用于纳米颗粒标记免疫检测的磁场辅助介电泳富集方法

摘要

本发明公开了用于纳米颗粒标记免疫检测的磁场辅助介电泳富集方法，利用纳米颗粒标记抗体或抗原，设计一种使用磁场辅助介电泳，对磁性纳米颗粒和传感纳米颗粒标记抗体或抗原免疫偶联形成聚集体进行筛选和富集的方法。通过在平行的非均匀电极间施加交变电场，对溶液中纳米级颗粒实现空间定向移动，在特定电压幅值、频率和磁场强度范围内，对纳米颗粒与磁性纳米颗粒免疫反应聚集体实现在复杂溶液中透明电极表面微区选择性富集，用于高灵敏度免疫检测。

说明书

技术领域

本发明涉及的是生物医学领域的生物检测方法，具体是一种基于磁场辅助介电泳技术，实现对发生免疫反应的标记抗体（或抗原）的传感纳米颗粒与磁性纳米颗粒聚集体进行选择性微区富集的方法。 

背景技术

通过信号传感纳米颗粒标记实现免疫检测，具有高灵敏度、高环境适应性、可定量等优点，目前使用不同纳米颗粒通过检测荧光、表面等离子体发光、表面增强拉曼散射等效应，制成多种生物检测器件和试剂，例如：通过量子点标记抗体，用夹心法测量抗原在血清中含量，制成多种表面固定或液相检测试剂盒；将金属纳米颗粒通过免疫反应与固体表面接合，通过测量纳米颗粒表面等离子体发光，能实现对抗体或抗原的定量检测；通过测量吸附在金属纳米颗粒表面的生物分子对纳米颗粒拉曼散射，众多研究者实现了对生物分子的高灵敏度定量测量。在这些光学测量方法中，溶液中光学测量的灵敏度取决于在激发光照射路径上的传感纳米颗粒数量，在固体表面测量的灵敏度取决度纳米颗粒吸附在固体表面的密度。当溶液中被测抗原或抗体含量较低时，这两种方法被激发光有效照射的纳米颗粒都远低于被测分子的数目，因此需要将发生免疫反应的传感纳米颗粒富集到空间微区，以提高信号强度，达到对极低含量抗原、抗体分子的测量。 

将溶液中纳米颗粒富集到固体表面有多种方法，例如，采用介电泳技术，可以将标记生物分子的绝缘体纳米颗粒富集到金属电极表面；采用激光辅助电泳技术，可以将金属纳米颗粒富集到透明电极表面，形成微米级空间区域图形化聚集；采用磁场辅助介电泳技术，可以将磁性纳米颗粒进行尺寸筛选，从这些方法中可以看出交变电场下有效电泳力对纳米颗粒尺寸、介电常数、溶液粘度等条件敏感，通过设计场强梯度、电场频率，可以达到对比恒压电泳更有效的分离和空间富集。同时，为了选择性富集发生免疫反应的纳米颗粒聚集体，采用恒定磁场辅助介电泳，可以降低聚集区内非聚集体传感纳米颗粒的比例，从而降低测量偏差。因此，设计具有高选择性纳米颗粒聚集体富集技术，对采用光学方法实现高灵敏度免疫测量有普遍性的意义。目前，对纳米颗粒标记抗原（抗体）免疫反应聚集体从混合物从原位分离、富集，国内外未见报道。 

发明内容

本发明针对高灵敏度、低检出限免疫检测的需求，提出一种用于纳米颗粒标记免疫检测的磁场辅助介电泳富集方法，基于传感纳米颗粒和磁性纳米颗粒免疫反应聚集体，实现在透明基体表面微 区选择性富集，以满足对溶液中抗原或抗体分子的低成本、低检出限、大测量范围、高通量定量测量的要求。 

本发明的技术方案如下：一种用于纳米颗粒标记免疫检测的磁场辅助介电泳富集方法，步骤为： 

第一步，在纳米颗粒表面偶联抗体或抗原分子：根据被测物的性质在磷酸缓冲溶液（PBS）中保持单分散的传感纳米颗粒和磁性纳米颗粒表面分别偶联相应的抗体或抗原分子，将纳米颗粒与抗体或抗原偶联，分离洗涤去除多余抗体或抗原分子； 

第二步，制备传感纳米颗粒和磁性纳米颗粒免疫结合聚集体：根据被测物的为抗原或是抗体，先将第一步得到磁性纳米颗粒或传感纳米颗粒加入被测物溶液，然后再加入第一步得到的另外的纳米颗粒反应形成传感纳米颗粒和磁性纳米颗粒免疫结合聚集体混合溶液； 

第三步，用介电泳富集：将第二步得到的传感纳米颗粒和磁性纳米颗粒免疫结合聚集体混合溶液加入富集装置中，使混合溶液处在恒定磁场和外加交变电场作用下，磁场梯度方向和交变电场梯度的方向相同或相反，使传感纳米颗粒和磁性纳米颗粒免疫结合聚集体被富集到电极表面，抑制传感纳米颗粒在电极表面富集，通过检测电极表面免疫检测分子形成的两种不同纳米颗粒聚集体的数量来测量溶液中被测物含量。 

所述的磁场场强为0.2～0.5特斯拉，所述的交变电场的电压为1千赫兹～1兆赫兹正弦波，幅值为2～20伏，作用时间为2～40分钟。 

第一步中，当被测物是抗原时，则传感纳米颗粒或磁性纳米颗粒的任一种上偶联的抗体为单克隆抗体，第二步中另一种纳米颗粒上相应偶联的第二抗体为单克隆或多克隆抗体；第一步中当被测物是抗体时，则传感纳米颗粒或磁性纳米颗粒的任一种上偶联抗原，第二步中则另一种纳米颗粒上偶联多克隆第二抗体。 

所述的传感纳米颗粒包括半导体荧光纳米颗粒、稀土掺杂化合物荧光纳米颗粒、金属纳米颗粒的任一种，直径在20到40纳米范围。 

所述的磁性纳米颗粒包括氧化物磁性纳米颗粒、金属磁性纳米颗粒，直径在5到10纳米范围内，在水溶液中无沉降，纳米颗粒表面修饰水溶性活性基团。 

所述的用于纳米颗粒标记免疫检测的磁场辅助介电泳富集方法中的富集装置，由电场装置和永磁体组成，所述的电场装置由外到内依次由上下电极层和待测溶液空腔组成，所述的上电极层为在透明基片上设置的透明导电电极，所述的下电极为连续氧化铟锡透明导电玻璃；所述的永磁体产生的磁场方向基本垂直于电极平面表面，在20倍电极直径尺寸内磁场分布均匀，所述的待测溶液空腔为在上下电极层之间用绝缘体间隔形成的间距在0.3～1毫米的空腔。 

所述的透明导电电极为单个电极或多个电极阵列。 

所述的电极尺寸在10到100微米。 

所述的电极阵列中心间距≥12毫米。 

本发明提出的方法，具有简单、低成本、分离和富集效率高、具有可集成性、与光学测量系统兼容等特点。颗粒在交变电场下的电泳力正比于电场平方梯度,在介质为水溶液时，不同介电常数和导电性的纳米颗粒的介电泳力的方向对频率的敏感性不同，存在的渡越频率也不同，选择适当的频率和安排外加磁场方向，选择性两种纳米颗粒聚集体趋近电极，在该频率未偶联传感纳米颗粒受负电泳力，未偶联磁性纳米颗粒受磁场力驱离电极，使到达颗粒表面的均为偶联的免疫聚集体，达到免疫检测所需的高灵敏度和特异性。 

附图说明

图1为本发明实施例的介电泳结构示意图。 

A为下电极示意图，其中1为PDMS硅橡胶，2为ITO电极，3为导线。 

B为本发明实施例的介电泳结构整体示意图。1为PDMS硅橡胶，2为ITO电极，4为下电极，5为电源，6为永磁体。 

图2为本发明实施例中使用的一种电极的光学显微镜照片。 

具体实施方式

本发明的具体实施方式通过以下实例来说明，针对具体应用对象，在实施方案的范围内，选择具体适用参数和条件。 

一、将在pH值2到7的PBS缓冲液中保持单分散的传感纳米颗粒和磁性纳米颗粒表面偶联抗体或抗原分子，将纳米颗粒与抗体或抗原偶联，多次分离洗涤去除多余抗体或抗原分子； 

当被测物是抗原时，要求传感纳米颗粒或磁性纳米颗粒的任一种上偶联的抗体为单克隆抗体，另一种纳米颗粒上就偶联为单克隆或多克隆抗体；当被测物是抗体时，要求传感纳米颗粒或磁性纳米颗粒的任一种上偶联抗原，另一种纳米颗粒上偶联多克隆第二抗体；所述的传感纳米颗粒包括半导体荧光纳米颗粒、稀土掺杂化合物荧光纳米颗粒、金属纳米颗粒的任一种，直径在20到40纳米范围。所述的磁性纳米颗粒包括氧化物磁性纳米颗粒、金属磁性纳米颗粒，直径在5到10纳米范围内，在水溶液中无沉降，纳米颗粒表面修饰水溶性活性基团。当被测物是抗原时，先将标记单克隆抗体的纳米颗粒加入被测溶液，加入量根据预计被测物含量，可以在1毫克/毫升～1纳克/毫升之间选择，加入标记单克隆或多克隆抗体的第二种纳米颗粒；当被测物是抗体时，先将标记抗原的纳米颗粒加入被测溶液，后加入标记第二抗体的纳米颗粒； 

所述的待测物可以为各种适合夹心法或间接法的抗原或抗体，所述的纳米颗粒上偶联的抗体或抗原可以为对待测抗原具有特异性的单克隆抗体或对待测抗体具有特异性的重组抗原或纯化抗原，第二抗体可以为能与待测抗原特异结合的单克隆抗体或与待测抗体非特异结合的抗抗体。例如：夹心法检测乙肝表面抗原（HBsAg），两种纳米颗粒均偶联HbsAg单克隆抗体；或者如双抗原夹心法，在两种纳米颗粒表面均偶联特异的多肽抗原，测量丙型肝炎病毒（HCV）抗体。间接法检测人类疱疹病毒(EB病毒)VCA-IgA抗体，一种纳米颗粒表面偶联重组抗原，另一种纳米颗粒表面偶联抗Ig-A的羊抗人IgA抗体；或用间接法检测流感病毒，将甲流病毒核蛋白重组抗原偶联到一种纳米颗粒表面，在另一种纳米颗粒表面偶联二抗，用以检测流感抗体。 

电泳结构如附图1所示，分上下相对平板电极，上电极为在氧化铟锡导电玻璃上制备的微电极，电极尺寸可以根据被测物含量在100微米到10微米之间选择，电极可以是单个，也可以是有一定间距的电极阵列，中心间距不小于12毫米；下电极为连续氧化铟锡透明导电玻璃，电极之间用绝缘体间隔，在上电极中心形成直径为大于4毫米空间，隔层厚度为小于1毫米的待测溶液空腔； 

二、取纳米颗粒与被测物溶液置于上电极中央，待溶液充满中心区域，将下电极覆盖，确定隔层空间被溶液充满，将上下电极固定，翻转，在上电极上放置稀土永磁体，其表面场强不低于0.2高斯； 

在上下电极上加交变电场，电压为1千赫兹～1兆赫兹正弦波，幅值为2～20伏，保持时间随预计被测物含量在2分钟到40分钟内调节。 

实施例1： 

检测乙肝抗原的稀土荧光传感纳米颗粒、氧化铁纳米颗粒标记夹心法偶联聚集体富集： 

待测物为乙肝病毒表面抗原（HBsAg）阳性的人血清；传感纳米颗粒采用铒、镱掺杂氟钇酸钠上转换纳米颗粒，表面修饰羧基，尺寸为约20纳米，偏差低于2纳米，制备方法见参考文献A.D.Ostrowski,E.M.Chan,D.J.Gargas,et al.Controlled synthesis and single-particle imaging of bright,sub-10nm lanthanide-doped upconverting nanocrystals,ACS NANO,2012,6,2686-2692以及H.P.Zhou,C.H.Xu,W.Sun,C.H.Yan,Clean and flexible modification strategy for carboxyl/aldehyde-functionalized upconversion nanoparticles and their optical applications,Adv.Func.Mater.,2009,19,3892-3900，氧化铁纳米颗粒为表面羧基修饰的四氧化三铁，平均尺寸8纳米，偏差2纳米，制备方法见参考文献J.Park,E.W.Lee,N.-M.Hwang,et al.One-nanometer-scale size-controlled synthesis of monodisperse magnetic iron oxide nanoparticles,Angew Chem-Interna,2005,44,2872-2877，将上述两种纳米颗粒均以0.1毫克 /毫升浓度乙肝抗体鼠抗人单克隆抗体IgG溶液（PBS，浓度为0.01毫克/毫升）混合，加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐（浓度0.4毫摩尔/毫升），在4℃下保持12小时，稀土纳米颗粒在11000转/分速度下离心分离，加PBS洗涤两次，-20℃冷藏备用，四氧化三铁纳米颗粒用表面场强大于0.2特斯拉永磁体分离，加PBS洗涤两次，-20℃冷藏备用。 

将被测血清30微升与上述磁性纳米颗粒标记物（浓度>50微克/毫升PBS溶液）30微升混合，在37℃保持1小时，再加入稀土荧光纳米颗粒标记物（浓度>50微克/毫升溶液）30微升，在37℃保持1小时，将混合物置入电极（图1），充满电极间隙无气泡后，加电场、磁场，电极尺寸为直径50微米，磁铁采用钕铁硼片状永磁体，直径40毫米，表面磁场强度0.475特斯拉，上下电极间距0.5毫米，施加电压为正负十伏200千赫兹交变电压，电极玻片厚度均为0.5毫米，室温下保持20分钟，完成免疫聚集体在电极表面分离与富集。 

实施例2： 

检测人类疱疹病毒(EB病毒)VCA-IgA抗体的金纳米颗粒、氧化铁纳米颗粒间接法偶联聚集体富集：待测物为EB病毒VCA-IgA抗体阳性的人血清；传感纳米颗粒采用尺寸为20纳米的金纳米颗粒，偏差低于2纳米，表面修饰羧基，制备方法见参考文献B.C.Mei,K.Susumu,I.L.Medintz,J.B.Delehanty,T.J.Mountziaris,H.Mattoussi,Modular poly(ethylene glycol)ligands for biocompatible semiconductor and gold nanocrystals with extended pH and ionic stability,J.Mater.Chem.2008,18,45949-4958.，氧化铁纳米颗粒为表面羧基修饰的四氧化三铁，平均尺寸8纳米，偏差2纳米。将金纳米颗粒均以0.1毫克/毫升浓度与EB病毒NA1重组抗原溶液（PBS，浓度为0.01毫克/毫升）混合，加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐（浓度0.4毫摩尔/毫升），在4℃下保持12小时，金纳米颗粒在11000转/分速度下离心分离，加PBS洗涤两次，-20℃冷藏备用；四氧化三铁纳米颗粒以0.1毫克/毫升浓度与羊抗人IgA溶液（PBS，浓度为0.01毫克/毫升）混合，加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐（浓度0.4毫摩尔/毫升），在4℃下保持12小时，用表面场强大于0.2特斯拉永磁体分离，加PBS洗涤两次，-20℃冷藏备用。 

将被测血清30微升与上述金纳米颗粒标记物（浓度>50微克/毫升PBS溶液）30微升混合，在37℃保持1小时，再加入稀土荧光纳米颗粒标记物（浓度>50微克/毫升溶液）30微升，在37℃保持1小时，将混合物置入电极，电极结构与例一相同，施加电压为正负十伏，20千赫兹交变电压，磁铁置于下电极之下（图1），室温下保持20分钟，完成免疫聚集体在电极表面分离与富集。