一种血液培养方法

摘要

本发明公开了一种血液培养方法，其包括如下步骤：在离心管中加入溶血剂，密封离心管，管内进行消毒灭菌达到无菌状态；将通过无菌手段采集到的血液样本注入离心管，在室温状态下震荡离心管，充分混合血液样本和溶血剂，使血细胞裂解，血细胞内的病原体释放出来；以3k～15krpm的离心速度将离心管离心10～60分钟，平稳取出离心管；离心管内的混合液呈现分离，形成上清液和沉淀浓缩液；提取出离心管内的沉淀浓缩液；将沉淀浓缩液接种至琼脂培养基进行孵育培养检验，同时进行涂片染色镜检。本方法流程简单、检验时间短、成本低且阳性检出率高。

说明书

技术领域

本发明涉及一种血液培养方法。

背景技术

现行的血液培养是将新鲜离体的血液标本接种至营养培养基上，在一定温度、湿度等条件下，使对营养要求较高的细菌生长繁殖，从而检出病原菌的一种人工培养法。该培养法常用于菌血症、败血症及脓毒败血症的病因学诊断。

传统的血液培养过程：采集患者血液标本，注入血液培养瓶，瓶中有几十毫升的液体肉汤培养基。如果在五天之内肉汤血培养呈阳性，则需要抽出菌液，接种至适当的琼脂培养基上，再继续孵育，获得菌落方可进行细菌鉴定和药物敏感性试验；如果肉汤血培养呈阴性，则在第五天时需要抽出菌液，接种至适当的琼脂培养基，再继续孵育，即为“盲转”。该传统方法中存在如下缺陷：

(1)血液标本注入肉汤培养基中后，患者血液中存在的免疫因子和可能存在的抗生素均对血液中的病原体有抑制作用，从而影响阳性检出结果的准确性；

(2)血液标本中血细胞完整，细胞内的病原体受限于细胞膜，难以培养检出，敏感性和特异性都会受到影响，从而影响阳性检出率；

(3)血液标本先在肉汤培养基中培养，不论其结果是否阳性，均需要抽出接种至固相的琼脂培养基，检验时间长，并且如果血液中的病原菌为真菌，单单液相的肉汤培养基孵育则容易出现假阴性而漏检；

(4)用于血液培养的肉汤培养基比较贵，有效期较短，一般最多一年；特别是血培养仪器，动辄几十上百万，一般中小医院、边远地区的卫生所难以承受；

(5)采集患者血液标本后，一般采用离心管提取一定量的血液注入血液培养瓶进行培养，通常是采用抽采器具从离心管中抽出一定量的血液，而血液培养的培养过程中对无菌环境的要求很高，而抽采器具容易污染血液标本，引入细菌等，造成检验干扰。

发明内容

本发明的目的在于提供一种流程简单、检验时间短、成本低且阳性检出率高的血液培养方法。

本发明的血液培养方法，包括以下步骤：

a．在离心管中加入溶血剂，密封离心管，管内进行消毒灭菌达到无菌状态；

b．通过无菌手段采集血液样本注入离心管，在室温状态下震荡离心管，充分混合血液样本和溶血剂，使血细胞裂解，血细胞内的病原体释放到血细胞外；

c．以3k～15krpm的离心速度将离心管离心10～60分钟，平稳取出离心管；

d．离心管内的混合液呈现分离，形成上清液和沉淀浓缩液；

e．提取出离心管内的沉淀浓缩液；

f．将沉淀浓缩液接种至琼脂培养基进行孵育培养检验，同时进行涂片染色镜检。

进一步地，所述离心管从上至下依次为上管、中管和收集管，所述中管与上管、收集管可拆卸式连接，所述上管两端开口且上端开口设有密封盖组件，所述中管两端开口且内设隔离阀，所述收集管的上端开口且下端为圆弧底面；步骤b中血液样本的注入量以使步骤d中的沉淀浓缩液填充满隔离阀以下的管内容积为准；步骤e中提取沉淀浓缩液的过程为：先关闭隔离阀，再使收集管脱离，收集管内的溶液即为沉淀浓缩液。

本方案具有如下优点：

（1）血细胞在孵育培养前被裂解，细胞内隐藏的病原体被释放出来，提高了病原体的浓度，使检验的敏感性和特异性得以提高，进而提高了阳性检出率；

（2）离心处理去除包含大部分抗生素和免疫因子的上清液，起到浓缩血液标本中有效成分的作用，提高了阳性检出率；

（3）省去了肉汤培养基及其培养过程，直接将裂解离心浓缩后的血液标本接种到琼脂培养基上，为临床诊治节约时间，克服了微生物学检验慢的短板；

（4）不需要肉汤培养基及相关昂贵、笨重的血培养仪器，避免安装、运输和使用所需的苛刻条件，不必担心培养基有效期限的问题，且只需要室温储存，仅用到离心管和普通的离心机即可，轻便且成本低，适用于小医院、卫生所、军队战地医院。

并且，本案中的离心管采用隔离阀来阻截上清液和沉淀浓缩液，使得在提取沉淀浓缩液时，避免了采用抽采器具影响操作效率和污染沉淀物的问题，做到了无污染，保证阳性检出率的准确性。离心管的上管、中管和收集管的可拆卸式结构，在提取沉淀浓缩液时便捷，简化了操作流程，保证了沉淀浓缩液的质量。

附图说明

图1为本发明实施例二中的离心管倒置时的结构状态图；

图2为本发明实施例三中的离心管的结构图。

附图标记说明：1—上管；2—收集管；3—隔离阀；7—密封盖组件；11—中管；31—阀体开关；32—钢珠；33—支架；34—钢珠座。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步的描述。

实施例一

a．在离心管中加入与血液标本的体积比为1：5的溶血剂，通过离心管上端的密封盖组件密封离心管，再对管内进行消毒灭菌达到无菌状态；或先将离心管和溶血剂分别灭菌，再将溶血剂加入到已是无菌状态的离心管中，再密封；

b．将通过无菌手段采集到的血液样本注入离心管，在室温状态下稍稍用力震荡离心管十来下，即可充分混合血液样本和溶血剂，使血细胞裂解，使得血细胞内藏匿的细菌释放出来；

c．以3krpm的离心速度将离心管离心30分钟，平稳取出离心管，勿振摇；

d．等待离心管内的混合液呈现分离，形成上清液和沉淀浓缩液；

e．采用抽采器具抽掉上清液，换新的抽采器具提取出离心管内的沉淀浓缩液，抽采器具使用前进行消毒灭菌处理；

f．用接种环或拭子即可轻易蘸取沉淀浓缩液直接划线接种于各种适当的琼脂培养基上进行孵育培养检验，同时进行涂片染色镜检。

实施例二

a．准备特制的离心管，离心管由上管1、中管11和收集管2可拆卸式组装而成，所述上管1两端开口且上端开口设有密封盖组件7，所述中管11两端开口且内设钢珠式单向隔离阀3，离心管直立时，钢珠32置于支架33上，阀门打开；离心管倒置时，如图1所示，钢珠32脱离支架33，钢珠32堵住钢珠座34的通道，阀门关闭，所述收集管2的上端开口且下端为圆弧底面；加入与血液标本的体积比为1：20的溶血剂，密封离心管，管内进行消毒灭菌达到无菌状态；

b．血液样本的注入量以使步骤d中的沉淀浓缩液填充满隔离阀以下的管内容积为准，其余与实施例一中的步骤b相同；

c．以10krpm的离心速度将离心管离心10分钟，平稳取出离心管，勿振摇；

d．与实施例一中的步骤d相同；

e．倒置离心管，阀门呈关闭状态，使上管1脱离；再将收集管2直立，阀门呈打开状态，拧下中管11，收集管2与中管11脱离，得到沉淀浓缩液；

f．与实施例一中的步骤f相同。

实施例三

a．准备特制的离心管，如图2所示，离心管由上管1、中管11和收集管2可拆卸式组装而成，所述上管1两端开口且上端开口设有密封盖组件7，所述中管11两端开口且内设带阀体开关31的截断类隔离阀3，阀体开关31设于管外，通过阀体开关31控制阀门的通断，所述收集管2的上端开口且下端为圆弧底面；加入与血液标本的体积比为1：10的溶血剂，密封离心管，管内进行消毒灭菌达到无菌状态；

b．与实施例二中的步骤b相同；

c．以15krpm的离心速度将离心管离心60分钟，平稳取出离心管，勿振摇；

d．与实施例一中的步骤d相同；

e．保持离心管直立状态，通过阀体开关31关闭阀门，直接拧下收集管2，得到沉淀浓缩液；

f．与实施例一中的步骤f相同。

上述实施例一采用的是普通离心管，在提取沉淀浓缩液的过程中应注意抽采器具等的无菌处理，应避免污染，以免导致检测无效。而实施例二和实施例三无抽采器具的引入，更容易做到无污染，保证整个过程的无菌状态，无需采取繁琐的步骤措施来预防污染，提高了工作效率，为临床诊断争取了宝贵时间。因此，在实施中，优选的采用实施例二和三的方式来进行血液培养。

以下是本发明与现有技术的比较和分析，统计分析相关性，以进一步评价本发明的技术方案。

(1)材料和方法

以梅里埃的血液培养仪器及其血培养瓶设为对照组，采集临床有感染指征患者的血液做血液培养。以本发明的新方法作为测试组，二者配对做比对试验。

记录和结果

对照组标本和测试组培养例数均为227例，其中，对照组阳性27例（阳性检出率为11.89%），测试组阳性34例（阳性检出率为14.98%）。

分析评价

两组统计学分析，卡方检验=2.0489，p＜0.05，拒绝H0，相差显著。仅仅从阳性率来看，本发明的新方法结果优于现有方法的进口设备及其血培养瓶得出的结果。造成这种结果的原因可能是：a临床患者在抽血时机往往不是最佳时机，而是之前就使用了抗生素，也即是血液中有较高的抗生素浓度，而新方法因离心浓缩去除了大多数抗生素，减弱了抗生素对病原体的抑制作用，浓缩后待检样本中病原体的浓度提高，进而提高了阳性检验的敏感性和特异性；b 本方法裂解了血细胞，释放出了细胞中的病原体，提高了病原体浓度，从而使得检出率提高。