATTTCGCATATTATTTCtCAAGAAACCTCTAAAAAAGAAGTTTTTGGGGTATTGGGTATAATTTA TGCTATAGCGTCTTATCGGTGTTTTGGGGTTTGTTGTATGGGCTCATCACATATTTACTGTGGGTC TGGACACGGACACTCGTGCCTATTTTACTTCTGCAACTATAATTATTGCTGTTCCCACTGGTATCA AAATTTTCAGGTGGGTAGGCACTTTGTACGGTAGTAAACCTAGATATAGGGCTTCTTTTAGCTGG GCCCTGGGCTTTATTTTCCTGTTTACTTTAGGAGGGTTGACGGGTATTATTTATCCA

4.淡水单胞藻饲喂

为了避免海洋微藻饲喂的水蚤取用时对目标藻产生二次污染，改用淡 水单胞藻（雨生红球藻）对水蚤进行饲喂，光学显微镜观察发现水蚤对淡 水单胞藻可正常取食（见图4）。

实施例2：用水蚤清除污染浒苔幼苗的丝状蓝藻

浒苔幼苗可用于保存种质，丝状蓝藻是常见的污染生物，非常容易与 苗体发生严重的缠绕并最终完全包裹，因完全抑制光合作用并竞争营养导 致保存的幼苗种质死亡。

取处于长期休眠状态并于假根部严重污染丝状蓝藻的幼苗，与适量水 蚤（约20只）在培养皿中混合，处理约半小时。整个过程每隔10min进 行镜检拍照（见图5）。图中可见，丝状蓝藻与假根发生严重缠绕，但水蚤 对蓝藻的清除非常彻底而高效。

实施例3：用水蚤清除污染石莼幼苗的硅藻

石莼幼苗可用于保存种质，硅藻是常见的污染生物，非常容易与苗体 发生粘附，严重的会完全包裹，因完全抑制光合作用并竞争营养导致保存 的幼苗种质死亡。

取处于长期休眠状态并严重污染硅藻的石莼幼苗，与适量水蚤（约20 只）在培养皿中混合，处理约半小时。整个过程每隔10min进行镜检拍照 （见图6）。图中可见，单细胞硅藻与幼苗藻体发生严重粘附，但水蚤对硅 藻的清除非常彻底而高效。

实施例4：用水蚤清除污染裙带菜丝状配子体的硅藻

裙带菜丝状配子体可用于保存种质与遗传操作，以及生产上制备克隆 苗，硅藻是常见的污染生物，非常容易与苗体发生粘附，现有技术常使用 二氧化锗抑制硅藻，但同样会对裙带菜配子体造成负面影响。

取严重污染硅藻的裙带菜丝状配子体，与适量水蚤（约20只）在培养 皿中混合，处理约半小时，水蚤对硅藻的清除非常彻底而高效。