一种外表面亲水性杂化复合固相萃取吸附剂的制备方法

摘要

本发明涉及一种外表面亲水性杂化复合固相萃取吸附剂的制备方法，包括以下步骤：a、将苯乙烯、二乙烯基苯、乙烯基三乙氧基硅烷加入到乙腈中，再加入偶氮二异丁腈，超声，回流，得溶液A；b、将正硅酸乙酯、乙醇和浓盐酸混合，振荡，得溶液B；c、将溶液B滴加到溶液A，离心，得聚合物C；d、将聚合物C和γ-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷的甲苯溶液混合，回流，离心，洗涤，干燥；f、再加入高氯酸，反应完全后，过滤，洗涤，干燥即可。本发明制备的吸附剂能够在高效吸附目标物的同时，排阻生物大分子吸附在其表面，具有溶胀度适宜、热稳定性好、吸附能力强、不易收缩变形、使用寿命长等特性，适于药残检测中四环素类抗生素的分离萃取。

说明书

技术领域

本发明涉及萃取分离材料的制备方法，具体地说涉及一种外表面亲水性杂化复合固相萃取吸附剂的制备方法。

背景技术

兽药滥用极易造成动物源食品中有害物质的残留，这不仅对人体健康造成直接危害，而且对畜牧业的发展以及对我国农产品出口贸易也产生了严重影响。目前美国、日本、欧盟及我国均规定了动物源性食品中各类药残的限量。分析测定药残的方法有气相色谱-质谱联用、液相色谱-质谱联用、高效液相色谱和毛细管电泳等。而决定分析测定方法的准确性和精确度的关键步骤是样品的前处理，即从被测样品中萃取并吸附所要测得的药物。所以，样品前处理使用的萃取吸附材料已成为样品安全分析技术中的关键因素，也是限制药残检测灵敏度的瓶颈。

目前，固相萃取柱中所使用的固体吸附材料的种类较多，主要包括：1、吸附型填料，如硅藻土、氧化铝、活性炭、硅胶、硅酸镁等；2、化学键合相硅胶填料，如腈基、氨基、二醇基(正相)、C₈、C₁₈ (反相)等；3、离子交换填料，如季胺、二氨基、氨基、羧基、苯磺酸基等。但是这些传统固相萃取吸附剂存在着吸附能力差、溶胀度大、萃取对象受限制、使用寿命短等缺点，远远不能满足对复杂基质中痕量分析物检测的要求。为了提高材料的吸附性能，研究人员通常会将现有材料如杂化复合吸附材料进行基团修饰。如CN 102993229 A公开了一种两性电解质修饰的杂化硅胶材料及其固相萃取方法，该方法以四乙氧基硅烷和氨丙基三乙氧基硅烷为前体分子，以十六烷基三甲基溴化铵为模板剂，形成表面含有胺基的杂化硅胶材料；将杂化硅胶与戊二醛的醛基反应生带C=N键的杂化硅胶材料；将杂化硅胶材料上的戊二醛另一端醛基与带胺基和羧基的两性电解反应生成带双C=N键的杂化硅胶材料；再用 NaCNBH₃还原，使C=N还原成C-N形成带多－NH₂和多－COOH 的杂化硅胶材料。通过两性电解质修饰的杂化硅胶材料，在杂化硅胶支链上键合含有胺基和羧基的两性电解质，得到表面带两性基团的杂化硅胶材料。该方法制备的吸附剂可以在一种材料上同时发挥阴阳离子交换的优势，实现对酸性、中性和碱性样品的同步萃取，且吸附和解吸速度快，重现性好，回收率高，可在一定程度上提高分离速度。又如，李龙飞等研究了基于溶胶凝胶技术的在线固相萃取与高效液相色谱联用测定饮用水中的雌激素残留[色谱, 2014, Vol.32 No.2: 194-197]，其具体方法是将乙腈注入具塞的圆底烧瓶中，加入APTES，磁力搅拌反应 30 min；加入 TEOS，继续搅拌 20 min；再加入醋酸，磁力搅拌，置于水浴锅中孵化，过滤，用甲醇洗涤，于真空干燥箱中下老化，将所得材料研磨成粉作为固相萃取柱的填料吸附剂。将样品通过该材料的萃取吸附前处理，经过条件优化，联合液相色谱检测水样中的雌激素。但是，在实际使用过程中发现，现有的这些吸附材料用于分离萃取复杂样品中的目标小分子时，其样品中的生物大分子会吸附在其表面上，这不仅影响待测物的吸附效率，而且萃取得到的待测液中杂质含量较高，严重干扰仪器对待测物后续检测的准确性和精确度。此外，这些杂化复合材料通常采用溶胶凝胶法合成，这不仅需要较长的陈化时间，而且制备的材料在干燥的过程中易收缩变形，研磨时容易破坏孔结构；如果对其进行修饰，则存在工艺繁琐、被修饰的基团无法控制、修饰过程中生成的副产物不容易分离、修饰后的材料无法满足使用需求等缺陷。

发明内容

本发明的目的就是提供一种外表面亲水性杂化复合固相萃取吸附剂的制备方法，以解决现有方法制备的固相萃取材料存在外表面容易吸附生物大分子、刚性差、易收缩变形、热稳定性差、溶胀度较高、分离吸附效率低、分离样液杂质含量高、检测精准性差的问题。

本发明的目的是这样实现的：一种外表面亲水性杂化复合固相萃取吸附剂的制备方法，包括以下步骤：

 a、将苯乙烯、二乙烯基苯、乙烯基三乙氧基硅烷按体积比为3 : 1 : 5.88加入到乙腈溶剂中混合，在混合液中加入偶氮二异丁腈，超声，回流，搅拌，得溶液A；所述偶氮二异丁腈与苯乙烯的质量体积比为1 : 6；

b、将正硅酸乙酯、乙醇和浓盐酸按体积比为1.63-4.90 : 3.02-9.05 : 0.07-0.2混合，40-60℃恒温振荡，得溶液B；

c、将溶液B逐滴加入到溶液A中，搅拌回流，得乳浊液，将乳浊液离心，将离心沉淀物干燥，得聚合物C；所述溶液A中的苯乙烯与溶液B中的正硅酸乙酯摩尔比为1 : 2.5-4.2；

d、将聚合物C和体积比浓度为8-14%的γ-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷的甲苯溶液混合，搅拌回流，离心，将离心沉淀物洗涤，干燥，得粒状聚合物D；所述聚合物C与γ-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷的甲苯溶液的质量体积比为1 : 1.28-2.24；

f、将聚合物D与体积比浓度为10%的高氯酸溶液按质量体积比为1 : 5混合，搅拌，反应完全后，过滤，将滤渣洗涤，真空干燥，得外表面亲水性杂化复合固相萃取吸附剂。

本发明步骤a所述乙腈与苯乙烯的体积比为3.75 : 1。

本发明步骤b所述正硅酸乙酯、乙醇和浓盐酸的体积比为2.95 :4.525 : 0.1。

本发明步骤c所述溶液A 的苯乙烯和溶液B的正硅酸乙酯摩尔比为1 : 2.5。

本发明步骤d所述γ-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷的甲苯溶液的体积比浓度为10%。

本发明步骤f所述聚合物C和γ-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷的甲苯溶液的质量体积比为1 : 1.6。

本发明采用了沉淀聚合法，选择了适当的组分配比，制备了有机-无机杂化复合物，再用γ-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷对其表面进行修饰，合成了内表面疏水、外表面亲水的杂化复合固相萃取吸附剂。该吸附剂的结构特性可以使样品中的模板小分子化合物快速吸附和富集在吸附剂的孔内，而样品中的生物大分子被排阻在材料的外层，从而，在实现待测目标物快速分离的同时，达到其杂质含量明显降低、检测的准确性和精确度显著提高的目的。

本发明中制备有机-无机杂化复合材料采用苯乙烯沉淀聚合法代替了传统溶胶凝胶合成法，不仅缩短了反应时间，而且可以直接将疏水基团共聚并均匀分布于杂化复合物的孔道内部，这就解决了传统修饰工艺无法控制疏水基团而导致疏水基团堵塞材料孔道的问题，也简化了繁琐复杂的修饰过程。同时，本发明制备的有机-无机杂化复合物呈均匀的粒状固体，这不仅为下一步基团修饰提供了更好的反应环境，而且使得修饰产生的副产物更容易分离去除，使最终得到的吸附剂无需研磨即可填加在萃取柱内使用。 

本发明通过特定的制备方法将杂化复合材料与基团修饰相结合制备了外表面亲水、内表面疏水的杂化固相萃取吸附剂，其具有制备方法简单，吸附能力强、分离效率高、热稳定性好、溶胀度适宜、熔点高、刚性强、不易收缩变形、使用寿命长等特性，适用于药残检测前处理的分离萃取，尤其适用于四环素类抗生素的分离萃取。

附图说明

图1是本发明的合成原理示意图。

图2是实施例1及对比例的热重示意图：硅胶(a)，RAM(b)，PSt-KH151 (c)，PSt(d)。

图3是实施例1及对比例制备的吸附剂对生物大分子的排阻性能测试图。

图4是实施例1制备的吸附剂结构的反向特性测试图。

图5是实施例1制备的吸附剂分离样品测定色谱图。

图6是实施例1制备的吸附剂刚性测试图。

具体实施方式

下面实施例用于进一步详细说明本发明，但不以任何形式限制本发明。

实施例1

（1）分别量取2.25 mL乙腈?0.6 mL苯乙烯?0.2 mL二乙烯基苯和1.176 mL乙烯基三乙氧基硅烷于三口瓶中，加入0.10 g偶氮二异丁腈，经超声溶解后，持续充氮气30 min，65 ℃下回流，约1 h后出现大量白色颗粒；继续搅拌2 h，得有机部分溶液A；

（2）将2.95 mL正硅酸乙酯、4.525 mL的乙醇和0.1 mL浓盐酸同时加入到锥形瓶中，在恒温振荡器中60 ℃（在40-60 ℃之间的其他任何温度下）下震荡1 h，得澄清溶液，得无机部分溶液B；

（3）将溶液B逐滴加入到溶液A中后，继续在65 ℃下搅拌回流3 h。即得到乳白色浊液，将生成的乳白色浊液均匀装入离心管中以1400 r/min离心4 min，去除上清液，将离心沉淀物转移到表面皿后放入恒温烘箱65 ℃下干燥，得到有机-无机杂化材料，即聚合物C；

（4）将干燥好的聚合物C置于250 mL圆底烧瓶中，加入80 mL体积比浓度为10%的γ-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷的甲苯溶液中搅拌回流7 h；离心，依次用10 mL的甲苯、丙酮洗涤，干燥，得固态粒状聚合物D；

（5）将固态粒状聚合物D与25 mL的高氯酸（10/90，v/v）混合后200 rpm室温搅拌24 h，反应完全后，过滤，弃滤液，将滤渣颗粒依次用50 mL乙醇，50 mL四氢呋喃，100 mL水洗涤，在60 oC真空干燥箱过夜干燥，得外表面亲水性杂化复合固相萃取吸附剂（RAM-HCM1）。

实施例2

在实施例1的步骤（2）中加入1.63 mL的正硅酸乙酯，3.02 mL的乙醇，0.07 mL的浓盐酸，其它同实施例1，可得RAM-HCM2。

实施例3

在实施例1的步骤（2）中加入4.90 mL的正硅酸乙酯，9.05 mL的乙醇，0.20 mL的浓盐酸，其它同实施例1，可得RAM-HCM3。

实施例4

在实施例1的步骤（4）中加入的γ-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷的甲苯溶液的体积比浓度为8%，其它同实施例1，可得RAM-HCM4。

实施例5

在实施例1的步骤（4）中加入的γ-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷的甲苯溶液的体积比浓度为12%，其它同实施例1，可得RAM-HCM5。

实施例6

在实施例1的步骤（4）中加入的γ-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷的甲苯溶液的体积比浓度为14%，其它同实施例1，可得RAM-HCM6。

对比例1

分别量取2.25 mL乙腈?0.6 mL苯乙烯和0.2 mL二乙烯基苯于三口瓶中，加入0.10 g偶氮二异丁腈，经超声溶解后，持续充氮气30 min，65℃下回流，出现大量白色颗粒后，继续搅拌至反应完全，待温度降到室温，过滤，60 ℃干燥，得到白色聚苯乙烯颗粒（PSt）。

对比例2

分别量取2.25 mL乙腈、0.6 mL苯乙烯、0.2 mL二乙烯基苯和1.176 mL乙烯基三乙氧基硅烷于三口瓶中，加入0.10 g偶氮二异丁腈，经超声溶解后，持续充氮气30 min，65 ℃下回流，大约1 h后出现大量白色颗粒；继续搅拌2 h，待温度降到室温，过滤，60 ℃干燥，得到苯乙烯与乙烯基三乙氧基硅烷偶联的材料（PSt-KH151）。

对比例3

在30 ℃下，在56.4 mL的乙醇和18 mL的水中加入4.28 mL的氨水和0.076 g的十六烷基三甲基溴化铵，磁力搅拌5 min，体系澄清稳定后，缓慢加入0.458 mL的正硅酸乙酯，440 r/min下搅拌2 h，离心，乙醇超声3次，540 ℃煅烧6 h，得到硅胶。

实施例7

实施例及对比例的亲水性能测定：水吸附率、接触角及与牛血清蛋白的键合率。

（1）水吸附率的测定

分别称量一定质量的聚合物与1 mL水混合，震荡2 min，室温下静置6 h，过滤，称量聚合物的质量(W_s)。然后将聚合物在65 ℃下干燥至质量不变(W₀)。

水吸附率（Sr）的计算公式为Sr (%) = [(W_s-W₀)/ W₀]×100，其中Ws代表吸附后的聚合物质量，W₀干燥后的聚合物质量。

（2）接触角的测定

将上述材料分别用压片机压片，直接用接触角测定仪测定。

（3）牛血清蛋白（BSA）键合百分数的测定

在聚四氟乙烯小柱的底端塞好玻璃棉，放入称好的50 mg的聚合物，并在另一端塞好玻璃棉。首先用1 mL甲醇活化吸附位点，再用大量的水清洗，准备上样；配制1 mg/mL的牛血清蛋白溶液，取4 mL上样；各取上样前后的溶液100 μL，用蒸馏水分别稀释到5 mL，分别用紫外分光光度计检测其吸光度，计算键合率。牛血清蛋白的键合率W=（1-A₂/A₁）×100%，其中A₁为固相萃取前的吸光度，A₂为经过固相萃取后的吸光度。

检测结果如表1所示。

表1 聚合物的亲水性能：水吸附率、接触角和BSA键合率

从表1的结果显示：聚苯乙烯具有较强的疏水性，水吸附率较低，但是对牛血清蛋白的键合率较高，不利于蛋白的有效排阻。硅胶具有较低的牛血清蛋白键合率，但是水吸附率高，长期的溶剂浸泡易溶胀，导致使用寿命短。而RAM-HCM结合了两者的优势，在提高外表面的亲水性，更有效的排阻蛋白的同时降低了水吸附率。其综合考虑，RAM-HCM1外表面亲水性好，水吸附率较低，牛血清蛋白的键合率低，因而可以作为理想的吸附剂填料。

实施例8

实施例1及对比例1-3的热重示测试实验。具体方法如下：

打开热重仪的冷凝水，通电预热半小时，称取一定质量的待测物加入小坩埚并放到热电偶上。双手托起加热炉并放回原处。设置热分析软件的程序控温，升温速率为20 ℃/min，升至高温900 ℃。

测定结果如图2所示：硅胶接近一条直线，说明一直没有分解，聚苯乙烯剩余质量最少，说明高温下热稳定性最差。对于RAM-HCM1，随着温度的上升，材料会随温度的不断升高发生分解，但从图中的分解温度可以得出本发明制备的材料已具备较好的热稳定性，能够满足正常使用的需求。

实施例9

实施例1制备的吸附剂对蛋白大分子的排阻能力测定实验。具体方法如下：

将实施例1制备的填料装入色谱柱，连接于高效液相色谱系统，再分别配制40 mg/mL的牛血清蛋白和溶菌酶溶液，进行在线高效液相色谱分析。色谱条件如下：流动相：a：水/乙腈（80/20，v/v）+ 0.050 M磷酸氢二钠；b和c：水/乙腈（60/40，v/v）+ 0.050 M磷酸氢二钠。流速：1.00 mL/min；紫外检测波长：280 nm；进样体积：10 μL。

测定结果如图4所示：可以观察到在不同的流动相组成下，牛血清蛋白（分子量66.430 kDa）和溶菌酶（分子量14.4 kDa）的保留时间相同，接近死时间，说明所合成的吸附剂具有蛋白大分子排阻的能力，可以用于复杂生物基质的分离萃取。

实施例10

实施例1合成吸附剂结构的反向特性测定实验。具体实施方法如下：

配制0.1 mg/mL苯萘蒽的混合溶液，将实施例1制备的填料装入色谱柱并连接于高效液相色谱系统。液相色谱条件：流动相：乙腈/水(75:25, v/v)；流速：0.5 mL min^?1；检测波长：254 nm；进样体积：10 μL。

测试结果如图4所示，由图4可知在所选洗脱条件下，苯?萘?蒽的出峰时间如图4所示，根据文献可知三者的洗脱顺序证实了本发明制备的材料具有内表面疏水、外表面亲水的反相色谱行为，证明了其具有明显的反相特性。

实施例11

测定实施例1合成材料的净化能力。具体实施方法如下： 

将实施例1制备的吸附剂填料连接于高效液相色谱系统测定。标样：OTC（土霉素）、TC（四环素）、CTC（金霉素）、DC（强力霉素）各0.2 mg kg^-1。

色谱条件：色谱柱，Venusil XBP C18柱 (250×4.6 mm, 5 m)；流动相，0.01 M草酸-乙腈-甲醇(70/25/5, V/V)；流速，1.0 mL min^-1；检测波长，350 nm；温度:25 ℃。

检测结果显示：图5（a）为空白牛奶色谱图；图5（b）为空白牛奶经固相萃取色谱图；图5（c）为加标牛奶色谱图；图5（d）为加标牛奶经固相萃取色谱图。通过固相萃取前后色谱图比较，可以看出本发明制备的吸附剂可有效排阻了样品中目标分子以外的其他杂质，显著提高了其检测的准确性和精确度。

实施例12

实施例1制备的吸附剂的刚性测定。具体步骤如下：

采用湿法装柱，用乙腈与水做匀浆剂填充，乙腈和水的比例为5:1。将填好的色谱柱直接与高效液相色谱连接，通过改变流动相的速度，得到对应的压力值，从而做出压力与流速的曲线。

检测结果如图6所示，柱压与流速呈很好的线性关系，线性相关系数为0.99473，说明填料具有很好的刚性，而且颗粒大小比较均匀，这说明本发明制备的吸附剂刚性强，持久耐用，且无需研磨就可填入萃取柱内使用。