利用表面等离子共振传感器检测抗草甘膦CP4-EPSPS蛋白的方法

摘要

本发明公开了利用表面等离子共振传感器检测CP4-EPSPS蛋白的方法。本发明提供了一种制备用于检测目的蛋白的SPR金片的方法，包括如下步骤：1）用巯基十一酸和3-巯基丙酸共修饰SPR金片，得到修饰后金片；2）将抗目的蛋白抗体固定到所述修饰后金片，得到用于检测所述目的蛋白的SPR金片。本发明的实验证明，本实验基于抗原抗体特异性结合的原理，依托SPR检测平台，建立了对CP4-EPSPS蛋白的新的检测方法，此方法相比较于常规的蛋白检测方法其优点在于，检测灵敏度高，操作简便、快捷，特异性好，为抗草甘膦作物的检测提供了一种新的可行性方法。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种利用表面等离子共振传感器检测抗草甘 膦CP4-EPSPS蛋白的方法。

背景技术

草甘膦是由美国孟山都公司于20世纪70年代开发的除草剂产品，是一种非选择 性、无残留灭生性除草剂，对多年生根杂草非常有效，广泛应用于农业生产当中，是 目前全世界使用量最大的除草剂品种之一。据美国环境保护协会估计，2007年全球草 甘膦使用量约为82000-84000吨。中国自上世纪八十年代起开始生产草甘膦，现已成 为仅次于美国的世界第二大草甘膦生产和出口国。

草甘膦的作用机理主要是竞争性抑制莽草酸途径中5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合 成酶(EPSPS)的活性，导致分支酸合成受阻，阻断芳香族氨基酸和一些芳香化合物的生 物合成，从而扰乱了生物体正常的氮代谢而使其死亡。但由于草甘膦的非选择性，使 其对农作物同样有着杀伤性，这就限制了其使用范围和使用时间。而抗草甘膦基因是 编码抗草甘膦酶5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶的基因，通过该酶的作用，可 以阻断草甘膦对生物合成途径的干扰，从而使菌种或植物不被草甘膦杀灭。因此，农 作物中转入该基因，可使施用于农田的草甘膦只作用于杂草，而不影响作物的正常生 长，因此，对于提高作物产量及减轻劳动量、提高劳动效率大有帮助，现在具有草甘 膦抗性的转基因大豆已占全球大豆种植面积的约60%。随着草甘膦的广泛使用，抗草 甘膦作物也迅速的发展起来，1996年第一种抗草甘膦大豆在美国开始种植，目前抗草 甘膦作物在美国、阿根廷、巴西等地已逐渐成为主要种植作物。近年来，随着转基因 植物研究的迅猛发展，转基因植物产品品种及产量也大幅增加，在这种情况下，有关 转基因产品的安全问题也日益凸显。因此研究行之有效的转基因植物检测方法就显得 尤为重要。

CP4-EPSPS蛋白是抗草甘膦蛋白中的一种，由CP4-EPSPS基因编码，来自根癌农 杆菌CP4菌株，参与植物中芳香族氨基酸的合成。CP4-EPSPS由于其对草甘膦的高抗 性而被广泛的用于商业化。目前，CP4-EPSPS蛋白的检测主要采用ELISA、试纸条法、 免疫印迹法等。

表面等离子共振（SPR）是当入射光以一个特殊的角度照射到金属表面发生的一种 光学现象，可被用来实时跟踪在天然状态下生物分子间的相互作用，常用于抗原、抗 体间相互作用的研究。相比传统的蛋白检测方法，这种方法对生物分子无任何损伤， 且不需任何标记物。

到目前为止，研究者已经从微生物和植物中克隆出了许多种抗草甘膦基因，但 CP4-EPSPS基因却是唯一在商品化生产中应用的抗草甘膦基因，其他抗草甘膦基因都 未能达到生产应用的水平。而由于目前社会各界对于转基因植物的安全性还存有广泛 争议，转基因产品的安全问题备受公众关注。因此，对于转基因产品的检测就显得尤 为重要。

发明内容

本发明的目的是提供一种制备用于检测目的蛋白的SPR金片的方法，包括如下步 骤：

1）用巯基十一酸和3-巯基丙酸共修饰SPR金片，得到修饰后金片；

2）将抗目的蛋白抗体固定到所述修饰后金片，得到用于检测所述目的蛋白的SPR 金片。

上述方法中，上述SPR金片为单侧镀金片，12mm×20mm，单侧镀金50nm，BioNavis 公司，货号QSX301-Au-13052。

步骤1）中，所述巯基十一酸和3-巯基丙酸共修饰SPR金片按照如下方法制备： 将所述SPR金片浸泡在含有巯基十一酸和3-巯基丙酸的乙醇溶液中。

步骤1）中，所述浸泡为4℃浸泡24h；

上述方法中，

步骤1）中，所述含有巯基十一酸和3-巯基丙酸的乙醇溶液中，所述巯基十一酸 和所述3-巯基丙酸的摩尔比为1:1。

上述方法中，

所述巯基十一酸在所述溶液中的终浓度为10mM；

所述3-巯基丙酸在所述溶液中的终浓度为10mM。

上述方法中，

步骤2）中，将抗目的蛋白抗体固定到所述修饰后金片为将所述抗目的蛋白抗体 与所述修饰后金片上的巯基十一酸和3-巯基丙酸通过共价键连接。

所述将抗CP4-EPSPS抗体固定到所述修饰后金片具体按照如下方法制备：先用含 有EDC和Sulfo-NHS的溶液滴于所述修饰后金片表面，常温（25℃）下静置2小时； 再滴加所述抗CP4-EPSPS抗体，37℃反应3小时；再滴加浓度为2mg/mL BSA，25℃ 下静置2小时，得到用于检测所述CP4-EPSPS的SPR金片；

含有EDC（N-乙基-N'-(二甲氨基丙基)碳二亚胺）和Sulfo-NHS（N-羟基硫代琥珀 酰亚胺）的溶液：EDC和Sulfo-NHS溶于MES溶液，使EDC在溶液中的终浓度为0.4M， NHS在溶液中的终浓度为0.1M。

MES（脂肪酸甲酯磺酸盐）溶液：称取3.90g MES溶于180mLddH2O，调节pH至 5.0，定容到200mL。

上述方法中，

所述抗目的蛋白抗体为单克隆抗体或多克隆抗体。

上述方法中，

所述目的蛋白为抗草甘膦蛋白，所述抗草甘膦蛋白具体为CP4-EPSPS；

所述抗目的蛋白抗体为抗CP4-EPSPS单克隆抗体。

由上述的方法制备的用于检测目标蛋白的SPR金片也是本发明保护的范围；所述 目的蛋白具体为抗草甘膦蛋白。

上述的用于检测目标蛋白的SPR金片在检测目标蛋白中的应用也是本发明保护的 范围；所述目的蛋白具体为抗草甘膦蛋白。

上述的用于检测目标蛋白的SPR金片在检测抗除草剂转基因植物中的应用也是本 发明保护的范围；所述除草剂具体为草甘膦。

本发明的实验证明，本实验基于抗原抗体特异性结合的原理，依托SPR检测平台， 建立了对CP4-EPSPS蛋白的新的检测方法，此方法相比较于常规的蛋白检测方法其优 点在于，检测灵敏度高，操作简便、快捷，特异性好，为抗草甘膦作物的检测提供了 一种新的可行性方法。

附图说明

图1为SPR检测CP4-EPSPS蛋白的灵敏度

图2为SPR检测CP4-EPSPS蛋白的特异性

图3为SPR检测转基因实际样品

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到，部分 列举如下：

SPR金片为单侧镀金玻璃片（12mm×20mm，单侧镀金50nm，BioNavis公司）；蒸 馏水；无水乙醇；30%氨水，30%双氧水（均为分析纯）；巯基十一酸（11-MUA）（Sigma 公司）；3-巯基丙酸（3-MPA）；脂肪酸甲酯磺酸盐（MES）；N-乙基-N′-（二甲基氨基丙 基）碳二亚胺（EDC）；N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）；CP4-EPSPS蛋白（序列1）及抗CP4-EPSPS 单克隆抗体（购自北京陆桥质检科技有限公司）；Tris-HCl(pH6.0)；牛血清白蛋白 （BSA）；恒温干燥箱；SPR Navi200传感器（BioNavis公司）。

下述实施例中所用的溶液的配置：

（1）3-巯基丙酸（3-MPA）乙醇溶液（10mM）：用分析天平称取0.1061g3-MPA 溶于100mL无水乙醇中，混匀。

（2）巯基十一酸（11-MUA）乙醇溶液（10mM）：用分析天平称取0.2183g11-MUA 溶于100mL无水乙醇中，混匀。

（3）MES（脂肪酸甲酯磺酸盐）溶液：用分析天平称取3.90g MES溶于180mL ddH2O， 调节pH至5.0，定容到200mL。

（4）含有EDC（N-乙基-N'-(二甲氨基丙基)碳二亚胺）和Sulfo-NHS（N-羟基硫 代琥珀酰亚胺）的溶液：EDC和Sulfo-NHS溶于MES溶液，振荡均匀，使EDC在溶液 中的终浓度为0.4M，NHS在溶液中的终浓度为0.1M。现用现配。

（5）磷酸盐缓冲液（PBS，pH7.4）：用分析天平分别称取4g NaCl、0.72g Na2HPO4、 0.12g KH2PO4和0.1g KCl溶于480mL灭菌后的蒸馏水中，使用酸度仪和HCl调节缓 冲液的pH至7.4；然后再向瓶中加入灭菌蒸馏水，定容到500mL。

（6）Tris-HCl（0.1M，pH6.0）：用分析天平称取1.211g Tris-base溶于80mL 的ddH2O，用HCl调节pH至6.0，然后定容到100mL。

1、SPR金片预处理

按体积比30%氨水、30%双氧水及蒸馏水按照1:1:5放入小烧杯中混合均匀，放入 SPR金片在85℃的水浴锅中处理10min后立即取出，用蒸馏水及无水乙醇分别清洗金 片表面，氮气吹干，得到预处理SPR金片，然后用于后续实验。

2、修饰SPR金片

含有11-MUA和3-MPA乙醇溶液按照如下方法制备：将11-MUA和3-MPA溶于无水 乙醇中，得到的溶液，其中：11-MUA在溶液中的终浓度为10mM，3-MPA在溶液中的终 浓度为10mM。

将上述1得到的预处理SPR金片置于装有含有11-MUA和3-MPA乙醇溶液的玻璃瓶 中，为了防止溶液挥发用封口膜封闭瓶口，4℃浸泡24h，得到11-MUA和3-MPA共修 饰的SPR金片。

3、固定抗CP4-EPSPS单抗的SPR传感器金片

将抗CP4-EPSPS单抗固定到修饰后金片为将抗CP4-EPSPS单抗与上述2得到的 11-MUA和3-MPA共修饰的SPR金片上的11-MUA和3-MPA通过共价键连接；具体方法 如下：

1）活化

用无水乙醇淋洗上述2得到11-MUA和3-MPA共修饰的SPR金片表面，然后用氮气 干燥，再将含有0.4M的EDC和0.1M的Sulfo-NHS的溶液）均匀滴加在SPR金片表面， 常温（25℃）下静置2小时，用以活化固定在SPR金片表面的11-MUA和3-MPA的硫醇 羧基，得到活化的金片。

2）固定单抗

倒掉经过1）处理的活化的金片上的含有0.4M的EDC和0.1M的Sulfo-NHS的溶 液，用无水乙醇清洗金片表面，并用氮气吹干表面；将Tris-HCl（0.1M，pH6.0）稀 释MCMV单抗浓度为0.2mg/mL，然后将单抗溶液均匀地滴加在SPR金片表面，放在调 好温度的（37℃）恒温箱内反应3小时，3小时后用MilliQ水清洗SPR表面残留的单 抗溶液并用氮气吹干；在SPR金片表面滴加BSA，浓度为2mg/mL（PBS稀释），常温（25℃） 下静置2小时，达到封闭未结合的NHS-酯基的目的；然后清洗金片表面，用氮气吹干 待用（存放于PBS溶液中，4℃），得到固定抗CP4-EPSPS单抗的SPR金片。

实施例2、利用表面等离子共振传感器检测CP4-EPSPS蛋白

表面等离子共振传感器检测方法如下：取出固定抗CP4-EPSPS单抗的SPR金片， 用蒸馏水洗净，氮气吹干，然后放入SPR传感器的指定位置中，打开仪器和监测软件， 通入PBS（使用前需超声），流速为10ul/min，待反应池及棱镜温度达到设置温度后 进行初始角度扫描（一般将反应温度设置为低于室温1-2℃），找到固定角后进行固定 角扫描，待基线稳定后，用进样注射器注入300ul待测样品溶液（PBS稀释），通过SPR 检测软件实时观察反应过程。

1、SPR检测CP4-EPSPS蛋白的灵敏度

将待测抗原CP4-EPSPS蛋白（氨基酸序列为序列1）用PBS稀释成5μg/mL、 1μg/mL、500ng/mL、100ng/mL、50ng/mL、10ng/mL和1ng/mL，取100μL的每个浓 度的CP4-EPSPS蛋白按照上述的方法进行SPR检测。

结果如图1所示，进样后约30s开始产生响应，表明待测样品流经金片表面时与 结合在金片表面的单抗发生特异性结合，引起金片表面折射率的变化，使SPR角度发 生偏移。样品浓度越高，响应值越大，说明结合在金片表面的抗原越多。从实验结果 可以看出，使用SPR检测CP4-EPSPS蛋白的最低检测限为1ng/mL。

2、SPR检测CP4-EPSPS蛋白的重复性

选取7种不同浓度5μg/mL、1μg/mL、500ng/mL、100ng/mL、50ng/mL、10ng/mL 和1ng/mL的待测抗原CP4-EPSPS蛋白按照上述的SPR检测方法重复检测3次，计算其 平均值及标准差。

结果如表1所示，每次检测都有明显的反应，且同一浓度的响应值差异很小，随 蛋白浓度的降低反应响应值也相应减小，表明SPR检测CP4-EPSPS的重复性较好。

表1为SPR检测CP4-EPSPS蛋白的重复性

3、SPR检测CP4-EPSPS蛋白的特异性

为了验证SPR检测CP4-EPSPS蛋白的特异性，选用由Bt基因编码的Bt蛋白 cry1Ah（序列2）作为对照，分别用两种蛋白CP4-EPSPS和cry1Ah单独及其混合进行 进样，单独蛋白均以5ug/ml浓度进样，混合（mix）蛋白浓度为5ug/ml（等体积混合）， 按照上述的SPR检测方法进行特异性检测实验。

结果如图2，CP4-EPSPS蛋白和混合蛋白mix有明显响应，而Bt蛋白cry1Ah则未 出现明显相应，由此可见此方法检测CP4-EPSPS蛋白具有较好的特异性。

4、SPR检测待测样品中的CP4-EPSPS蛋白

称取100mg转基因含量分别为0.1%转基因玉米（0.1%Mon810，已经证明含有 CP4-EPSPS蛋白）和0.01%转基因玉米（0.01%Mon810，已经证明含有CP4-EPSPS蛋白） （欧盟联合研究中心标准物质与计量研究所，ERM-BF-413gk），使用研磨仪将样品砸成 粉末，用1000ul PBS溶解样品，室温（25℃）静置10min,12000r离心10min，吸取 上清液后过滤。按照上述方法用SPR进行检测。

结果如图3所示，可以看出，两个浓度的转基因玉米溶液均有响应，因此可知此 方法可用作检测实际的转基因样品。