维甲酸羟基磷灰石仿生复合物的制备方法及该仿生复合物

摘要

本发明涉及一种维甲酸羟基磷灰石仿生复合物的制备方法及该仿生复合物。本发明的目的是提供一种维甲酸羟基磷灰石仿生复合物的制备方法及利用该方法制得的维甲酸羟基磷灰石仿生复合物，临床应用中利用该仿生复合物成骨，不仅成本低、成骨效果好，而且能够有效避免异位成骨和术后肿胀等并发症。本发明的技术方案是：a、制备仿生层内核；b、在仿生层内核表面包覆一层功能层；c、在步骤b所得产物表面再包覆一层功能层。本发明主要适用于医疗器械技术领域。

说明书

技术领域

本发明涉及一种维甲酸羟基磷灰石仿生复合物的制备方法及利用该方法制 得的维甲酸羟基磷灰石仿生复合物，可制成广泛应用于整形外科、创伤骨科及 口腔种植的修复重建手术的羟基磷灰石仿生材料。属于医疗器械技术领域。

背景技术

骨缺损导致的骨不连和延迟愈合是困扰临床治疗的难题。尽管自体骨移植 是修复骨缺损的金标准，但是供区并发症是其难以克服的致命缺陷。理想的组 织工程骨应具备：(1)良好的生物相容性及生物降解吸收性；(2)合适的三维 微观结构；(3)易加工形成三维几何形态；(4)合适的表面理化性质；(5)一 定的机械强度能支持生理应力。由于全反式维甲酸(ATRA)为临床常用药剂， 价格低廉，因而临床上使用能显著降低临床治疗成本，减轻患者经济负担，现 在临床上使用的骨充填材料主要来自于国外，价格昂贵且成骨效果不理想，吸 收缓慢临床上不易愈合，延长临床作用时间。

此外，现在临床中使用的成骨材料需要加大使用剂量以弥补成骨过程中被 吸收的骨充填材料，这不仅增加了医疗成本，还会使得骨充填部位肿胀，致使 病人术后长期肿胀，术区形态不美观等缺点。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：针对上述存在的问题提供一种维甲酸羟基磷 灰石仿生复合物的制备方法及利用该方法制得的维甲酸羟基磷灰石仿生复合 物，临床应用中利用该仿生复合物成骨，不仅成本低、成骨效果好，而且能够 有效避免异位成骨和术后肿胀等并发症。

本发明所采用的技术方案是：维甲酸羟基磷灰石仿生复合物的制备方法， 其特征在于步骤如下：

a、取6.5-8克氯化氢、2-3克水合氯化钙、38-41克氯化钠、1-2克磷酸一氢 钠、39-40克pH值为7.4的三羟甲基氨基甲烷缓冲液，加入1L超纯水，调节pH 值至6.25，在磁力搅拌器上保持温度37度、并以50r/min的转速持续搅拌24小 时，生成沉淀后，用0.22微米的过滤器真空过滤，并对过滤后得到的固体物质 进行除菌；

b、用超纯水对步骤a所得物质进行清洗，真空环境中过滤压缩后将其放入 定形器中，形成一定的固定形状，真空干燥2小时后，用灭菌金属棒对其进行 研磨，然后过金属网状筛子得到直径小于0.22微米的仿生层内核颗粒；

c、取1-1.5克氯化氢、0.3-0.7克水合氯化钙、26-28克氯化钠、0.3-0.5克磷 酸一氢钠、38-40克pH值为7.4的三羟甲基氨基甲烷缓冲液，总量调节为20毫 升，并加入1-3微克灭菌的维甲酸，37度恒温水浴，完全溶解后将步骤b所得 仿生层内核放入其中，磁力搅拌器维持50转/分的转速持续搅拌24小时，超声 分散30-50分钟，通氮气，除去体系中的氧气，磁力搅拌反应结束后冷却至室温；

d、将步骤c所得混合液真空抽吸后，进行常压或真空干燥，得到表面包覆 有功能层的仿生层内核；

e、取1-1.5克氯化氢、0.3-0.7克水合氯化钙、26-28克氯化钠、0.3-0.5克磷 酸一氢钠、38-40克pH值为7.4的三羟甲基氨基甲烷缓冲液，总量调节为20毫 升，并加入1-3微克灭菌的维甲酸，37度恒温水浴，完全溶解后将包覆有功能 层的仿生层内核放入其中，磁力搅拌器维持50转/分的转速持续搅拌24小时， 超声分散30-50分钟，通氮气，除去体系中的氧气，磁力搅拌反应结束后冷却至 室温；

f、将步骤e所得混合液真空抽吸后，进行常压或真空干燥即可。

它还包括步骤g：依次重复步骤e、f若干次，得到功能层层数不同的仿生 复合物。

所述维甲酸羟基磷灰石仿生复合物的直径小于0.5mm。

维甲酸羟基磷灰石仿生复合物的制备方法，其特征在于步骤如下：

a、取7.3克氯化氢、2.58克水合氯化钙、39.78克氯化钠、1.42克磷酸一氢 钠、39.4克pH值为7.4的三羟甲基氨基甲烷缓冲液，加入1L超纯水，调节pH 值至6.25，在磁力搅拌器上保持温度37度、并以50r/min的转速持续搅拌24小 时，生成沉淀后，用0.22微米的过滤器真空过滤，并对过滤后得到的固体物质 进行除菌；

b、用超纯水对步骤a所得物质进行清洗，真空环境中过滤压缩后将其放入 定形器中，形成一定的固定形状，真空干燥2小时后，用灭菌金属棒对其进行 研磨，然后过金属网状筛子得到直径小于0.22微米的仿生层内核颗粒；

c、取1.26克氯化氢、0.516克水合氯化钙、27.2克氯化钠、0.4克磷酸一氢 钠、39.4克pH值为7.4的三羟甲基氨基甲烷缓冲液，总量调节为20毫升，并 加入1-3微克灭菌的维甲酸，37度恒温水浴，完全溶解后将步骤b所得仿生层 内核放入其中，磁力搅拌器维持50转/分的转速持续搅拌24小时，超声分散40 分钟，通氮气，除去体系中的氧气，磁力搅拌反应结束后冷却至室温；

d、将步骤c所得混合液真空抽吸后，真空干燥18-48小时，得到表面包覆 有功能层的仿生层内核；

e、取1.26克氯化氢、0.516克水合氯化钙、27.2克氯化钠、0.4克磷酸一氢 钠、39.4克pH值为7.4的三羟甲基氨基甲烷缓冲液，总量调节为20毫升，并 加入1-3微克灭菌的维甲酸，37度恒温水浴，完全溶解后将包覆有功能层的仿 生层内核放入其中，磁力搅拌器维持50转/分的转速持续搅拌24小时，超声分 散40分钟，通氮气，除去体系中的氧气，磁力搅拌反应结束后冷却至室温；

f、将步骤e所得混合液真空抽吸后，真空干燥18-48小时即可。

它还包括步骤g：依次重复步骤e、f若干次，得到功能层层数不同的仿生 复合物。

所述步骤d和步骤f中干燥在冷冻真空条件下进行，干燥时间为24-28小时。

所述维甲酸羟基磷灰石仿生复合物的直径小于0.5mm。

采用所述制备方法得到的维甲酸羟基磷灰石仿生复合物，其特征在于：它 包括作为支架材料的仿生层内核，以及包裹于该仿生层内核外、在成骨时被吸 收同时释放维甲酸的功能层，所述功能层呈海绵状。

所述功能层的层数为两层或两层以上。

所述维甲酸羟基磷灰石仿生复合物的直径小于0.5mm。

本发明的有益效果是：本发明在形成羟基磷灰石的过程中将ATRA镶嵌于 其中，形成类网格状的结构，在破骨细胞作用于羟基磷灰石的过程中缓慢释放 ATRA，达到最大的成骨效果。近来研究发现，临床上使用的骨粉会造成异位成 骨(正常部位骨赘等形成)，骨形成过量和新生骨结构紊乱，这是很多临床医生 的困扰，ATRA羟基磷灰石仿生复合物可以很好的解决这个问题，不仅可以持续 成骨而且可以防止异位成骨，使成骨材料在相应的部位维持低剂量缓慢释放 ATRA，局部缓慢释放模式可获得其最佳的诱导成骨效果，最终达到最大的成骨 效果。

本发明得到的维甲酸羟基磷灰石仿生复合物由仿生层内核，以及包裹于该 仿生层内核外的功能层组成，成骨时，功能层中的磷酸钙在降解的同时释放出 全反式维甲酸，作用于生物体内促进成骨细胞的成骨作用，成骨细胞利用磷酸 钙降解的钙质作为原料建立新骨，新骨形成后包围了仿生层内核充填于骨缺损 处，仿生层内核将作为支架材料存在于骨缺损处，从而完成整个骨缺损的修复， 很好的避免了临床术后肿胀等并发症，且成骨效果明显优于临床骨充填材料。

具体实施方式

实施例1：本实施例制备步骤如下：

a、取7.3克氯化氢(HCL)、2.58克水合氯化钙(CaCL₂H₂O)、39.78克氯 化钠(NaCL)、1.42克磷酸一氢钠(Na₂HPO₄)、39.4克pH值为7.4的三羟甲基 氨基甲烷缓冲液，加入1L超纯水，调节pH值至6.25，在磁力搅拌器上保持温 度37度、并以50r/min的转速持续搅拌24小时，生成沉淀后，用0.22微米的过 滤器真空过滤，并对过滤后得到的固体物质进行高温高压除菌；

b、用超纯水对步骤a所得物质进行清洗，真空环境中过滤压缩后将其放入 定形器中，形成一定的固定形状(圆柱形或者是条状)，便于干燥；真空干燥2 小时后，用灭菌金属棒对其进行研磨，然后用金属网状筛子除去大块固体，得 到直径小于0.22微米的仿生层内核颗粒；

c、取1.26克氯化氢(HCL)、0.516克水合氯化钙(CaCL₂H₂O)、27.2克氯 化钠(NaCL)、0.4克磷酸一氢钠(Na₂HPO₄)、39.4克pH值为7.4的三羟甲基 氨基甲烷缓冲液，总量调节为20毫升，并加入2微克灭菌的维甲酸，37度恒温 水浴，完全溶解后将步骤b所得仿生层内核放入其中，磁力搅拌器维持50转/ 分的转速持续搅拌24小时，超声分散40分钟，通氮气，除去体系中的氧气， 磁力搅拌反应结束后冷却至室温；

d、将步骤c所得混合液真空抽吸后，真空干燥18-48小时，得到表面包覆 有功能层的仿生层内核；

e、取1.26克氯化氢(HCL)、0.516克水合氯化钙(CaCL₂H₂O)、27.2克氯 化钠(NaCL)、0.4克磷酸一氢钠(Na₂HPO₄)、39.4克pH值为7.4的三羟甲基 氨基甲烷缓冲液，总量调节为20毫升，并加入2微克灭菌的维甲酸，37度恒温 水浴，完全溶解后将包覆有功能层的仿生层内核放入其中，磁力搅拌器维持50 转/分的转速持续搅拌24小时，超声分散40分钟，通氮气，除去体系中的氧气， 磁力搅拌反应结束后冷却至室温；

f、将步骤e所得混合液真空抽吸后，真空干燥18-48小时即可。

实施例2：本实施例制备步骤如下：

a、取7.3克氯化氢(HCL)、2.58克水合氯化钙(CaCL₂H₂O)、39.78克氯 化钠(NaCL)、1.42克磷酸一氢钠(Na₂HPO₄)、39.4克pH值为7.4的三羟甲基 氨基甲烷缓冲液，加入1L超纯水，调节pH值至6.25，在磁力搅拌器上保持温 度37度、并以50r/min的转速持续搅拌24小时，生成沉淀后，用0.22微米的过 滤器真空过滤，并对过滤后得到的固体物质进行高温高压除菌；

b、用超纯水对步骤a所得物质进行清洗，真空环境中过滤压缩后将其放入 定形器中，形成一定的固定形状(圆柱形或者是条状)，便于干燥；真空干燥2 小时后，用灭菌金属棒对其进行研磨，然后用金属网状筛子除去大块固体，得 到直径小于0.22微米的仿生层内核颗粒；

c、取1.26克氯化氢(HCL)、0.516克水合氯化钙(CaCL₂H₂O)、27.2克氯 化钠(NaCL)、0.4克磷酸一氢钠(Na₂HPO₄)、39.4克pH值为7.4的三羟甲基 氨基甲烷缓冲液，总量调节为20毫升，并加入2微克灭菌的维甲酸，37度恒温 水浴，完全溶解后将步骤b所得仿生层内核放入其中，磁力搅拌器维持50转/ 分的转速持续搅拌24小时，超声分散40分钟，通氮气，除去体系中的氧气， 磁力搅拌反应结束后冷却至室温；

d、将步骤c所得混合液真空抽吸后，冷冻真空干燥24-28小时，得到表面 包覆有功能层的仿生层内核；

e、取1.26克氯化氢(HCL)、0.516克水合氯化钙(CaCL₂H₂O)、27.2克氯 化钠(NaCL)、0.4克磷酸一氢钠(Na₂HPO₄)、39.4克pH值为7.4的三羟甲基 氨基甲烷缓冲液，总量调节为20毫升，并加入2微克灭菌的维甲酸，37度恒温 水浴，完全溶解后将包覆有功能层的仿生层内核放入其中，磁力搅拌器维持50 转/分的转速持续搅拌24小时，超声分散40分钟，通氮气，除去体系中的氧气， 磁力搅拌反应结束后冷却至室温；

f、将步骤e所得混合液真空抽吸后，冷冻真空干燥24-28小时即可。

实施例3：本实施例制备步骤如下：

a、取6.5克氯化氢(HCL)、2克水合氯化钙(CaCL₂H₂O)、38克氯化钠 (NaCL)、1克磷酸一氢钠(Na₂HPO₄)、39克pH值为7.4的三羟甲基氨基甲烷 缓冲液，加入1L超纯水，调节pH值至6.25，在磁力搅拌器上保持温度37度、 并以50r/min的转速持续搅拌24小时，生成沉淀后，用0.22微米的过滤器真空 过滤，并对过滤后得到的固体物质进行高温高压除菌；

b、用超纯水对步骤a所得物质进行清洗，真空环境中过滤压缩后将其放入 定形器中，形成一定的固定形状(圆柱形或者是条状)，便于干燥；真空干燥2 小时后，用灭菌金属棒对其进行研磨，然后用金属网状筛子除去大块固体，得 到直径小于0.22微米的仿生层内核颗粒；

c、取1克氯化氢(HCL)、0.3克水合氯化钙(CaCL₂H₂O)、26克氯化钠 (NaCL)、0.3克磷酸一氢钠(Na₂HPO₄)、38克pH值为7.4的三羟甲基氨基甲 烷缓冲液，总量调节为20毫升，并加入1微克灭菌的维甲酸，37度恒温水浴， 完全溶解后将步骤b所得仿生层内核放入其中，磁力搅拌器维持50转/分的转速 持续搅拌24小时，超声分散30分钟，通氮气，除去体系中的氧气，磁力搅拌 反应结束后冷却至室温；

d、将步骤c所得混合液真空抽吸后，进行常压或真空干燥，得到表面包覆 有功能层的仿生层内核；

e、取1克氯化氢(HCL)、0.3克水合氯化钙(CaCL₂H₂O)、26克氯化钠 (NaCL)、0.3克磷酸一氢钠(Na₂HPO₄)、38克pH值为7.4的三羟甲基氨基甲 烷缓冲液，总量调节为20毫升，并加入1微克灭菌的维甲酸，37度恒温水浴， 完全溶解后将包覆有功能层的仿生层内核放入其中，磁力搅拌器维持50转/分的 转速持续搅拌24小时，超声分散30分钟，通氮气，除去体系中的氧气，磁力 搅拌反应结束后冷却至室温；

f、将步骤e所得混合液真空抽吸后，进行常压或真空干燥即可。

实施例4：本实施例制备步骤如下：

a、取8克氯化氢(HCL)、3克水合氯化钙(CaCL₂H₂O)、41克氯化钠(NaCL)、 2克磷酸一氢钠(Na₂HPO₄)、40克pH值为7.4的三羟甲基氨基甲烷缓冲液，加 入1L超纯水，调节pH值至6.25，在磁力搅拌器上保持温度37度、并以50r/min 的转速持续搅拌24小时，生成沉淀后，用0.22微米的过滤器真空过滤，并对过 滤后得到的固体物质进行高温高压除菌；

b、用超纯水对步骤a所得物质进行清洗，真空环境中过滤压缩后将其放入 定形器中，形成一定的固定形状(圆柱形或者是条状)，便于干燥；真空干燥2 小时后，用灭菌金属棒对其进行研磨，然后用金属网状筛子除去大块固体，得 到直径小于0.22微米的仿生层内核颗粒；

c、取1.5克氯化氢(HCL)、0.7克水合氯化钙(CaCL₂H₂O)、28克氯化钠 (NaCL)、0.5克磷酸一氢钠(Na₂HPO₄)、40克pH值为7.4的三羟甲基氨基甲 烷缓冲液，总量调节为20毫升，并加入3微克灭菌的维甲酸，37度恒温水浴， 完全溶解后将步骤b所得仿生层内核放入其中，磁力搅拌器维持50转/分的转速 持续搅拌24小时，超声分散50分钟，通氮气，除去体系中的氧气，磁力搅拌 反应结束后冷却至室温；

d、将步骤c所得混合液真空抽吸后，进行常压干燥，得到表面包覆有功能 层的仿生层内核；

e、取1.5克氯化氢(HCL)、0.7克水合氯化钙(CaCL₂H₂O)、28克氯化钠 (NaCL)、0.5克磷酸一氢钠(Na₂HPO₄)、40克pH值为7.4的三羟甲基氨基甲 烷缓冲液，总量调节为20毫升，并加入3微克灭菌的维甲酸，37度恒温水浴， 完全溶解后将包覆有功能层的仿生层内核放入其中，磁力搅拌器维持50转/分的 转速持续搅拌24小时，超声分散50分钟，通氮气，除去体系中的氧气，磁力 搅拌反应结束后冷却至室温；

f、将步骤e所得混合液真空抽吸后，进行常压干燥即可。

上述各实施例，可根据需要依次重复步骤e、f若干次(3-4次)，以得到功 能层层数不同的仿生复合物，一般直径优选小于0.5mm。

利用上述各实施例制得的维甲酸羟基磷灰石仿生复合物大小均匀，它包括 作为支架材料的仿生层内核，以及包裹于该仿生层内核外、呈海绵状的功能层， 其中功能层的层数为两层或两层以上。人体成骨过程是成骨细胞和破骨细胞共 同作用的过程，首先是破骨细胞将功能层材料吸收，然后成骨细胞利用材料降 解的钙质形成新骨，新骨形成后包围了仿生层内核充填于骨缺损处，仿生层内 核将作为支架材料存在于骨缺损处，最终在仿生层内核和功能层的作用下完成 整个骨缺损的修复。本材料中外层的海绵状功能层在被吸收的同时释放出全反 式维甲酸作用于成骨细胞，有利于成骨细胞形成新骨。

临床试验中，将本发明得到的维甲酸羟基磷灰石仿生复合物用于成骨-破骨 细胞共培养体系中发现，成骨效果较以往单一羟基磷灰石材料明显；用于动物 大面积骨缺损模型中发现，四周成骨量明显优于临床使用的成骨材料，八周后 成骨效果更为显著，且硬组织切片发现新生骨的骨小梁距离较近，其结构更接 近于骨缺损周围的正常骨结构。