一种含有MALAT1启动子序列和报告基因的载体及其构建方法和用途

摘要

本发明涉及一种含有MALAT1启动子序列和报告基因的载体及其构建方法和用途。具体地，将MALAT1的启动子序列（1100bp）插入pGL3-Basic载体，构建获得含MALAT1启动子和报告基因luc+的重组质粒pGL3-Basic-MALAT1-promoter。该重组质粒与海肾萤光素酶报告基因载体pRL-SV40共转染肿瘤细胞，添加候选抗肿瘤药物作用细胞，然后通过检测双荧光素酶活性可以反映各药物对MALAT1基因启动子转录活性的影响，从而应用于靶向MALAT1基因的抗肿瘤药物筛选。该方法特别适合大规模针对MALAT1基因的抗肿瘤药物的筛选，方法简单，直观和快速，靶向性强，无放射性。

说明书

【技术领域】

本发明涉及分子生物学技术领域，具体地说，是一种含有MALAT1启动子序列和报告基因的载体及其构建方法和用途。

【背景技术】

肿瘤的发生是一个涉及多种癌基因如原癌基因及抑癌基因的多阶段过程，是多基因协同作用的结果。当癌基因与抑癌基因之间的平衡被打破，控制细胞增殖的癌基因持续或过高表达，同时抑癌基因不表达或失活时，便会使癌变细胞逃避机体免疫机制的控制，形成肿瘤，进而导致细胞的恶化及转移。

长链非编码RNA（long noncoding RNA，lncRNA）是一类转录本长度超过200nt的RNA，它们本身并不编码蛋白，而是以RNA的形式在多种层面上调控基因的表达水平。随着近年来lncRNA不断的被发现，人们越来越多的关注lncRNA在各种生物学过程以及疾病中的功能。

LncRNA-MALAT1（Metastasis Associated in Lung Adenocarcinoma Transcript 1）于2003年被首次发现，其在非小细胞癌患者组织中显著高表达，随后该基因在其它很多肿瘤如肝癌、胰腺癌、前列腺癌、肠癌、乳癌等癌组织中也发现过表达。

目前国内外刚刚开始致力于长链非编码RNA的研究，其在肿瘤领域的研究相比于microRNA还处于初步阶段。MALAT1基因跟多种肿瘤的侵袭转移密切相关，而针对该基因进行的抗肿瘤药物的筛选也没有建立标准而有效的方法，极大的限制了针对MALAT1基因进行药物治疗的研究。

【发明内容】

本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种含有MALAT1启动子序列和报告基因的载体。

本发明的再一的目的是，提供上述载体的构建方法。

本发明的另一的目的是，提供上述载体的用途。

本发明的第四个目的是，提供一种细胞株。

本发明的第五个目的是，提供一种筛选针对MALAT1基因的抗肿瘤药物或比较针对MALAT1基因的抗肿瘤药物的活性大小的方法。

为实现上述第一个目的，本发明采取的技术方案是：

一种含有MALAT1启动子序列和报告基因的载体，所述的载体是在pGL3-Basic载体的多克隆位点内插入SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

优选地，所述的SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列插入在pGL3-Basic载体的NheI和BglⅡ酶切位点之间。

为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：

如上所述的含有MALAT1启动子序列和报告基因的载体的构建方法，包括以下步骤：

a）获得SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；

b）将SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列连接到pGL3-Basic载体的NheI和BglⅡ酶切位点之间。

为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是：

如上所述的含有MALAT1启动子序列和报告基因的载体的用途，用于筛选针对MALAT1基因的抗肿瘤药物，或比较针对MALAT1基因的抗肿瘤药物的活性大小。

为实现上述第四个目的，本发明采取的技术方案是：

一种细胞株，它含有如上任一所述的载体以及pRL-SV40内参质粒。

作为本发明的一种实施方式，所述的细胞株是人肿瘤细胞株。

为实现上述第五个目的，本发明采取的技术方案是：

一种筛选针对MALAT1基因的抗肿瘤药物或比较针对MALAT1基因的抗肿瘤药物的活性大小的方法，所述的方法是将待选化合物作用如上任一所述的细胞株，然后检测双荧光素酶活性。

本发明优点在于：

本发明首先提取人结肠癌细胞的全基因组，然后RT-PCR获得合适长度的MALAT1的启动子序列（片段的长短对最终载体功能的实现有很大影响，太长的片段不太容易PCR扩增，且很可能会影响载体中荧光素酶的活性；片段太短则可能失去MALAT1启动子的活性），经过测序验证正确后，将其插入pGL3-Basic载体，构建获得含MALAT1启动子和报告基因luc⁺的重组质粒pGL3-Basic-MALAT1-promoter。该重组质粒与海肾萤光素酶报告基因载体pRL-SV40共转染肿瘤细胞，添加候选抗肿瘤药物作用细胞，然后通过检测双荧光素酶活性可以反映各药物对MALAT1基因启动子转录活性的影响，从而应用于靶向MALAT1基因的抗肿瘤药物筛选。该方法特别适合大规模针对MALAT1基因的抗肿瘤药物的筛选，方法简单，直观和快速，靶向性强，无放射性。

【附图说明】

图1是 MALAT1基因启动子的PCR扩增产物。其中1为Marker（DL2000）， 2为MALAT1启动子PCR扩增产物，大小为1100bp。

图2是PCR产物的测序比对结果。

图3是pGL3-Basic-MALAT1-promoter重组质粒的PCR鉴定图谱。其中1为Marker，2、3、4为任意挑取的3个克隆，经PCR鉴定均正确（1100bp）。

图4是pGL3-Basic-MALAT1-promoter重组质粒的NheI和BglⅡ双酶切鉴定结果。其中1为Marker, 2和3为图3中经PCR鉴定正确的克隆2和3抽质粒的双酶切鉴定结果（4818bp+1100bp）。

图5是pGL3-Basic-MALAT1-promoter重组质粒的构建流程图。

图6是 pGL3-Basic-MALAT1-promoter重组质粒和pRL-SV40内参质粒共转染LoVo细胞后的荧光活性检测结果。其中Blank组：pRL-SV40内参质粒；Basic组：pGL3-Basic+ pRL-SV40；MALAT1组：pGL3-Basic-MALAT1-promoter+ pRL-SV40；SV40组：pGL3-Basic-SV40-promoter+ pRL-SV40。

图7是22种候选抗肿瘤药物对pGL3-Basic-MALAT1-promoter重组质粒中MALAT1启动子转录活性的影响，以候选药物对MALAT1启动子活性的抑制率作为纵坐标作图。

【具体实施方式】

下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。

本发明的技术路线为：

重组载体构建的技术路线如下：（1）从结肠癌LoVo细胞中提取基因组DNA；（2）采用RT-PCR的方法以基因组为模板扩增出MALAT1基因的启动子片段；（3）将测序正确的RT-PCR扩增产物和pGL3-Basic载体分别经过限制性内切酶NheI和BglⅡ消化；（4）经过限制性内切酶NheI和BglⅡ消化的RT-PCR扩增产物和pGL3-Basic载体进行连接，转化，筛选，PCR鉴定和双酶切鉴定获得重组载体。

以MALAT1基因启动子为靶点的抗肿瘤药物的筛选：（1）将含萤火虫萤光素酶的pGL3-Basic-MALAT1-promoter重组质粒和含海肾萤光素酶的pRL-SV40内参质粒共转染人肿瘤细胞株，获得表达MALAT1启动子的转染细胞株；（2）建立合适的双荧光素检测系统；（3）将待选化合物作用上述细胞株，进行以MALAT1启动子为靶点的抗肿瘤药物筛选。其原理是：将待筛选化合物作用转染细胞，24-48h 后检测Luc的活性，如果待筛选化合物能够使细胞内的Luc活性降低，就说明此化合物可以直接抑制MALAT1基因启动子的转录活性，从而抑制MALAT1基因的表达，降低肿瘤细胞的侵袭转移性能，因此是一种潜在的抗肿瘤药物。

本发明所涉及的肿瘤细胞如LoVo，含萤火虫萤光素酶报告基因的pGL3-Basic质粒载体，以及实验中所用试剂及药物均可市购。

实施例1  构建含人MALAT1启动子序列和Luc报告基因序列的重组质粒

（1）从结肠癌LoVo细胞中提取基因组DNA，采用RT-PCR的方法以基因组为模板扩增出MALAT1基因的启动子片段（1100bP，SEQ ID NO.1），无非特异性扩增，条带清晰，大小与目的片段相符（图1）。PCR产物直接测序，测序结果提示该片段为MALAT1基因启动子区域片段，未发现碱基突变，测序比对结果见图2。

（2）将测序正确的RT-PCR扩增产物和pGL3-Basic载体（购于美国Promega公司，其特征是含萤火虫萤光素酶报告基因luc⁺、多克隆位点、氨苄青霉素抗性基因β-内酰胺酶，载体大小为4818 bp）分别经过限制性内切酶NheI和BglⅡ消化，连接转化到感受态大肠杆菌DH5α中，经过氨苄青霉素筛选，PCR鉴定和双酶切获得重组载体pGL3-Basic-MALAT1-promoter（图3，图4）。图5是重组质粒构建的流程图。结果提示，MALAT1启动子荧光素酶报告载体构建成功。

实施例2  利用重组质粒pGL3-Basic-MALAT1-promoter进行以MALAT1基因启动子为靶点的抗肿瘤药物的筛选

（1）转染人肿瘤细胞株，获得稳定表达MALAT1启动子和Luc报告基因的转染细胞株

按照 5×10⁵ 个细胞/孔的量在 6 孔板中接种指数生长期的LoVo 细胞，在 37℃、5％CO₂ 培养箱中过夜培养，直到细胞 80％汇合后，在超净台内进行pGL3-Basic-MALAT1-promoter质粒的细胞转染。具体是：①在 EP 管中配置 DNA/脂质体复合物，如下：稀释质粒 DNA 至 1 mL F12K无血清无抗生素培养液中，在涡旋混合器上振荡 1 min，然后加入脂质体悬液，再次旋起混匀，在室温温育 20 min，使 DNA 与脂质体充分结合；②去除细胞培养板中的培养液，用 PBS 洗一次，在每个孔中加入 DNA/脂质体混合物 1 mL，于 37℃ 5％ CO₂ 培养箱中培养 5 h，然后向孔中加入 F12K 完全培养液，在 37℃ 5％ CO₂ 培养箱中培养48 h。

（2）建立合适的双荧光素检测系统

利用 Luciferase 试剂盒（Promega）及萤火虫荧光素酶测定仪（Beahold）测定每组萤火虫荧光素酶活性，各组设3个复孔。萤火虫荧光素酶活性检测用工作液 1：A 液（2 mL）+B 液（40 μL）＋C 液（10 μL）；海肾荧光素酶活性检测用工作液 2：D 液（2 mL）+E 液（10 μL）进行。共转染报告质粒 pGL3-Basic-MALAT1-promoter（阴性对照组加空质粒pGL3-Basic，阳性对照组加质粒pGL3-Basic-SV40-promoter(购于美国Promega公司)）和内参质粒pRL-SV40（购于美国Promega公司）的细胞（前后比例9：1，以96孔为例，总DNA量0.2 μg），经过一定时间的培养后收集。细胞的裂解：取出培养基，用 PBS 洗一次，每孔加入裂解液 500 μL，室温摇动 15 min。取 20 μL 细胞裂解液于 1.5 mL 的离心管中。加入工作液 1，设定延迟 2 sec，发光仪测读 10 sec。加入工作液 2，设定延迟 2 sec，发光仪测读10 sec，进行检测。不同组质粒转染后的荧光检测结果见图6，表明构建pGL3-Basic-MALAT1-promoter质粒成功。

（3）将待选化合物作用上述细胞株，进行以MALAT1启动子为靶点的抗肿瘤药物的筛选

共转染报告质粒 pGL3-Basic-MALAT1-promoter和内参质粒pRL-SV40（比例9：1）于人结肠癌LoVo细胞，然后将待选化合物作用上述细胞，48h后收集细胞，用双荧光素酶活性检测判断各候选抗肿瘤药物对MALAT1启动子活性的影响。我们将候选的22种抗肿瘤药物单体分别加入上述转染细胞，然后检测荧光素酶活性，结果表明A样品（白黎芦醇）和B样品（蛇床子素）相对于其它候选抗肿瘤药物（图7），对MALAT1启动子的转录活性有着非常明显的抑制作用，其可以成为潜在抗肿瘤药物进行深入的功能实验。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110>  上海中医药大学附属曙光医院

       上海中医药大学附属市中医医院

<120>  一种含有MALAT1启动子序列和报告基因的载体及其构建方法和用途

<130>  /

<160>  1    

<170>  PatentIn version 3.3

<210>  1

<211>  1100

<212>  DNA

<213>  human

<400>  1

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