一种BP180 NC16A IgE抗体的间接免疫荧光检测试剂盒及检测方法

摘要

本发明公开了一种皮肤基底膜抗BP180 NC16A IgE抗体的间接免疫荧光检测试剂盒及检测方法，属于IgE检测试剂技术领域。该试剂盒包括检测底物。该检测方法应用了该试剂盒。试剂盒及检测方法的有益效果在于，灵敏度高且具有特异性。

说明书

技术领域

本发明涉及IgE检测试剂技术领域，特别涉及一种皮肤基底膜带抗 BP180NC16A IgE抗体的间接免疫荧光检测试剂盒及检测方法。

背景技术

现有技术中对没有皮肤基底膜抗BP180NC16A IgE抗体的间接检测试剂盒 及应用该试剂盒对皮肤基底膜带抗BP180NC16A IgE抗体进行检测的方法。而 应用现有技术对该抗体进行检测的方法通常过程复杂，耗时很多。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提出了一种灵敏度高且具有特异性的皮肤基底 膜带抗BP180NC16A IgE抗体的间接免疫荧光检测试剂盒及检测方法。

本发明提供的皮肤基底膜抗BP180NC16A IgE抗体的间接免疫荧光检测试 剂盒，包括检测底物，所述检测底物的制备方法包括以下步骤：

将人皮肤或猴食管上皮切成1×0.5cm长方形，长轴垂直固定于冷冻切片冷 冻头上；

调整冷冻切片机冷冻箱及冷冻台温度至-20℃，切片厚度8μm后开始切片， 皮肤切片附着于防脱玻璃载玻片上，每片粘附两块皮肤组织，距离尽可能远；

切好的载玻片迅速浸于丙酮中固定5min，取出晾干后放入标本盒，存入-80℃ 超低温冰箱，得到所述检测底物。

本发明提供的一种皮肤基底膜带抗BP180NC16AIgE抗体的间接免疫荧光 检测方法包括以下步骤：

采用复孔检测，向本发明提供的的试剂盒的检测底物中加入倍比稀释的待 测样本及一份阴性对照血清，所述阴性对照为经蛋白印迹法检测不含 BP180NC16A IgE抗体的血清，在37℃恒温条件下一抗孵育，1h后用PBST第 Ⅰ次洗涤；

用PBS将FITC标记的鼠抗人IgE抗体原液稀释500倍，得到二抗稀释液；

向经过第Ⅰ次洗涤的检测底物中加入所述二抗稀释液，在37℃恒温条件下 二抗孵育，1h后用PBST第Ⅱ次洗涤；

向经过第Ⅱ次洗板的检测底物中加入甘油，终止反应；

显色终止后以倒置荧光显微镜观察皮肤基底膜带处是否有线状荧光沉积， 无基底膜线状沉积者为阴性，有基底膜线状沉积者为阳性。

作为优选，所述待测样本为经过PBS倍比稀释的血清或者水疱液。

本发提供的皮肤基底膜带IgE抗体的间接免疫荧光检测试剂盒及检测方法 的有益效果在于，灵敏度高且具有特异性。

具体实施方式

为了深入了解本发明，下面结合附图及具体实施例对本发明进行详细说明。

本发明提供的皮肤基底膜带IgE抗体的间接免疫荧光检测试剂盒包括检测 试剂，检测试剂的制备方法包括以下步骤：

步骤11：经患者知情同意并签署知情同意书后，取手术切除人包皮皮肤或 乳房皮肤，分离皮肤与皮下组织。皮肤或猴食管上皮可冻存于-80℃超低温冰箱。

步骤12：将人皮肤或猴食管上皮切成1×0.5cm长方形，长轴垂直固定于冷 冻切片冷冻头上。

步骤13：调整冷冻切片机冷冻箱及冷冻台温度至-20℃，切片厚度8μm后 开始切片，皮肤切片应附着于防脱玻璃载玻片上，每片可粘附两块皮肤组织， 距离尽可能远。

步骤14：切好的载玻片迅速浸于丙酮中固定5min，取出晾干后放入标本盒， 存入-80℃超低温冰箱。由此可得检测底物。

本发明提供的BP180NC16A IgE抗体的酶联免疫检测方法包括以下步骤：

步骤21：采用复孔检测，向本发明提供的试剂盒的皮肤底物中加入待测样 本及一份阴性对照血清，其中，阴性对照为经蛋白印迹法检测不含BP180NC16A IgE抗体的健康人血清，在37℃恒温条件下一抗孵育，1h后用PBST第Ⅰ次洗 涤；

其中，待测样本为经过PBS倍比稀释的血清或者水疱液。

步骤21’：用PBS将FITC标记的IgE抗体原液稀释500倍，得到二抗稀释 液；

步骤22：向经过第Ⅰ次洗涤的试剂盒的载玻片皮肤底物中加入所述二抗稀 释液，在37℃恒温条件下二抗孵育，1h后用PBST第Ⅱ次洗涤；

步骤23：向经过第Ⅱ次洗板的试剂盒的皮肤底物中加入甘油，终止反应；

步骤24：显色终止后以倒置荧光显微镜观察皮肤基底膜带处是否有线状荧 光沉积，无基底膜线状沉积者为阴性，有线状沉积者记录其最后出现线状沉积 的血清或疱液稀释倍数。

实施例

（一）材料

标本：

血清样本（或水疱样本）

待测样本:来源于待检测的BP患者或疑诊BP患者

阴性对照血清：经蛋白印迹法检测确定的不含有抗皮肤基底膜带IgE抗体 的患者的血清

人包皮或乳房皮肤，或猴食管上皮

主要试剂：

冷冻包埋剂      PBS

FITC-IgE抗体    PBST终止液（甘油）

所需耗材：

所需器材：

本发明提供的BP180NC16A IgE抗体的酶联免疫检测试剂盒所使用的检测 底物的制备方法具体步骤如下：

1.人皮肤的获得：人皮肤或猴食管上皮的获得：

经患者知情同意并签署知情同意书后，取手术切除人包皮皮肤或乳房皮 肤，分离皮肤与皮下组织，弃皮下组织。或饲养猴至成熟后取其食管上皮。 皮肤或猴食管上皮可冻存于-80℃超低温冰箱。

2.底物的制备：

将人皮肤或猴食管上皮切成1×0.5cm长方形，长轴垂直固定于冷冻切片 冷冻头上。

调整冷冻切片机冷冻箱及冷冻台温度至-20℃，切片厚度8μm后开始切片， 皮肤切片应附着于防脱玻璃载玻片上，每片可粘附两块皮肤组织，距离尽 可能远。

切好的载玻片迅速浸于丙酮中固定5min，取出晾干后放入标本盒，存入 -80℃超低温冰箱。由此可得检测底物。

经过上述步骤，即得本发明提供的皮肤基底膜带IgE抗体的间接免疫荧光 试剂盒所用的检测底物。

本发明提供的皮肤基底膜带IgE抗体的酶联免疫检测方法的具体方法步骤 如下：

1）血清稀释：

①血清样本（或水疱样本）及阴性对照按顺序标号，96孔板每纵列或每 横行按相同顺序标号

②96孔板每列或每行第一孔中加入180μL PBS，剩余孔中各加入100μL PBS。

③取20μL血清或疱液标本加入标号对应的行或列的第一孔内（含 180μL PBS），移液器吹打混匀，得1:10稀释血清或疱液标本。

④在第一孔内吸取100μL混匀的1:10稀释标本，加入该行或列的第二 孔内，吹打混匀，得1:20稀释的血清或疱液标本。

⑤重复步骤④中的动作，可得1:40稀释的标本。以此类推，即可得倍比 稀释的血清或疱液标本。通过该方法，推荐最多稀释10个滴度，即稀 释至1:5120。

2）一抗孵育：

①含有皮肤底物的载玻片按顺序标号。

②按顺序将每个标本的每个稀释度吸取20μL～30μL滴加于皮肤底物上， 滴加过少易在一抗孵育过程中蒸发变干，过多则易流至相邻底物引起污 染。此处推荐做复孔。

③湿盒中提前加入适量蒸馏水，水平面不能没过玻片架。

④将加好标本的玻片小心移入湿盒，放入恒温箱中，37℃孵育1h。

⑤孵育完毕后PBST轻轻冲洗玻片，避免将底物冲下，后放入加满PBST 的玻璃染色缸中，水平摇床洗涤10min。

⑥洗涤完毕后用手轻轻甩干玻片上水分，吸水卫生纸擦干玻片反面及皮 肤底物周边剩余水分。

3）二抗孵育：

①二抗稀释：在一抗（即血清或疱液）在孵育时即可准备好二抗（FITC 标记的鼠抗人IgE抗体）；每毫升PBS中加入抗体原液2μL，即二抗1： 500稀释。根据标本量的多少确定稀释二抗的量。稀释完毕后置于室温 避光处保存。

②每个皮肤底物中加入20μL～30μL二抗，迅速转移入湿盒，37℃避光孵 育1h。

③孵育完毕后PBST轻轻冲洗玻片，避免将底物冲下，后放入加满PBST 的玻璃染色缸中，水平摇床洗涤10min。

④洗涤完毕后用手轻轻甩干玻片上水分，吸水卫生纸擦干玻片反面及皮 肤底物周边剩余水分。

4）终止反应：

用毛细滴管吸取甘油后滴于皮肤底物上，其上覆盖盖玻片。尽快镜下 观察，避免荧光淬灭。

5）镜下观察：

在倒置荧光显微镜下观察皮肤底物中是否出现基底膜带的线状沉积，如无 沉积，则为阴性，如有沉积，则记录血清稀释的最大稀释滴度。不能明确判断 时，则可与相同滴度的阴性对照进行比较而判断。并可使用显微镜配套的相机 进行荧光照片拍摄。

以已经确诊的大疱性类天疱疮（BP）、妊娠类天疱疮、线状IgA大疱性皮病 等BP180大疱性疾病患者为样本，应用本发明提供的皮肤基底膜抗BP180NC16A IgE抗体的间接免疫荧光检测试剂盒及检测方法进行检测，阳性检出率达到 31.32%，由于该抗体在患者中含量较少，因此目前的灵敏度已为较高灵敏度。

以已经确诊的大疱性类天疱疮（BP）、妊娠类天疱疮、线状IgA大疱性皮病 等BP180大疱性疾病患者、健康人和其他皮肤疾病的患者为样本，应用本发明 提供的皮肤基底膜抗BP180NC16A IgE抗体的间接免疫荧光检测试剂盒及检测 方法进行检测，其中，检测结果呈阳性的，全部是已经确诊的大疱性类天疱疮 （BP）、妊娠类天疱疮、线状IgA大疱性皮病等BP180大疱性疾病患者，因此， 应用特异度为100%。

本发提供的皮肤基底膜带IgE抗体的间接免疫荧光检测试剂盒及检测方法 的有益效果在于，灵敏度高且具有特异性。

以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了 进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已， 并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同 替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。