紫玉兰素A在稳定四链体DNA中的应用

摘要

本发明公开了紫玉兰素A在稳定四链体DNA中的应用。该应用是式Ⅰ的紫玉兰素A在稳定四链体DNA中的应用。式Ⅰ的紫玉兰素A可以稳定G-四链体，式Ⅰ的紫玉兰素A使G-四链体的解链温度提高了3℃以上；式Ⅰ的紫玉兰素A对G-四链体有高选择性和特异性。式Ⅰ的紫玉兰素A与人端粒HTG21序列形成的G-四链体相互作用的结合常数K=1.49×10

说明书

技术领域

本发明涉及紫玉兰素A的新用途，特别涉及式Ⅰ的紫玉兰素A在稳定四链体DNA 中的应用。

背景技术

G-四链体是一类特殊的核酸二级结构，在人类基因组中的一些鸟嘌呤（G）富集区 具有形成这一特殊结构的倾向。G-四链体主要存在于端粒末端G重复序列，以及许多 重要的启动子区域，包括c-myc、c-myb、bcl-2、c-kit、VEGF、胰岛素基因、β-血 红素基因等。最新研究证明，G-四链体在体内是存在的，某些基因的启动子序列区域 在形成G-四链体结构之后，相应基因的转录和表达水平受到了很大影响，因此G-四链 体的形成或拆散可能涉及到体内的一些重要生理事件和过程，比如细胞凋亡、细胞增 殖、信号转导以及肿瘤细胞的形成和发展等。此外，G-四链体拓扑结构的多样性，以 及与普通双链结构上的显著差异，使其成为靶向药物设计的理想靶点。例如，通过药 物干预方法诱导癌基因形成稳定的G－四链体结构，有可能干扰癌细胞的信号转导， 或抑制癌基因的转录和表达等，从而抑制癌细胞的增殖或促进其凋亡。近年来，针对 G-四链体的特殊的拓扑结构，开发与其选择性相互作用的小分子配体作为抗肿瘤药物 研究备受关注。

端粒是真核细胞染色体末端的特殊结构，人类端粒由5’-TTAGGG-3’重复单元组 成。端粒酶是由RNA和蛋白质组成的一种核糖核蛋白复合体，具有逆转录酶的活性， 能以自身RNA为模板合成端粒DNA重复序列，稳定端粒的长度。端粒3’单链垂悬结 构的完整性与端粒的降解、端端融合、重排和丢失而引起基因不稳定和细胞提前衰老 有着密切的联系，而端粒末端G-四链体DNA的形成提供了保护3’末端垂悬可能的分 子机制。这种保护机制体现在三方面，首先，3’末端单链的富G序列折叠成分子内 G-四链体使染色体末端更稳定。其次，G-四链体DNA的形成与由端粒酶引起的端粒延 长有一定的关系。另外，端粒酶对端粒DNA引物的识别是其链状结构而非二级结构， 因此G-四链体DNA的形成阻止了端粒酶对端粒DNA引物的识别，从而抑制了端粒酶活 性。因此，以端粒DNA所形成的G-四链体为靶点开发端粒酶抑制剂抗癌药物是一个具 有发展前景的方向。

目前报道的与G-四链体相互作用的小分子主要有蒽醌类化合物、吖啶类化合物、 异洛嗪类化合物、吲哚喹啉类化合物、二萘嵌苯类化合物、卟啉类化合物和柔性分子 等。这些小分子有着共同的特征即：都具有阳离子取代的缺电子平面芳环结构。含有 氮元素的平面芳环结构使这类配体具有更强的溶解性和亲和力，同时也导致其与G-四 链体相互作用的选择性较弱。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供式Ⅰ的紫玉兰素A在稳定四链体DNA中的应 用。

本发明所提供的应用是下述6种：

1、式Ⅰ的紫玉兰素A在制备稳定四链体DNA产品（如试剂）中的应用，

2、式Ⅰ的紫玉兰素A在制备稳定脊椎动物端粒DNA产品（如试剂）中的应用。

3、式Ⅰ的紫玉兰素A在稳定四链体DNA中的应用。

4、式Ⅰ的紫玉兰素A在稳定脊椎动物端粒DNA中的应用。

5、式Ⅰ的紫玉兰素a在制备特异结合四链体DNA产品（如试剂）中的应用。

6、式Ⅰ的紫玉兰素A在特异结合四链体DNA中的应用。

上文中，所述四链体DNA具体可为G-四链体。上述应用中，所述四链体DNA具体 可为SEQ ID No.1所示的单链脱氧核糖核酸HTG21形成的G-四链体。

式Ⅰ的紫玉兰素A与已经报道的G-四链体配体的区别在于：已报道的配体都含有 氮元素，具有更强的溶解性和与DNA的亲和力，导致其与G-四链体相互作用较强，但 却存在选择性较弱、毒性较大的不足；而式Ⅰ的紫玉兰素A来自于天然产物，不含氮 元素，对四链体DNA选择性大且毒害小。

实验证明，式Ⅰ的紫玉兰素A可以稳定G-四链体，式Ⅰ的紫玉兰素A使G-四链体 的解链温度提高了3℃以上；FRET实验结果证明了式Ⅰ的紫玉兰素A对人端粒HTG21 序列形成的G-四链体具有较好的选择性，对人端粒HTG21序列形成的G-四链体具有较 好的稳定作用。相同CD实验条件下，与同浓度的小檗碱和槲皮素相比，式Ⅰ的紫玉兰 素A对离子诱导形成的G-四链体的稳定作用更高。式Ⅰ的紫玉兰素A对G-四链体有高 选择性和特异性。在G-四链体体系中加入远远过量的双链DNA，不干扰紫玉兰素A与 G-四链体的结合效果，证明式Ⅰ的紫玉兰素A对G-四链体作用具有选择性。同等条件 下式Ⅰ的紫玉兰素A对发卡型双链DNA解链温度无作用，证明式Ⅰ的紫玉兰素A对G- 四链体作用具有特异性；式Ⅰ的紫玉兰素A对不同序列形成的G-四链体DNA稳定能力 的实验结果表明，式Ⅰ的紫玉兰素A对人端粒HTG21序列形成的G-四链体稳定效果最 好。式Ⅰ的紫玉兰素A与人端粒HTG21序列形成的G-四链体相互作用的结合常数 K=1.49×10⁶M^-1，结合比n=2.51。

附图说明

图1为式Ⅰ所示紫玉兰素A的¹H-NMR。

图2为式Ⅰ所示紫玉兰素A的¹³C-NMR。

图3为式Ⅰ所示紫玉兰素A的HRESI-MS。

图4为式Ⅰ所示紫玉兰素A的¹H-¹H COSY。

图5为式Ⅰ所示紫玉兰素A的HMQC。

图6为式Ⅰ所示紫玉兰素A的HMBC。

图7为式Ⅰ所示紫玉兰素A的IR。

图8为式Ⅰ所示紫玉兰素A的UV。

图9为5μM DNA体系的圆二色光谱测试图谱。

图10为5μM DNA-0.1M Na⁺体系的圆二色光谱测试图谱。

图11为5μM DNA-0.1M K⁺体系的圆二色光谱测试图谱。

图12为不同浓度式Ⅰ的紫玉兰素A存在下，G-四链体F21T的Tm曲线。图中的各 个图标中的数值为式Ⅰ的紫玉兰素A的浓度，浓度单位为μM。

图13为式Ⅰ的紫玉兰素A稳定G-四链体F21T的Tm值(℃)随浓度变化曲线。

图14为式Ⅰ的紫玉兰素A稳定F10T双链的曲线图。图中的各个图标中的数值为 式Ⅰ的紫玉兰素A的浓度，浓度单位为μM。

图15为式Ⅰ的紫玉兰素A稳定G-四链体的竞争实验熔点变化图。

图16为600μM的式Ⅰ的紫玉兰素A-DMSO溶液滴定入HTG21G-四链体中的反应 热曲线。

图17为1mM的式Ⅰ的紫玉兰素A-DMSO溶液滴定入HTG21G-四链体中的反应热曲 线。

图18为式Ⅰ的紫玉兰素A滴定HTG21的荧光光谱图。图18中，随箭头方向式Ⅰ 的紫玉兰素A浓度依次增大。

图19为图18的Scatchard图。

图20为DNA-Na-75μM小檗碱体系中G-四链体的稳定性。

图21为DNA-Na-75μM槲皮素体系中G-四链体的稳定性。

图22为DNA-Na-75μM紫玉兰素A体系中G-四链体的稳定性。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了 阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊 说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从 商业途径得到。

下述实施例中的小檗碱为北京欣科中晶科技有限公司产品。

下述实施例中的10mM、pH7.4的Tris-HCl缓冲溶液的溶剂为水，溶质为三羟甲 基氨基甲烷和盐酸，三羟甲基氨基甲烷的浓度为10mM。

下述实施例中的紫玉兰素A均是指式Ⅰ的化合物：

式Ⅰ所示紫玉兰素A可按照文献（Wang WS,Lan XC,Wu HB,Zhong YZ,Li J, Liu Y,Shao CC.Lignans from the flower buds of Magnolia liliflora Desr. Planta Med.2012Jan;78(2):141-147）中的方法制备，具体如下：

将紫玉兰干燥花蕾（购于宁波德康生物制品有限公司）3kg粉碎，用8-10倍体 积的甲醇室温下提取3次，每次7天，合并萃取溶液，减压浓缩得到黑色粘稠状浸 膏220g。将该部分浸膏拌以等量的硅胶(200-300目)，红外灯下挥干溶剂，1kg硅 胶(200-300目)湿法装柱进行层析，以石油醚-丙酮溶剂系统进行梯度洗脱，具体如 下：用流动相1洗脱500ml，再用流动相2洗脱500ml，最后用流动相3洗脱500ml， 收集流动相3洗脱出的液体，将该流动相3洗脱出的液体在旋转蒸发仪上蒸发除去 大部分溶剂，所得母液室温静置，即得到式Ⅰ紫玉兰素A晶体。其中，流动相1是 由体积比为20:1的石油醚和丙酮组成的液体，流动相2是由体积比为15:1的石油 醚和丙酮组成的液体，流动相3是由体积比为10:1的石油醚和丙酮组成的液体。

式Ⅰ所示紫玉兰素A结构解析如下：无色棱晶，m.p.133-134℃（CHCl₃），紫外 灯下薄层检测有荧光，喷洒10%硫酸-乙醇显色剂显紫红色;[α]_D²⁰+11.8°(c0.0012， CHC1₃);UV_λmax(CHC1₃):257，296;IR(KBr):1424，1219，1046;HRESI-MS m/z=371.1484 （图3），[M+H]⁺(calcd for C₂₁H₂₂O₆，calc.Mass for371.1495);¹H-NMR和¹³C-NMR 数据如表1、表2、图1和图2。表1和表2的核磁数据以TMS（四甲基硅烷）作为 化学位移的内标，以CDCl₃为溶剂。式Ⅰ所示紫玉兰素A的¹H-¹H COSY如图4所示 （溶剂为CDCl₃），HMQC如图5所示（溶剂为CDCl₃），HMBC如图6所示（溶剂为CDCl₃）， IR如图7所示，UV如图8所示。

表1.式Ⅰ所示紫玉兰素A的¹H-NMR数据（500MHz）

表2.式Ⅰ所示紫玉兰素A的¹³C-NMR数据（125MHz）

实施例1、式Ⅰ的紫玉兰素A稳定端粒G-四链体DNA

A、本实施例采用荧光共振能量转移技术（FRET）确定式Ⅰ的紫玉兰素A能稳定人 端粒HTG21序列形成的G-四链体，使G-四链体的解链温度提高了3℃以上（△ Tm_max=3.2℃）。并证明该稳定作用是具有一定的浓度依赖性的。

B、本实施例运用FRET法完成式Ⅰ紫玉兰素A对G-四链体的选择性测试，向G- 四链体体系中加入远远过量的双链DNA对反应结果无影响，证明式Ⅰ紫玉兰素A对G- 四链体有高选择性。式Ⅰ的紫玉兰素A对G-四链体和发卡型双螺旋DNA结合效果的比 较，证明式Ⅰ的紫玉兰素A对G-四链体有特异性。

C、本实施例运用FERT法完成式Ⅰ的紫玉兰素A对癌基因序列C-myc和c-kit1 序列形成的G-四链体与人端粒DNA G-四链体的稳定作用比较，确定式Ⅰ的紫玉兰素A 对人端粒HTG21序列形成的G-四链体稳定效果最佳。

D、本实施例通过荧光光谱实验测得式Ⅰ的紫玉兰素A与人端粒HTG21序列形成的 G-四链体相互作用的结合常数K=1.49×10⁶Ｍ^－1，结合比n=2.51。

具体的实验方法和实验结果如下：

1、圆二色光谱法（CD）对G-四链体结构的表征

5μM DNA体系：将SEQ ID No.1所示的单链脱氧核糖核酸HTG21溶解在10mM、 pH7.4的Tris-HCl缓冲溶液中，得到5μM DNA体系，该5μM DNA体系的pH为7.4， HTG21的浓度为5μM。

5μM DNA-0.1M Na⁺体系：将SEQ ID No.1所示的单链脱氧核糖核酸HTG21和NaCl 溶解在10mM、pH7.4的Tris-HCl缓冲溶液中，得到5μM DNA-0.1M Na⁺体系，该5 μM DNA-0.1M Na⁺体系的pH为7.4，HTG21的浓度为5μM，NaCl的浓度为0.1M。5μM  DNA-0.1M K⁺体系：将SEQ ID No.1所示的单链脱氧核糖核酸HTG21和KCl溶解在10mM、 pH7.4的Tris-HCl缓冲溶液中，得到5μM DNA-0.1M K⁺体系，该5μM DNA-0.1M K⁺体系的pH为7.4，HTG21的浓度为5μM，KCl的浓度为0.1M。

将5μM DNA体系、5μM DNA-0.1M Na⁺体系和5μM DNA-0.1M K⁺体系均在95℃水 浴5分钟，冷却至室温，置于4℃冰箱稳定6小时，取出后恢复至室温采用圆二色谱 仪测定其构象的变化情况。结果表明SEQ ID No.1所示的单链脱氧核糖核酸HTG21在 无金属离子和配合物存在下，在256nm处出现明显的正吸收峰，而在235nm及278nm 附近有负的吸收，数据表明在无金属离子和式Ⅰ的紫玉兰素A存在时DNA处于无序状 态，并不具有明显的有序的二级结构（图9）。在0.1M的Na⁺存在的缓冲液中，寡核苷 酸HTG21在295nm处出现正的最大吸收峰，而在265nm处出现了负的最大吸收，这是 典型的反平行G-四链体的特征信号（图10）。在0.1M K⁺缓冲液中，HTG21的CD谱图 在292nm处出现正的最大吸收峰，233nm有负的最大吸收，在270nm附近出现一正的 肩峰，数据表明形成了G-四链体，并且是以混合型存在（图11）。

说明在无金属离子存在的条件下，寡核苷酸HTG21处于无序状态，并不具有明显 的有序的二级结构；在Na⁺存在的条件下，寡核苷酸HTG21以反平行G-四链体结构存 在；在K⁺存在的条件下，寡核苷酸HTG21以反平行和平行G-四链体结构存在。

2、FRET研究化合物稳定端粒G-四链体DNA的能力

制备如下10个测试液：0μM测试液、1μM小檗碱测试液、0.5μM式Ⅰ的紫玉兰 素A测试液、1μM式Ⅰ的紫玉兰素A测试液、1.5μM式Ⅰ的紫玉兰素A测试液、2μM 式Ⅰ的紫玉兰素A测试液、3μM式Ⅰ的紫玉兰素A测试液、4μM式Ⅰ的紫玉兰素A 测试液、5μM式Ⅰ的紫玉兰素A测试液和6μM式Ⅰ的紫玉兰素A测试液。

0μM测试液的制备方法如下：将100μL HTG21储存液和12μL K⁺储存液和48μL 10mM、pH7.4的Tris-HCl缓冲溶液混合在95℃水浴加热5分钟，冷却至20℃，4℃ 放置6小时。取出后恢复至20℃，加入40μL DMSO，混合均匀后室温放置8小时， 得到0μM测试液。该0μM测试液的pH为7.4，HTG21的浓度为200nmol/L，KCl的浓 度为60mM。

1μM小檗碱测试液的配制方法如下：将100μL HTG21储存液和12μL K⁺储存液 和48μL10mM、pH7.4的Tris-HCl缓冲溶液混合在95℃水浴加热5分钟，冷却至 20℃，4℃放置6小时。取出后恢复至20℃，加入40μL小檗碱的DMSO溶液，混合均 匀后室温放置8小时，得到1μM小檗碱测试液。该1μM小檗碱测试液的pH为7.4， HTG21的浓度为200nmol/L，KCl的浓度为60mM，小檗碱的浓度为1μM。

0.5μM式Ⅰ的紫玉兰素A测试液的配制方法如下：将100μL HTG21储存液和12 μL K⁺储存液和48μL10mM、pH7.4的Tris-HCl缓冲溶液混合在95℃水浴加热5 分钟，冷却至20℃，4℃放置6小时。取出后恢复至20℃，加入40μL式Ⅰ的不同浓 度的紫玉兰素A的DMSO溶液，混合均匀后室温放置8小时，分别得到0.5μM式Ⅰ的 紫玉兰素A测试液、1μM式Ⅰ的紫玉兰素A测试液、1.5μM式Ⅰ的紫玉兰素A测试液、 2μM式Ⅰ的紫玉兰素A测试液、3μM式Ⅰ的紫玉兰素A测试液、4μM式Ⅰ的紫玉兰 素A测试液、5μM式Ⅰ的紫玉兰素A测试液和6μM式Ⅰ的紫玉兰素A测试液。0.5μ M式Ⅰ的紫玉兰素A测试液的pH为7.4，HTG21的浓度为200nmol/L，KCl的浓度为60mM， 式Ⅰ的紫玉兰素A的浓度为0.5μM。将0.5μM式Ⅰ的紫玉兰素A测试液中式Ⅰ的紫 玉兰素A的浓度分别替换为1μM、1.5μM、2μM、3μM、4μM、5μM和6μM，其它 组分及浓度不变，分别得到pH均为7.4的1μM式Ⅰ的紫玉兰素A测试液、1.5μM式 Ⅰ的紫玉兰素A测试液、2μM式Ⅰ的紫玉兰素A测试液、3μM式Ⅰ的紫玉兰素A测试 液、4μM式Ⅰ的紫玉兰素A测试液、5μM式Ⅰ的紫玉兰素A测试液和6μM式Ⅰ的紫 玉兰素A测试液。

其中，HTG21是两端带荧光标记的单链脱氧核糖核酸，其序列是 5’-FAM-GGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG-TAMRA-3’。

HTG21储存液是将HTG21溶于10mM、pH7.4的Tris-HCl缓冲溶液中得到的液体。

K+储存液是将KCl溶于超纯水得到的液体。

小檗碱的DMSO溶液是将小檗碱溶于DMSO中得到的液体。

式Ⅰ的紫玉兰素A的DMSO溶液是将式Ⅰ的紫玉兰素A溶于DMSO中得到的液体。

将上述10个测试液进行荧光共振能量转移技术检测。激发波长470nm,发射波长 （监测波长）530nm，读数间隔1℃，温度范围37-99℃，每个测试温度测试样品的恒 温时间为0.5min。每个浓度制作三组平行，取平均值得最终FRET曲线图。数据分析 在软件Origin8.0中进行。

表3各测试液不同温度的荧光强度（归一化）

表4各测试液Tm值

测试液 Tm值/℃ 测试液 Tm值/℃ 0μM 66.7099 2μM式Ⅰ的紫玉兰素A 69.6537 1μM小檗碱 68.5801 3μM式Ⅰ的紫玉兰素A 66.9697 0.5μM式Ⅰ的紫玉兰素A 68.0433 4μM式Ⅰ的紫玉兰素A 69.9307 1μM式Ⅰ的紫玉兰素A 68.3203 5μM式Ⅰ的紫玉兰素A 67.7835 1.5μM式Ⅰ的紫玉兰素A 69.1169 6μM式Ⅰ的紫玉兰素A 69.3939

各测试液不同温度的荧光强度（归一化）如表3所示，其FRET曲线图如图12所 示，各测试液Tm值如表4和图13所示，通过对受体荧光强度的监测可得到温度和荧 光强度的曲线，其荧光强度随温度升高逐渐增大至最大值，后又有所降低，这说明随 着温度的升高，G-四链体结构发生了解链。结果表明式Ⅰ的紫玉兰素A能够稳定G-四 链体结构，因为加入该化合物后的解链温度明显高于未加式Ⅰ的紫玉兰素A的体系（即 0μM的体系）；其次，式Ⅰ的紫玉兰素A对G-四链体的稳定作用是具有浓度依赖性的， 不同浓度的式Ⅰ的紫玉兰素A对G-四链体的稳定作用不同。也就是说，所有溶液中因 为有钾离子的存在而都能形成G-四链体，区别就在于不同浓度的式Ⅰ的紫玉兰素A， 造成了其解链温度不同，从而证明了式Ⅰ的紫玉兰素A对G-四链体的稳定作用。

在下文中，将HTG21形成的G-四链体结构命名为F21T，由表3及图13可知，G- 四链体F21T在0μM测试液的解链温度为66.7099℃，式Ⅰ的紫玉兰素A浓度由0.5 μM增加至6μM，Tm值先随浓度增加而加大，随后出现波动，式Ⅰ的紫玉兰素A浓度 为2μM时的Tm值与6μM相近。最大Tm值出现在式Ⅰ的紫玉兰素A浓度4μM时，为 69.9307℃，相对于未加入化合物（式Ⅰ的紫玉兰素A和小檗碱）的G-四链体解链温 度升高了3.2℃。说明式Ⅰ的紫玉兰素A提高了G-四链体的热稳定性。

3.FRET法确定特异性与选择性

3.1、ds26确定选择性

为了进一步研究式Ⅰ的紫玉兰素A对G-四链体以及双螺旋DNA的选择性问题，引 入了竞争FRET实验。向含有0.2μM SEQ ID No.1所示的单链脱氧核糖核酸HTG21和 式Ⅰ的紫玉兰素A测试液中加入没有发色团标记且大大过量的双螺旋DNA ds26 （5’-CAATCGGATCGAATTCGATCCGATTG-3’），浓度分别为0、3、10μM，观察大大过量 的双螺旋的加入对G四链体Tm值的影响（图15）。结果如15所示，表明向步骤2的4 μM式Ⅰ的紫玉兰素A测试液中加入0μM ds26的体系的Tm值是69.5307℃，向步骤 2的4μM式Ⅰ的紫玉兰素A测试液中加入3μM ds26的体系的Tm值是69.2708℃，向 步骤2的4μM式Ⅰ的紫玉兰素A测试液中加入10μM ds26的体系的Tm值是 69.0675℃，说明式Ⅰ的紫玉兰素A在50倍的双链存在下仍然不会改变稳定G-四链体 的能力，说明该式Ⅰ的紫玉兰素A可以选择性的作用于G-四链体结构。

具体的实验方法如下：

ds260μM测试液（ds260）的配制方法如下：将100μL HTG21储存液和12μL K⁺储存液和48μL10mM、pH7.4的Tris-HCl缓冲溶液混合在95℃水浴加热5分钟， 冷却至20℃，4℃放置6小时。取出后恢复至20℃，加入40μL式Ⅰ的紫玉兰素A的 DMSO溶液，混合均匀后室温放置8小时，得到ds260μM测试液。该ds260μM测试 液的pH为7.4，HTG21的浓度为200nmol/L，KCl的浓度为60mM，式Ⅰ的紫玉兰素A 的浓度为4μM。

ds263μM测试液（ds263.0）的配制方法如下：将100μL HTG21储存液和12 μL K⁺储存液混合在95℃水浴加热5分钟，冷却至20℃，4℃放置6小时。取出后恢 复至20℃，加入48μL ds26溶液和40μL式Ⅰ的紫玉兰素A的DMSO溶液，混合均匀 后室温放置8小时，得到ds263μM测试液（ds263.0）。该ds263μM测试液的pH 为7.4，HTG21的浓度为0.2μM，KCl的浓度为60mM，ds26的浓度为3μM，式Ⅰ的紫 玉兰素A的浓度为4μM。

ds2610μM测试液（ds2610.0）的配制方法如下：将100μL HTG21储存液和12 μL K⁺储存液混合在95℃水浴加热5分钟，冷却至20℃，4℃放置6小时。取出后恢 复至20℃，加入48μL ds26溶液和40μL式Ⅰ的紫玉兰素A的DMSO溶液，混合均匀 后室温放置8小时，得到ds2610μM测试液。该ds2610μM测试液的pH为7.4，HTG21 的浓度为0.2μM，KCl的浓度为60mM，ds26的浓度为10μM，式Ⅰ的紫玉兰素A的浓 度为4μM。

其中，HTG21是两端带荧光标记的单链脱氧核糖核酸，其序列是 5’-FAM-GGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG-TAMRA-3’。ds26是核苷酸序列为 5’-CAATCGGATCGAATTCGATCCGATTG-3’的双螺旋DNA。

HTG21储存液是将HTG21溶于10mM、pH7.4的Tris-HCl缓冲溶液中得到的液体。

ds26溶液是将ds26溶于10mM、pH7.4的Tris-HCl缓冲溶液中得到的液体。

K⁺储存液是将KCl溶于超纯水得到的液体。

式Ⅰ的紫玉兰素A的DMSO溶液是将式Ⅰ的紫玉兰素A溶于DMSO中得到的液体。

将上述3个测试液进行荧光共振能量转移技术检测。激发波长470nm,发射波长（监 测波长）530nm，读数间隔1℃，温度范围37-99℃，每个测试温度测试样品的恒温时 间为0.5min。每个浓度制作三组平行，取平均值得最终FRET曲线图。数据分析在软 件Origin8.0中进行。

3.2、F10T序列确定特异性

为了研究式Ⅰ的紫玉兰素A对于DNA的特异性，选用了可以两端带荧光标记的自 身形成发卡型双螺旋的DNA F10T （5’-FAM-dTATAGCTATA-HEG-TATAGCTATA-TAMRA-3’）进行FRET实验，结果如表5 和图14所示，在多个浓度下式Ⅰ的紫玉兰素A对发卡型双螺旋DNA F10T基本没有稳 定作用，△Tm≈0℃，说明该式Ⅰ的紫玉兰素A化合物可以特异性的稳定G-四链体。 F10T中，FAM和TAMRA为荧光标记。

具体实验方法如下：

制备0μM测试液，其制备方法同步骤2的0μM测试液。

用SEQ ID No.1所示的单链脱氧核糖核酸HTG21制备6个G-四链体测试液，其制 备方法同步骤2的1μM式Ⅰ的紫玉兰素A测试液（在本实验中称为1μM G-四链体 测试液）、2μM式Ⅰ的紫玉兰素A测试液（在本实验中称为2μM G-四链体测试液）、 3μM式Ⅰ的紫玉兰素A测试液（在本实验中称为3μM G-四链体测试液）、4μM式Ⅰ 的紫玉兰素A测试液（在本实验中称为4μM G-四链体测试液）、5μM式Ⅰ的紫玉兰 素A测试液（在本实验中称为5μM G-四链体测试液）、6μM式Ⅰ的紫玉兰素A测试 液（在本实验中称为6μM G-四链体测试液）。

将上述6个G-四链体测试液中的HTG21分别替换为相同浓度的F10T，制备方法中 其它均不变，得到6个双链DNA测试液：1μM双链DNA测试液、2μM双链DNA测试液、 3μM双链DNA测试液、4μM双链DNA测试液、5μM双链DNA测试液和6μM双链DNA 测试液。

将上述13个测试液分别进行荧光共振能量转移技术检测。激发波长470nm,发射 波长（监测波长）530nm，读数间隔1℃，温度范围37-99℃，每个测试温度测试样品 的恒温时间为0.5min。每个浓度制作三组平行，取平均值得最终FRET曲线图。数据 分析在软件Origin8.0中进行。

表5式Ⅰ的紫玉兰素A化合物稳定的G四链体和双链DNA的熔点变化值

4.式Ⅰ的紫玉兰素A化合物对不同序列形成的G-四链体的稳定作用的比较（FRET 法）

为了研究式Ⅰ的紫玉兰素A对不同序列形成的G-四链体DNA稳定能力的差异，用 式Ⅰ的紫玉兰素A对两端带荧光标记的单链脱氧核糖核酸 HTG21(5’-FAM-GGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG-TAMRA-3’)、两端带有荧光标记的c-myc 序列中的Pu22(5’-FAM-GAGGGTGGGGAGGGTGGGGAAG-TAMRA-3’)和两端带有荧光标记 的c-kit1(5’-FAM-GGGAGGGCGCTGGGAGGAGGG-TAMRA-3’)形成的G-四链体分别进行 FRET实验，在相同实验条件下对其Tm曲线进行比较。实验结果表明FPu22T因为稳定 效果不佳，无法给出准确的Tm值，HTG21的Tm值如表6，Fc-kit1T的Tm值如表7。 说明式Ⅰ的紫玉兰素A化合物对人端粒HTG21序列形成的G-四链体稳定效果最好。

表6、HTG21的各测试液Tm值和△Tm值

表7、Fc-kit1T的各测试液Tm值和△Tm值

具体的实验方法如下：

HTG21的0μM测试液、0.5μM式Ⅰ的紫玉兰素A测试液、1μM式Ⅰ的紫玉兰素A 测试液、1.5μM式Ⅰ的紫玉兰素A测试液、2μM式Ⅰ的紫玉兰素A测试液、3μM式 Ⅰ的紫玉兰素A测试液、4μM式Ⅰ的紫玉兰素A测试液、5μM式Ⅰ的紫玉兰素A测试 液和6μM式Ⅰ的紫玉兰素A测试液的制备方法同步骤2；Fc-kit1T的0μM测试液、 0.5μM式Ⅰ的紫玉兰素A测试液、1μM式Ⅰ的紫玉兰素A测试液、1.5μM式Ⅰ的紫 玉兰素A测试液、2μM式Ⅰ的紫玉兰素A测试液、3μM式Ⅰ的紫玉兰素A测试液、4 μM式Ⅰ的紫玉兰素A测试液、5μM式Ⅰ的紫玉兰素A测试液和6μM式Ⅰ的紫玉兰素 A测试液的制备方法中除将HTG21分别替换为相同浓度的Fc-kit1T，其它均不变。 FPu22T的0μM测试液、0.5μM式Ⅰ的紫玉兰素A测试液、1μM式Ⅰ的紫玉兰素A测 试液、1.5μM式Ⅰ的紫玉兰素A测试液、2μM式Ⅰ的紫玉兰素A测试液、3μM式Ⅰ 的紫玉兰素A测试液、4μM式Ⅰ的紫玉兰素A测试液、5μM式Ⅰ的紫玉兰素A测试液 和6μM式Ⅰ的紫玉兰素A测试液的制备方法中除将HTG21分别替换为相同浓度的 FPu22T，其它均不变。

将上述36个测试液分别进行荧光共振能量转移技术检测。激发波长470nm,发射 波长（监测波长）530nm，读数间隔1℃，温度范围37-99℃，每个测试温度测试样品 的恒温时间为0.5min。每个浓度制作三组平行，取平均值得最终FRET曲线图。数据 分析在软件Origin8.0中进行。

5.ITC测定式Ⅰ的紫玉兰素A与G-四链体相互作用的热力学常数

通过前面的实验，从稳定能力、G-四链体DNA和双链DNA之间的选择性等方面对 式Ⅰ的紫玉兰素A进行了评价。为了全面研究式Ⅰ的紫玉兰素A与G-四链体DNA的作 用，选用等温滴定微量热仪从热力学角度考察式Ⅰ的紫玉兰素A结合G-四链体DNA的 能力。

本试验中，为了尽量模拟生理环境，同时也确保所有富G序列都形成稳定的G-四 链体DNA结构，所有实验都在60mM钾离子存在的体系中。将式Ⅰ的紫玉兰素A滴入 G-四链体溶液中，记录反应热量的变化，得到滴定曲线。具体实验方法如下：

600μM式Ⅰ的紫玉兰素A-DMSO溶液配制：将式Ⅰ的紫玉兰素A和DMSO溶于10mM、 pH7.4的Tris-HCl缓冲溶液中得到式Ⅰ的紫玉兰素A浓度为600μM的式Ⅰ的紫玉兰 素A-DMSO溶液。

G-四链体溶液配制：将SEQ ID No.1所示的单链脱氧核糖核酸HTG21、DMSO和KCl 加入10mM、pH7.4的Tris-HCl缓冲溶液中，得到G-四链体溶液。该G-四链体溶液 的pH为7.4，HTG21的浓度为60μM，KCl的浓度为60mM。G-四链体溶液和600μM式 Ⅰ的紫玉兰素A-DMSO溶液中的DMSO浓度相同。

在25℃，将600μM式Ⅰ的紫玉兰素A-DMSO溶液滴入G-四链体溶液中，滴定25 次，每次间隔时间300s，每2s取一次点，搅拌速率为307rpm⁵。对滴定曲线用仪器自 带软件拟合，计算结合自由能、焓变、熵变和结合比。

实验结果显示(图16)，反应是个吸热体系，随着式Ⅰ的紫玉兰素A不断滴定，越 来越多的式Ⅰ的紫玉兰素A结合到G-四链体DNA上，每次滴定吸收的热量逐渐减小， 直到体系里的化合物接近饱和。同时也可看出，式Ⅰ的紫玉兰素A与G-四链体的反应 只集中在前几次滴定，反应中的热量变化较小。为了使式Ⅰ的紫玉兰素A与G-四链体 反应更加充分，同时检验反应热偏小是否与式Ⅰ的紫玉兰素A浓度有关，加大了式Ⅰ 的紫玉兰素A的浓度，再次进行等温滴定微量热实验。其中，除了将600μM式Ⅰ的紫 玉兰素A-DMSO溶液替换为1mM式Ⅰ的紫玉兰素A-DMSO溶液外，其它实验方法同上。 实验结果如图17所示。

其中，1mM式Ⅰ的紫玉兰素A-DMSO溶液配制：将式Ⅰ的紫玉兰素A溶于DMSO中 得到式Ⅰ的紫玉兰素A浓度为1mM的式Ⅰ的紫玉兰素A-DMSO溶液。

通过图16和图17的对比发现，加大式Ⅰ的紫玉兰素A浓度后，反应热没有明显 增大且呈现周期性变化。

6.荧光光谱法测定式Ⅰ的紫玉兰素A与G-四链体相互作用的结合常数

为了从动力学角度考察式Ⅰ的紫玉兰素A与端粒G-四链体的结合能力，采用了荧 光滴定实验。由于紫玉兰素A自身结构导致其荧光性较差，在体系中同时加入紫玉兰 素A和小檗碱，固定小檗碱和G-四链体浓度，改变紫玉兰素A浓度，通过监测不同条 件下小檗碱荧光强度的变化对紫玉兰素A与G-四链体的结合常数进行计算。在实验中， 利用K+诱导HTG21形成G-四链体，固定DNA浓度为5μM。向体系中加入浓度为0-3.5 μM式Ⅰ的紫玉兰素A和固定浓度0.5μM的小檗碱。图18显示了不同浓度式Ⅰ的紫 玉兰素A与相同浓度DNA作用的荧光光谱。随着式Ⅰ的紫玉兰素A浓度的增大，荧光 强度逐渐增大。

采用Scatchard分析法作图，计算式Ⅰ的紫玉兰素A与G-四链体的结合常数。以 r为横坐标，r/C为纵坐标作图，结果如图19所示。其中，r为式Ⅰ的紫玉兰素A浓 度和小檗碱浓度之和与DNA浓度的比值，C为自由配体浓度。即：

r=（Y+L₀）/G₀，

C=L=F·L₀/F₀（由荧光公式L/L0=F/F0得），

r/C=K（n-r）(由Scatchard作图定义式得)。

（注：本实验中，Y为式Ⅰ的紫玉兰素A浓度；L₀为小檗碱浓度；G₀为G-四链体 浓度；F为实验测得的荧光强度；F₀为不含式Ⅰ的紫玉兰素A的G-四链体和小檗碱体 系的荧光强度，测得F₀=1160；n为结合比；K为结合常数）

由Scatchard图可得，结合常数K=1.49×10⁶，结合比n=2.51，则G-四链体与式 Ⅰ的紫玉兰素A以1:2或1:3的比例相结合。

具体的实验方法如下：

配制如下7个反应体系：0μM式Ⅰ的紫玉兰素A反应体系、0.5μM式Ⅰ的紫玉兰 素A反应体系、1μM式Ⅰ的紫玉兰素A反应体系、1.5μM式Ⅰ的紫玉兰素A反应体系、 2μM式Ⅰ的紫玉兰素A反应体系、2.5μM式Ⅰ的紫玉兰素A反应体系、3μM式Ⅰ的 紫玉兰素A反应体系和3.5μM式Ⅰ的紫玉兰素A反应体系。

0μM式Ⅰ的紫玉兰素A反应体系的配制方法如下：用SEQ ID No.1所示的单链脱 氧核糖核酸HTG21、KCl和50μM小檗碱-DMSO原液加入10mM、pH7.4的Tris-HCl 缓冲溶液中，得到0μM式Ⅰ的紫玉兰素A反应体系。该0μM式Ⅰ的紫玉兰素A反应 体系的pH为7.4，HTG21的浓度为5μM，KCl的浓度为60mM，式Ⅰ的紫玉兰素A的 浓度为0μM，小檗碱的浓度为0.5μM。

3.5μM式Ⅰ的紫玉兰素A反应体系的配制方法如下：用SEQ ID No.1所示的单链 脱氧核糖核酸HTG21、KCl、50μM式Ⅰ的紫玉兰素A-DMSO原液和50μM小檗碱-DMSO 原液加入10mM、pH7.4的Tris-HCl缓冲溶液中，得到3.5μM式Ⅰ的紫玉兰素A反 应体系。该3.5μM式Ⅰ的紫玉兰素A反应体系的pH为7.4，HTG21的浓度为5μmol/L， KCl的浓度为60mM，式Ⅰ的紫玉兰素A的浓度为3.5μM，小檗碱的浓度为0.5μM。

将3.5μM式Ⅰ的紫玉兰素A反应体系中式Ⅰ的紫玉兰素A的浓度分别替换为0.5 μM、1μM、1.5μM、2μM、2.5μM和3μM，其它组分及浓度不变，分别得到pH均为 7.4的0.5μM式Ⅰ的紫玉兰素A反应体系、1μM式Ⅰ的紫玉兰素A反应体系、1.5μM 式Ⅰ的紫玉兰素A反应体系、2μM式Ⅰ的紫玉兰素A反应体系、2.5μM式Ⅰ的紫玉兰 素A反应体系和3μM式Ⅰ的紫玉兰素A反应体系。

其中，50μM小檗碱-DMSO原液配制：将0.0744mg小檗碱溶于4ml DMSO中得到 50μM小檗碱-DMSO原液。

50μM式Ⅰ的紫玉兰素A-DMSO原液配制：将0.0743mg式Ⅰ的紫玉兰素A溶于4ml  DMSO中得到50μM式Ⅰ的紫玉兰素A-DMSO原液。

将上述6个反应体系放入lcm四面透光的石英池进行荧光光度分析。激发光源采 用氚灯激发，激发波长为630nm。入射狭缝与出射狭缝宽度均为10nm，扫描速度为 1200nm/min。

为了从动力学角度考察紫玉兰素A与端粒G-四链体的结合能力，采用了荧光滴定 实验。紫玉兰素A自身结构的限制（共轭π键被打断）使其不具有荧光性，因此选择 了已报道的具有荧光性的G-四链体配体模式化合物—小檗碱作为荧光检测的对象，通 过相同浓度小檗碱在不同浓度紫玉兰素A体系中表现出的不同荧光强度，结合荧光公 式和Scatchard分析法，间接推算出紫玉兰素A与G-四链体的结合常数。

荧光光谱实验能够检测出溶液中自由配体的荧光光度值，在本实验中，若监测到 的荧光强度增加，则说明体系中自由小檗碱的量增加，更多的紫玉兰素A与G-四链体 结合；反之，若监测到的荧光强度减小，则体系中自由小檗碱的量减少，游离的紫玉 兰素A增加，则紫玉兰素A与G-四链体的结合效果较差。

本实施例通过FRET实验发现，式Ⅰ的紫玉兰素A能够很好的稳定G-四链体DNA， 并且不稳定发卡型双螺旋DNA；在远远过量的双链体系中，式Ⅰ的紫玉兰素A对G-四 链体的稳定作用没有受到影响；FRET实验结果证明了式Ⅰ的紫玉兰素A对人端粒HTG21 序列形成的G-四链体具有较好的选择性，对人端粒HTG21序列形成的G-四链体具有较 好的稳定作用。为了更深入的研究式Ⅰ的紫玉兰素A与G-四链体DNA相互作用，通过 ITC实验研究式Ⅰ的紫玉兰素A与G-四链体DNA的结合模式。ITC实验结果证明式Ⅰ 的紫玉兰素A与G-四链体DNA之间能够结合，其结合位点可能不是单一的，其结合模 式可能有多种，并随着式Ⅰ的紫玉兰素A浓度的变化而有所差异，这也与FRET熔点实 验中△Tm值随浓度增大产生波动的结果相符。以上实验结果说明式Ⅰ的紫玉兰素A化 合物不但能稳定G-四链体DNA，而且还能够选择性的识别G-四链体DNA结合，而与发 卡型双螺旋DNA基本无结合，在不同G-四链体DNA之间表现出一定的选择性。

对比例、在浓度为75μM时，式Ⅰ的紫玉兰素A对G-四链体的稳定作用强于已知 的G-四链体稳定剂小檗碱和槲皮素

采用圆二色谱仪测定0μM化合物体系、DNA-Na-75μM小檗碱体系、DNA-Na-75 μM槲皮素体系和DNA-Na-75μM紫玉兰素A体系的构象变化情况。其中，0μM化合 物体系、DNA-Na-75μM小檗碱体系、DNA-Na-75μM槲皮素体系和DNA-Na-75μM紫玉 兰素A体系按照如下方法制备。

0μM化合物体系的制备：将SEQ ID No.1所示的单链脱氧核糖核酸HTG21和NaCl 加入10mM、pH7.4的Tris-HCl缓冲溶液中，在95℃水浴5分钟，冷却至室温，置 于4℃冰箱稳定6小时，取出后恢复至室温得到0μM化合物体系，该0μM化合物体 系的pH为7.4，HTG21的浓度为5μM，NaCl的浓度为0.1M。

DNA-Na-75μM小檗碱体系的制备：将SEQ ID No.1所示的单链脱氧核糖核酸HTG21 和NaCl加入10mM、pH7.4的Tris-HCl缓冲溶液中，在95℃水浴5分钟，冷却至室 温，置于4℃冰箱稳定6小时，取出后恢复至室温，加入小檗碱的DMSO溶液（溶质为 小檗碱，溶剂为DMSO），得到DNA-Na-75μM小檗碱体系。该DNA-Na-75μM小檗碱体 系的pH为7.4，HTG21的浓度为5μM，NaCl的浓度为0.1M，小檗碱的浓度为75μM。

DNA-Na-75μM槲皮素体系的制备：将SEQ ID No.1所示的单链脱氧核糖核酸HTG21 和NaCl加入10mM、pH7.4的Tris-HCl缓冲溶液中，在95℃水浴5分钟，冷却至室 温，置于4℃冰箱稳定6小时，取出后恢复至室温，加入槲皮素的DMSO溶液（溶质为 槲皮素，溶剂为DMSO），得到DNA-Na-75μM槲皮素体系。该DNA-Na-75μM槲皮素体 系的pH为7.4，HTG21的浓度为5μM，NaCl的浓度为0.1M，槲皮素的浓度为75μM。

DNA-Na-75μM紫玉兰素A体系的制备：将SEQ ID No.1所示的单链脱氧核糖核酸 HTG21和NaCl加入10mM、pH7.4的Tris-HCl缓冲溶液中，在95℃水浴5分钟，冷 却至室温，置于4℃冰箱稳定6小时，取出后恢复至室温，加入式Ⅰ的紫玉兰素A的 DMSO溶液（溶质为式Ⅰ的紫玉兰素A，溶剂为DMSO），得到DNA-Na-75μM紫玉兰素A 体系，该DNA-Na-75μM紫玉兰素A体系的pH为7.4，HTG21的浓度为5μM，NaCl的 浓度为0.1M，式Ⅰ的紫玉兰素A的浓度为75μM。

结果表明HTG21在0μM化合物体系中形成的G-四链体的Tm是70.585601℃；HTG21 在DNA-Na-75μM小檗碱体系中形成的G-四链体的Tm值为72.471307℃，相比没有加小檗 碱的G-四链体的Tm值，提高了1.885706℃；HTG21在DNA-Na-75μM槲皮素体系中形成的 G-四链体的Tm值为72.172772℃，相比没有加槲皮素的G-四链体的Tm值，提高了 1.587171℃；HTG21在DNA-Na-75μM紫玉兰素A体系中形成的G-四链体的Tm值为 72.534499℃，相比没有加式Ⅰ的紫玉兰素A的G-四链体的Tm值提高了1.948898℃，较 同浓度的小檗碱和槲皮素而言，式Ⅰ的紫玉兰素A对G-四链体的稳定作用更高。