慢性神经退行性疾病早期诊断标志物及应用

摘要

本发明提供一种慢性神经退行性疾病早期诊断标志物，其为β型可溶性NSF附着蛋白β-SNAPs，其氨基酸序列如Seq ID No.1所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。本发明首次发现β-SNAPs的表达和含量变化可以指示慢性神经退行性疾病的早期发生，并开发出检测这种蛋白变化的蛋白质组学方法，为慢性神经退行性疾病的早期诊断和早期发现开辟了新思路，通过更深入的机理研究和损耗-时间曲线的建立，有助于将慢性神经退行性疾病的损失降到最低。

说明书

技术领域

本发明涉及医学及蛋白质工程领域，具体地说，涉及一种慢性神 经退行性疾病早期诊断标志物及应用。

背景技术

朊蛋白病是发生在哺乳动物中枢神经系统的一类神经退行性疾 病，具有较长的潜伏期，由于早期治疗对于该病的治愈有着重要意义， 因此对于朊蛋白病的早期诊断的研究势在必行。目前对于神经退行性 疾病早期诊断的研究主要围绕蛋白组学、基因组学、代谢组学以及影 响观察几个方面进行展开。其中以二维聚丙烯酰胺凝胶电泳为基础的 蛋白组学一直是近年来的研究热点。蛋白质样品中的不同类型的蛋白 质可以通过二维电泳进行分离。二维电泳可以将不同种类的蛋白质按 照等电点和分子量差异进行高分辨率的分离。成功的二维电泳可以将 2000～3000种蛋白质进行分离。电泳后对胶进行高灵敏度染色，例如 银染或荧光染色。如果是比较两种样品之间蛋白质表达的异同，可以 在同样条件下分别制备二者的蛋白质样品，然后在同样条件下进行二 维电泳，染色后比较两块胶；或者，可以将二者的蛋白质样品分别用 不同的荧光染料标记，然后两种蛋白质样品在一块胶上进行二维电泳 的分离，最后通过荧光扫描技术分析结果。

胶染色后可以利用凝胶图像分析系统成像，然后通过分析软件对 蛋白质点进行定量分析，并且对感兴趣的蛋白质点进行定位。通过专 门的蛋白质点切割系统，可以将蛋白质点所在的胶区域进行精确切 割。接着对胶中蛋白质进行酶切消化，酶切后的消化产物经脱盐/浓 缩处理后就可以通过点样系统将蛋白质点样到特定材料的表面 （MALDI-TOF）。最后这些蛋白质就可以在质谱系统中进行分析，从 而得到蛋白质的定性数据，这些数据可以用于构建数据库或与已有的 数据库进行比较分析。

LCM-二维电泳-质谱技术是蛋白质组学研究的经典技术路线，除 此以外，LCM-抗体芯片也是一条重要的蛋白质组学研究的技术路线。 即，通过LCM技术获得感兴趣的细胞类型，制备细胞蛋白质样品，蛋 白质经荧光染料标记后与抗体芯片杂交，从而可以比较两种样品蛋白 质表达的异同。

发明内容

本发明的目的是提供一种慢性神经退行性疾病早期诊断标志物。

本发明的另一目的是提供所述标志物在慢性神经退行性疾病早 期诊断中的应用。

为了实现本发明目的，本发明的一种慢性神经退行性疾病早期诊 断标志物，所述标志物为β型可溶性NSF附着蛋白(Soluble NSF  attachment proteins,SNAPs)β-SNAPs，其氨基酸序列如Seq ID No.1所 示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等 功能的氨基酸序列。

本发明还提供所述标志物β-SNAPs在制备慢性神经退行性疾病 早期诊断试剂中的应用。其是以β-SNAPs作为免疫原，通过免疫动物， 获得相应抗体，将制备的抗体作为诊断试剂或诊断试剂中的有效成 分。

本发明还提供一种慢性神经退行性疾病早期诊断试剂，其是以 β-SNAPs作为免疫原，通过免疫动物，获得的相应抗体即为诊断试剂。

本发明还提供一种慢性神经退行性疾病早期诊断试剂盒，所述试 剂盒中含有上述诊断试剂。

本发明中涉及的慢性神经退行性疾病包括但不限于传染性海绵 状脑病（TSE）和阿茨海默症（AD）等。

目前对于慢性神经退行性疾病（尤其是海绵状脑病和阿茨海默 症），在无症状期和早期发病阶段，还没有找到行之有效的检测手段。 目前的检测手段仍停留在发病后组织样本的提取分析和死亡后的组 织病理学检测。由于目前没有治愈这类疾病的方法，因此慢性神经退 行性疾病的早期诊断对于人和动物的健康具有十分重大的意义。本发 明首次发现一种仅存在于脑组织中的蛋白N可溶性乙马来酰亚氨融 合蛋白附着蛋白β型（β-SNAPs），其表达和含量变化可以指示慢性神 经退行性疾病的早期发生，并开发出检测这种蛋白变化的蛋白质组学 方法，为慢性神经退行性疾病的早期诊断和早期发现开辟了新思路， 通过更深入的机理研究和损耗-时间曲线的建立，有助于将慢性神经 退行性疾病的损失降到最低。

本发明所采用的技术路线为：提取不同时间感染或未感染羊瘙痒 因子263K的同日龄同性别仓鼠，转基因阿茨海默症模型小鼠或正常 野生型小鼠的脑组织样品，进行二维电泳分析，通过专用软件（例如， Mascot，version2.3.02，Matrix Sciences公司）分析找出相对含量有明 显变化的蛋白，进行MALDI-TOF/TOF MS质谱分析，获得的串联光 谱通过专用软件在NCBInr数据库中进行搜索，从而分析出蛋白的名 称和氨基酸序列。结合蛋白的生物学功能，发现参与神经递质释放和 膜泡运输的蛋白β-SNAPs具有重要的研究意义。随后通过蛋白印迹 （Western Blot）对样品中的β-SNAPs进行定量分析，从而确定并印证 了β-SNAPs在脑组织中的早期含量降低变化和渐进性的损耗。并将 Western Blot对β-SNAPs的定量检测作为早期发现β-SNAPs含量变化 的有效检测方法之一。

本发明通过对朊蛋白感染的小鼠的脑组织进行二维电泳，并对差 异显著的蛋白点进行基质辅助激光解析电离飞行时间质谱 (MALDI-TOF-MS)分析，共发现7个可作为在朊蛋白病早期诊断的潜 在标记物，同时Western Blot结果也证实了该结果。这为朊蛋白病的 早期诊断和病理机制研究提供了新思路。

附图说明

图1为本发明实施例1中叙利亚仓鼠脑组织蛋白组二维电泳胶图； 其中，箭头指向质谱成功鉴定的蛋白。

图2为本发明实施例1中对照组和实验组中β-SNAPs蛋白在二维 凝胶上的变化。

图3为本发明实施例1中Western Blot检测β-SNAPs的变化量，结果 符合二维电泳结果。使用α/β-SNAPs兔多克隆抗体、anti-actin单克隆 抗体，A图中左侧三列为攻毒后四周、六周、八周β-SNAP表达量，右 侧三列为对应时期PBS对照组的β-SNAP表达量，再与β-actin进行相对 含量比较。B图数据分析得出β-SNAPs相对变化量和相对变化趋势。

图4为2-D标准蛋白参考图；图中选用pH值4-7的IPG胶条，a. Mw(kDa)77pI6/6.3/6.6，b.Mw(kDa)66.2pI5.4/5.6，c.Mw(kDa)43pI 5/5.1，d.Mw(kDa)36pI8.3/8.5，e.Mw(kDa)29pI5.9/6，f.Mw(kDa)21.5 pI4.6，g.Mw(kDa)17.6pI6.8/7.3。A图为标准蛋白单独进行二维电泳 的蛋白分布图，B图为标准蛋白说明书参考对照图。

图5为β-SNAPs的“损耗-时间曲线”图。

图6为MALDL-TOF质谱鉴定胰蛋白酶消化的β-SNAPs，标注肽段 符合β-SNAPs肽段质量理论值。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未 特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规 手段，所用原料均为市售商品。

实施例1慢性神经退行性疾病早期诊断标志物β-SNAPs的发现

1.脑组织样品的制备

对叙利亚仓鼠脑组织注入性状稳定、性能确定的羊瘙痒因子 263K。将由此感染痒病的仓鼠的脑匀浆50μl注入刚断奶的若干只叙利 亚仓鼠脑内。用同样剂量的PBS注入同日龄同性别的仓鼠脑内作为对 照。分别在注入后第4、6、8周，选择无组织形态学变化的仓鼠和对 照组仓鼠，对其进行安乐死，提取其脑组织并保存在-80℃冰箱中。 12月龄的雌性阿茨海默症转基因小鼠(The Jackson Laboratory) [B6C3-Tg(APPSWE,PSEN1dE9)85Dbo/Mmjax mice]及合适的野生型 正常对照小鼠的脑组织，同样在提取后保存在-80℃冰箱中。

2.样品处理

用含有全组分蛋白酶抑制剂混合物（Roche公司）的裂解缓冲液 [7M尿素，2M硫尿，2%（w/v）CHAPS，0.2%（v/v）两性载体，65mM 二硫苏糖醇（DTT）]使仓鼠的脑组织样品悬浮并匀浆均匀。在4℃下 对脑匀浆进行12个循环的超声(25%振幅)破碎处理（每个循环：超声 1s停5s）。在冰上放置30s后，25000×g离心1h（4℃）。用2-D定量试剂 盒（GE Healthcare公司）对离心后上清中的蛋白含量进行准确定量。 以每份样品中含450μg蛋白为标准，分装保存在-80℃中，以备二维凝 胶电泳和Western Blot使用。

3.二维凝胶电泳

对上述步骤中的脑组织蛋白样品进行再水化。水化缓冲液[7M尿 素，2M硫脲，2%(w/v)CHAPS，0.5%(v/v)两性载体，3%(w/v)DTT, 0.002%(v/v)溴酚蓝]加入蛋白样品中使得总体积为450μl。加入到24cm 长的固定pH4-7(非线性)梯度条上（GE Healthcare公司），于室温放置 18h。通过以下步骤进行等点聚焦（IEF）：250V2h,1000V2h，5000V 2h，3h渐进增至10000V（Hoefer IEF100系统）。样品条在0.5mM PH6.8 Tris-HCl缓冲液（6M尿素，30%甘油，2%SDS，2%DTT）中平衡18min， 然后，将缓冲液成分DTT换成2.5%碘乙酰胺后再平衡15min。将样品 条转移至12.5%SDS-PAGE凝胶中（Hoefer SE900系统）进行第二向 电泳分离，1瓦/胶电泳5h，2瓦/胶电泳30h。完成后取出凝胶，在固定 液（50%甲醇，5%乙酸）中固定1h后，在考马斯亮蓝染色液（20%甲 醇，10%磷酸，10%硫酸铵，0.125%考马斯G-250）中染色过夜。

4.图像分析

染色后凝胶用扫描仪（UMAX Power Look2100XL-USB）在 500dpi下进行扫描。图像通过Dymension software专用分析软件 (Syngene公司)进行分析。对至少3次相互独立的试验结果进行t检验。 选择光强度差异在1.5倍或以上的蛋白点（p<0.05），用以进行下一步 质谱分析，其中包括β-SNAPs蛋白。

5.质谱仪分析及β-SNAPs的发现

从凝胶上切下被选择的蛋白点，置于1.5mL的Eppendorf管中，三 蒸水冲洗两遍，用100mM碳酸氢铵冲洗数次，再用100%纯乙腈脱水， 置于冷冻真空干燥泵中冷冻干燥。每个样品管中加入50μL含10Mm DTT的100mM碳酸氢铵，57℃还原作用1h，待室温冷却后去掉过量液 体，随后迅速加入用100mM碳酸氢铵新鲜配制的55mM IAA，室温暗 处放置烷基化30min。反应完成后用100mM碳酸氢铵冲洗2次，再用 纯乙腈脱水后加入等体积的100mM碳酸氢铵冻干。每管用25μL胰蛋 白酶进行消化，37℃过夜。用5%三氟乙酸（TFA）/50%乙腈（ACN） 萃取两次，每次15min，合并萃取液冻干。向萃取后冻干的样品中加 入0.8μL基质CHCA(α-cyano-4-hydroxy-cinnamic acid)溶液（0.5g/L，溶 剂0.1%TFA/50%ACN），上MALDL靶板，在室温下自然干燥。另外， 点0.5μL未加样品的0.5g/L CHCA溶液作为空白对照。用 MALDI-TOF/TOF高分辨率串联质谱仪进行分析。MS结束后直接选择 与对照基质的PMF图有差异、质量范围700-3200Da和最小信噪比为 20的肽段进行MS/MS分析。串联光谱用Mascot，version2.3.02(Matrix Sciences公司)软件对NCBInr数据库进行搜索以确定蛋白的名称和氨 基酸序列，MSCOT对蛋白的评分不小于59分视为鉴定成功的蛋白。 若一个蛋白点检测出多个蛋白，结合2-D标准蛋白（宝生物工程有限 公司）（图4）估计其的分子质量并进行pI检验，选择分数较高的蛋白。

共发现7个可作为在朊蛋白病早期诊断的潜在标记物（包括 β-SNAPs蛋白），表1所示为成功鉴定的蛋白信息。

表1通过MALDI-TOF/TOF MS分析鉴定出表达的不同蛋白

对质谱分析所确定的蛋白进行生物学作用分析，结合二维凝胶电 泳图像的光强差异，可以发现β-SNAPs蛋白具有重大的研究意义。 β-SNAPs在海绵状脑病和阿茨海默症患病动物脑内在无症状期就出 现了显著减少，且随着感染时间的延长，β-SNAPs的含量越来越少。 β-SNAPs参与神经递质释放和膜泡运输，是完成突触传递不可或缺的 蛋白。它的含量减少，直接引起记忆、运动能力的降低，结合国内外 文献对此蛋白的研究，可以推断β-SNAPs与慢性神经退行性疾病有直 接关系，并由于其在疾病早期含量的显著变化，符合慢性神经退行性 疾病生物学标志物的特征。

6.Western Blot验证

取出步骤2中提取的蛋白样品，用含50μg蛋白的样品进行Western  Blot分析（BIO-RAD公司）。成组成对进行Western Blot分析，263K感 染仓鼠、阿茨海默症转基因小鼠分别与其相应的对照组进行分析。分 析均保证3次重复以保证结果真实性。步骤如下：

聚丙烯酰胺凝胶电泳：按常规方法配制12%SDS-PAGE凝胶，每 孔加样10μl，电泳条件为浓缩胶90V25min，分离胶120V90min。

电转：80V4h。

封闭：5%脱脂奶粉，37℃1h。

一抗孵育：α/β-SNAPs兔多克隆抗体（Santa Cruz Biotechnology 公司），100倍稀释，4℃孵育过夜，洗涤3次，每次5min。

二抗孵育：选用辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔抗体，37℃孵育 1h,洗涤3次，每次5min。

显色：用BIO-RAD的化学发光液显色，ChemiDoc凝胶成像系统 进行图像采集。

脱抗体和β-actin再孵育：洗去已经显色过的抗体，用anti-actin单 克隆抗体和相应的二抗对β-actin进行孵育，曝光后与β-SNAPs进行相 对含量比较，以消除上样样品中蛋白含量不同的影响。

Western Blot分析进一步确定了β-SNAPs确实在传染性海绵状脑 病和阿茨海默症的无症状早期即出现了显著降低，并且在传染性海绵 状脑病中随着感染时间的延长，β-SNAPs还出现了渐进性的损耗（图 5）。由此证明β-SNAPs与慢性神经退行性疾病发生发展的直接关系， 从而证明β-SNAPs作为慢性神经退行性疾病生物学标志物的可行性。 而Western Blot分析方法是用于测定β-SNAPs在疾病早期进程中含量 变化的行之有效的方法。

图1为叙利亚仓鼠脑组织蛋白组二维电泳胶图；其中，箭头指向 质谱成功鉴定的蛋白（见表1）。IPG胶条pH范围4-7，右侧分子量根据 2-D标准蛋白确定。

图2为对照组和实验组中β-SNAPs蛋白在二维凝胶上的变化。攻 毒后四周、六周、八周β-SNAP表达变化；其中，箭头指向SNAP蛋 白，结果由质谱鉴定所得，肉眼可见蛋白从攻毒后四周开始逐渐减少。

图3为Western Blot检测β-SNAPs的变化量，结果符合二维电泳的 结果。攻毒后四周出现减少，六至八周减少较明显。使用α/β-SNAPs 兔多克隆抗体、anti-actin单克隆抗体，A图中左侧三列为攻毒后四周、 六周、八周β-SNAP表达量，右侧三列为对应时期PBS对照组的β-SNAP 表达量，再与β-actin进行相对含量比较。B图数据分析得出β-SNAPs 相对变化量和相对变化趋势。

图4为2-D标准蛋白在2-DE凝胶上的分布（2-D标准蛋白参考图）。 本发明中选用pH值4-7的IPG胶条，图中a.Mw(kDa)77pI6/6.3/6.6，b. Mw(kDa)66.2pI5.4/5.6，c.Mw(kDa)43pI5/5.1，d.Mw(kDa)36pI 8.3/8.5，e.Mw(kDa)29pI5.9/6，f.Mw(kDa)21.5pI4.6，g.Mw(kDa)17.6 pI6.8/7.3。A图为标准蛋白单独进行二维电泳的蛋白分布图，B图为 标准蛋白说明书参考对照图。

图6为MALDL-TOF质谱鉴定胰蛋白酶消化的β-SNAPs，标注肽段 符合β-SNAPs肽段质量理论值。

实施例2慢性神经退行性疾病早期诊断标志物β-SNAPs的应用

本发明还提供所述标志物β-SNAPs在制备慢性神经退行性疾病 早期诊断试剂中的应用。具体为：以β-SNAPs作为免疫原，通过免疫 动物，获得相应抗体，将制备的抗体作为诊断试剂或诊断试剂中的有 效成分。

利用上述诊断试剂制备得到慢性神经退行性疾病早期诊断试剂 盒，从而为疾病的早期诊断提供可能。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详 尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本 领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础 上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

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