唾液乳杆菌及其应用以及功能食品组合物及其制备方法

摘要

本发明提供了一种唾液乳杆菌（Lactobacillus salivarius），其特征在于，所述唾液乳杆菌的保藏编号为CGMCC No.6288。本发明还提供了一种功能食品组合物及其制备方法，包括：将如上所述的唾液乳杆菌的活菌体灭活，得到菌体物质。本发明还提供了一种功能食品组合物，所述功能食品组合物含有如上所述的唾液乳杆菌的活菌体。本发明还提供了如上所述的唾液乳杆菌在制备延缓衰老的功能食品组合物中的应用。本发明提供的唾液乳杆菌的活菌体及灭活后的菌体物质均具有延缓衰老的功效。

说明书

技术领域

本发明涉及唾液乳杆菌（Lactobacillus salivarius）及其应用以及功能食 品组合物及其制备方法，具体地，涉及一种唾液乳杆菌，含有该唾液乳杆菌 的功能食品组合物及其制备方法，以及该唾液乳杆菌在制备延缓衰老的功能 食品中的应用。

背景技术

衰老是机体组织、器官功能随年龄增长而发生的退行性变化(Turnheim, 2003)，是机体各种生化反应的综合表现。经济的快速发展，科学技术的进 步，使发达国家和一些发展中国家步入了老龄化社会。人口老龄化问题已经 成为了全球性的社会问题。截至2009年底，中国60岁及以上的老年人口达 1.6714亿，占总人口的12.5%，预计到2020年将达到2.43亿。随着年龄的 增长及机体的衰老，与衰老相关的疾病，如心血管、神经系统疾病、肿瘤、 糖尿病等，威胁着人类的寿命和生活质量。因此，越来越多的研究专注于寻 找具有抗衰老作用的物质并研究其抗衰老机理。目前多种天然产物已经被证 实具有抗衰老作用。但是目前认为的具有抗衰老作用的物质来源较为单一， 分离纯化成本高，具有抗衰老作用的药物又具有一定的副作用，从而限制了 这些物质的大范围应用。益生菌安全性较高，分离纯化成本低，如果能够明 确益生菌的抗衰老功能，并确定其抗衰老机制，将益生菌作为抗衰老产品的 前景将十分广阔。

唾液乳杆菌是人体和动物体内广泛存在的乳杆菌。在人体的口腔、母乳、 妇女阴道中都能检出唾液乳杆菌(李少平等,1991;Olivares et al.,2006)。它是 人体的原籍菌，是存在于人体的正常菌群之一；除人体外，从鸡、猪、家兔 等肠道中也分离到唾液乳杆菌(陈桂银,2006;唐晓丽,2007;罗睿,2011)。而 且唾液乳杆菌不属于常见的致病菌，很少有唾液乳杆菌引发疾病的报道，因 此很多研究都将筛选得到的唾液乳杆菌菌株进行功能性研究，以期作为人类 和动物的益生菌使用。

发明内容

本发明的目的是提供一种具有延缓衰老功能的唾液乳杆菌。

为了实现上述目的，一方面，本发明提供了一种唾液乳杆菌 （Lactobacillus salivarius），其特征在于，所述唾液乳杆菌的保藏编号为 CGMCC No.6288。

第二方面，本发明提供了一种制备功能食品组合物的方法，所述方法包 括：将如上所述的唾液乳杆菌的活菌体灭活，得到菌体物质。

第三方面，本发明提供了一种由如上所述的方法制备的功能食品组合 物。

第四方面，本发明提供了一种功能食品组合物，其特征在于，所述功能 食品组合物含有如上所述的唾液乳杆菌的活菌体。

第五方面，本发明提供了如上所述的唾液乳杆菌在制备延缓衰老的功能 食品组合物中的应用。

本发明提供的唾液乳杆菌的活菌体及灭活后的菌体物质均具有延缓衰 老的功效。

本发明的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。

生物保藏

本发明的唾液乳杆菌（Lactobacillus salivarius），于2012年6月25日 被保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（地址：北京市朝 阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101） （保藏单位的缩写为CGMCC），保藏编号为CGMCC No.6288。

具体实施方式

以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描 述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。

一方面，本发明提供了一种唾液乳杆菌（Lactobacillus salivarius），该唾 液乳杆菌的保藏编号为CGMCC No.6288。

本发明的唾液乳杆菌分离自广西巴马县长寿老人的粪便。

本发明提供的唾液乳杆菌经过培养能够产生大量唾液乳杆菌的活菌体， 所述培养的方法没有特别的要求，只要是能使所述唾液乳杆菌增殖即可，例 如可以将10⁷量级的菌株接种于乳杆菌培养基，并且在厌氧或好氧条件下， 在15-38℃的温度下培养8-72小时后，得到培养液。所述乳杆菌培养基可以 为公知的各种适合乳杆菌培养的培养基，例如可以为乳汁和/或《乳酸菌—— 生物学基础及应用》（杨洁彬，轻工业出版社，1996年出版）中所述的乳酸 菌（MRS）培养基。

本发明可以进一步分离上述培养液中的唾液乳杆菌的活菌体，所述分离 的方法没有特别的限制，只要是能从培养液中富集菌体即可，例如可以通过 离心和/或过滤的方法实现，所述离心和所述过滤的条件可以为公知的条件， 本发明在此不再赘述。

第二方面，本发明提供了一种制备功能食品组合物的方法，所述方法包 括：将如上所述的唾液乳杆菌的活菌体灭活，得到菌体物质。

本发明的发明人在研究中意外发现，在65-85℃下灭活0.5-1.5h后得到 的菌体物质，具有更加显著的延缓衰老的功效。因此，灭活的条件优选包括： 温度为65-85℃，时间为0.5-1.5h。

本发明方法还包括将菌体物质添加到食物中。

根据本发明，尽管将菌体物质添加到食物中，即可实现本发明的目的， 即起到延缓衰老的作用，但优选情况下，以功能食品组合物的总重量为基准， 菌体物质的添加量为10-70重量%，进一步优选为30-50重量%。在上述优 选情况下，功能食品组合物的延缓衰老的作用更显著。

本发明中，食物可以是任意类型的食物，例如果汁制品、乳制品、豆制 品等。食物也可以根据食用对象的不同而有所不同。所述功能食品组合物中 还可以含有常规的添加剂，例如香料、矿物质、维生素、稳定剂、增稠剂、 防腐剂等。

第三方面，本发明提供了一种由如上所述的方法制备的功能食品组合 物。

第四方面，本发明提供了一种功能食品组合物，该功能食品组合物含有 如上所述的唾液乳杆菌的活菌体。

根据本发明，尽管功能食品组合物含有如上所述的唾液乳杆菌的活菌 体，即可实现本发明的目的，即起到延缓衰老的作用。但优选情况下，以功 能食品组合物的总重量为基准，唾液乳杆菌的活菌体的含量为 10⁵-10¹⁰CFU/g，进一步优选为10⁷-10⁹CFU/g。在上述优选情况下，功能食品 组合物的延缓衰老的作用更显著。

符合上述要求的功能食品组合物可以包括唾液乳杆菌的培养液（例如经 该唾液乳杆菌发酵制得的发酵乳制品）、分离的唾液乳杆菌的活菌体等。

本发明中，功能食品组合物还含有食物，食物如前所述，在此不再赘述。

第五方面，本发明提供了如上所述的唾液乳杆菌在制备延缓衰老的功能 食品组合物中的应用。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实 施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方 案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特 征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必 要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其 不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

实施例

以下的实施例将对本发明作进一步的说明，但并不因此限制本发明。

（一）采用线虫作为受试对象

线虫是在发育、凋亡、衰老领域研究最为清晰的模式生物，其生命周期 短，并且对外界环境敏感，而且由于衰老信号的同源性高，低等生物的研究 对哺乳动物及人体衰老有直接的参考(Greer and Brunet,2008)。因此，在以下 实施例和对比例中采用线虫作为受试对象。

在下述实施例和对比例中：

线虫为秀丽隐杆线虫虫株，野生型Caenorhabditis elegans N2，购自美国 线虫遗传学中心（Caenorhabditis Genetics Center（CGC））。

菌种：线虫标准食物大肠杆菌（E.coli）OP50，购自美国线虫遗传学中 心；唾液乳杆菌A为本发明的唾液乳杆菌（该菌株于2012年6月25日被 保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（地址：北京市朝 阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101） （保藏单位的缩写为CGMCC），保藏编号为CGMCC No.6288）。

线虫基本操作方法参考Wormbook标准线虫培养方法进行。

1M磷酸钾缓冲液（pH 6.0）：108.3g KH₂PO₄，46.8g K₂HPO₄·3H₂O， 蒸馏水定容至1L，121℃灭菌15min备用。

NGM培养基：3.0g NaCl，20g琼脂粉，2.5g细菌蛋白胨，加入蒸馏水 970mL，121℃灭菌15min，置于60℃水浴，无菌条件下加入以下成分：1 mL 1M MgSO₄，1mL 1M CaCl₂，25mL 1M磷酸钾缓冲液，3.2mL 5mg/mL 胆固醇的乙醇溶液；混匀后，倾倒平板。待平板凝固后，置于室温2天， 挥发水分及检查平板无杂菌污染后置于4℃密封箱内保存备用。

mNGM培养基：NGM培养基倾注平板之前在无菌条件下加入经过滤除 菌的FUdR、羧苄青霉素至终浓度分别为50μM、0.5mM，混匀倾注平板， 凝固后置于室温2天挥发水分，之后平板可涂菌使用或置于4℃密封箱内保 存，于1个月内使用完毕。

M9缓冲液：3g KH₂PO₄，15.12g Na₂HPO₄·12H₂O，5g NaCl，加蒸馏水 定容至1L，121℃灭菌15min，冷却至室温后无菌加入1mL 1M MgSO₄， 混匀备用。

线虫裂解液：1mL 8M NaOH，0.6mL 9%次氯酸钠溶液，3.4mL无菌 ddH₂O，混匀后使用，现用现配。

LB培养基：胰蛋白胨10g，酵母浸粉5g，NaCl 10g（固体培养基加 入15g琼脂），加入950mL蒸馏水，调节pH至7.0，121℃灭菌15min备 用。

MRS培养基：购于北京陆桥公司。

实施例1.1

本实施例用于说明本发明的唾液乳杆菌延缓衰老的功效。

（1）将大肠杆菌OP50以1%的接种量接种至LB液体培养基，于恒温 摇床37℃220rpm振荡培养8h至对数末期，得到大肠杆菌OP50培养液； 将唾液乳杆菌A以1%的接种量接种至MRS液体培养基，于充氮厌氧瓶37℃ 培养12h至对数末期，得到唾液乳杆菌A培养液。

分别将上述大肠杆菌OP50和唾液乳杆菌A的培养液，以4000×g离心 15min收集菌体，用M9缓冲液重复离心洗涤两次，之后4℃16000×g离心 15min，去掉全部上清液，称量菌体湿重。将菌体以一定量M9重悬，使菌 体终浓度为400mg/mL，分装于1.5mL离心管，作为浓缩菌体。

分别将上述两种浓缩菌体75℃热灭活1h，冷却后将大肠杆菌OP50和 唾液乳杆菌A按3:2的重量比（即唾液乳杆菌为40重量%）混合得到混合 物，将混合物按照400mg/mL的比例悬浮于M9缓冲液中，涂布于直径60mm 的mNGM平板表面，使每平板菌体量为10mg，共6块平板，4℃密封保存 备用。

（2）在直径90mm NGM培养基表面，均匀涂布200μL大肠杆菌OP50 培养液，37℃培养10h，作为线虫传代用平板，4℃密封保存备用。

在无菌条件下，用手术刀从生长有线虫的NGM平板上切取约1cm×1 cm的小块培养基，正面向下扣在线虫传代用平板上，置于25℃培养，60mm 平皿一般7天传代一次，保持线虫活性。

取传代后成虫大多处于产卵期的平板用于线虫同期化：

向平板中加入2mL M9缓冲液，用无菌吸管吹打，尽量冲下平板上的虫 体，将虫体转移至1.5mL离心管，800×g离心1min，弃上清收集虫体，加 入1mL M9再次离心洗涤虫体，尽量吸尽上清。

加入1mL新鲜的线虫裂解液，立刻漩涡振荡10s，800×g离心1min， 移液器吸走上清。

立刻加入1mL M9洗涤虫体，800×g离心1min，连续两次，去除残留 裂解液。最后管内剩余约100μL含有虫卵的M9悬浊液。

使用无菌吸管将虫卵滴加于涂布OP50的NGM平板，25℃培养48h， 得到同期化48h的线虫。

（3）将同期化48h的线虫，置于体视显微镜观察，使用铂金铲挑取生 殖口为透明半月形的L4期雌雄同体虫于步骤（1）得到的mNGM平板上， 每块平板挑取10只，平板置于25℃培养。每天观察线虫生存状况，如虫体 对铂金铲轻触没有活动反应则认为虫体死亡。排除失踪、体内孵化及非自然 死亡线虫。全部线虫死亡则实验结束。计算线虫平均寿命见表1。

实施例1.2

本实施例用于说明本发明的唾液乳杆菌延缓衰老的功效。

（1）将大肠杆菌OP50以1%的接种量接种至LB液体培养基，于恒温 摇床37℃220rpm振荡培养8h至对数末期，得到大肠杆菌OP50培养液； 将唾液乳杆菌A以1%的接种量接种至MRS液体培养基，于充氮厌氧瓶37℃ 培养12h至对数末期，得到唾液乳杆菌A培养液。

分别将上述大肠杆菌OP50和唾液乳杆菌A的培养液，以4000×g离心 15min收集菌体，用M9缓冲液重复离心洗涤两次，之后4℃ 16000×g离心 15min，去掉全部上清液，称量菌体湿重。将菌体以一定量M9重悬，使菌 体终浓度为400mg/mL，分装于1.5mL离心管，作为浓缩菌体。

分别将上述两种浓缩菌体65℃热灭活1.5h，冷却后将大肠杆菌OP50和 唾液乳杆菌A按7:3的重量比（即唾液乳杆菌为30重量%）混合得到混合 物，将混合物按照400mg/mL的比例悬浮于M9缓冲液中，涂布于直径60mm 的mNGM平板表面，使每平板菌体量为10mg，共6块平板，4℃密封保存 备用。

（2）在直径90mm NGM培养基表面，均匀涂布200μL大肠杆菌OP50 培养液，37℃培养10h，作为线虫传代用平板，4℃密封保存备用。

在无菌条件下，用手术刀从生长有线虫的NGM平板上切取约1cm×1 cm的小块培养基，正面向下扣在线虫传代用平板上，置于25℃培养，60mm 平皿一般7天传代一次，保持线虫活性。

取传代后成虫大多处于产卵期的平板用于线虫同期化：

向平板中加入2mL M9缓冲液，用无菌吸管吹打，尽量冲下平板上的虫 体，将虫体转移至1.5mL离心管，800×g离心1min，弃上清收集虫体，加 入1mL M9再次离心洗涤虫体，尽量吸尽上清。

加入1mL新鲜的线虫裂解液，立刻漩涡振荡10s，800×g离心1min， 移液器吸走上清。

立刻加入1mL M9洗涤虫体，800×g离心1min，连续两次，去除残留 裂解液。最后管内剩余约100μL含有虫卵的M9悬浊液。

使用无菌吸管将虫卵滴加于涂布OP50的NGM平板，25℃培养48h， 得到同期化48h的线虫。

（3）将同期化48h的线虫，置于体视显微镜观察，使用铂金铲挑取生 殖口为透明半月形的L4期雌雄同体虫于步骤（1）得到的mNGM平板上， 每块平板挑取10只，平板置于25℃培养。每天观察线虫生存状况，如虫体 对铂金铲轻触没有活动反应则认为虫体死亡。排除失踪、体内孵化及非自然 死亡线虫。全部线虫死亡则实验结束。计算线虫平均寿命见表1。

实施例1.3

本实施例用于说明本发明的唾液乳杆菌延缓衰老的功效。

（1）将大肠杆菌OP50以1%的接种量接种至LB液体培养基，于恒温 摇床37℃ 220rpm振荡培养8h至对数末期，得到大肠杆菌OP50培养液； 将唾液乳杆菌A以1%的接种量接种至MRS液体培养基，于充氮厌氧瓶37℃ 培养12h至对数末期，得到唾液乳杆菌A培养液。

分别将上述大肠杆菌OP50和唾液乳杆菌A的培养液，以4000×g离心 15min收集菌体，用M9缓冲液重复离心洗涤两次，之后4℃ 16000×g离心 15min，去掉全部上清液，称量菌体湿重。将菌体以一定量M9重悬，使菌 体终浓度为400mg/mL，分装于1.5mL离心管，作为浓缩菌体。

分别将上述两种浓缩菌体85℃热灭活0.5h，冷却后将大肠杆菌OP50和 唾液乳杆菌A按1:1的重量比（即唾液乳杆菌为50重量%）混合得到混合 物，将混合物按照400mg/mL的比例悬浮于M9缓冲液中，涂布于直径60mm 的mNGM平板表面，使每平板菌体量为10mg，共6块平板，4℃密封保存 备用。

（2）在直径90mm NGM培养基表面，均匀涂布200μL大肠杆菌OP50 培养液，37℃培养10h，作为线虫传代用平板，4℃密封保存备用。

在无菌条件下，用手术刀从生长有线虫的NGM平板上切取约1cm×1 cm的小块培养基，正面向下扣在线虫传代用平板上，置于25℃培养，60mm 平皿一般7天传代一次，保持线虫活性。

取传代后成虫大多处于产卵期的平板用于线虫同期化：

向平板中加入2mL M9缓冲液，用无菌吸管吹打，尽量冲下平板上的虫 体，将虫体转移至1.5mL离心管，800×g离心1min，弃上清收集虫体，加 入1mL M9再次离心洗涤虫体，尽量吸尽上清。

加入1mL新鲜的线虫裂解液，立刻漩涡振荡10s，800×g离心1min， 移液器吸走上清。

立刻加入1mL M9洗涤虫体，800×g离心1min，连续两次，去除残留 裂解液。最后管内剩余约100μL含有虫卵的M9悬浊液。

使用无菌吸管将虫卵滴加于涂布OP50的NGM平板，25℃培养48h， 得到同期化48h的线虫。

（3）将同期化48h的线虫，置于体视显微镜观察，使用铂金铲挑取生 殖口为透明半月形的L4期雌雄同体虫于步骤（1）得到的mNGM平板上， 每块平板挑取10只，平板置于25℃培养。每天观察线虫生存状况，如虫体 对铂金铲轻触没有活动反应则认为虫体死亡。排除失踪、体内孵化及非自然 死亡线虫。全部线虫死亡则实验结束。计算线虫平均寿命见表1。

实施例1.4

本实施例用于说明本发明的唾液乳杆菌延缓衰老的功效。

按照实施例1.1的方法进行线虫寿命试验，不同的是，步骤（1）中，灭 活冷却后将大肠杆菌OP50和唾液乳杆菌A按3:7的重量比（即唾液乳杆菌 为70重量%）混合。计算线虫平均寿命见表1。

实施例1.5

本实施例用于说明本发明的唾液乳杆菌延缓衰老的功效。

按照实施例1.1的方法进行线虫寿命试验，不同的是，步骤（1）中，灭 活冷却后将大肠杆菌OP50和唾液乳杆菌A按9:1的重量比（即唾液乳杆菌 为10重量%）混合。计算线虫平均寿命见表1。

实施例1.6

本实施例用于说明本发明的唾液乳杆菌延缓衰老的功效。

按照实施例1.1的方法进行线虫寿命试验，不同的是，灭活温度为90℃， 灭活时间为0.3h。计算线虫平均寿命见表1。

实施例1.7

本实施例用于说明本发明的唾液乳杆菌延缓衰老的功效。

按照实施例1.1的方法进行线虫寿命试验，不同的是，灭活温度为60℃， 灭活时间为2.0h。计算线虫平均寿命见表1。

对比例1.1

按照实施例1.1的方法进行线虫寿命试验，不同的是，用CN 101538545A 公开的菌株替代唾液乳杆菌A。计算线虫平均寿命见表1。

对比例1.2

按照实施例1.1的方法进行线虫寿命试验，不同的是，灭活冷却后将大 肠杆菌OP50按照400mg/mL的比例悬浮于M9缓冲液中，涂布于mNGM平 板表面，即，mNGM平板表面仅涂布灭活冷却后的大肠杆菌OP50。计算线 虫平均寿命见表1。

表1

  线虫平均寿命（天）   实施例1.1   24.1±0.4   实施例1.2   23.1±0.6   实施例1.3   24.3±0.5   实施例1.4   18.9±0.4   实施例1.5   18.7±0.9   实施例1.6   19.1±0.2   实施例1.7   20.0±0.3   对比例1.1   17.8±0.2   对比例1.2   17.2±1.0

将实施例1.1分别与对比例1.1和对比例1.2进行比较可以看出，本发明 的唾液乳杆菌具有延缓衰老的功效，灭活后用于饲喂线虫，可以显著延长线 虫的寿命。

将实施例1.1分别与实施例1.4和实施例1.5进行比较可以看出，灭活冷 却后将大肠杆菌OP50和唾液乳杆菌A混合，以混合物的总重量为基准，唾 液乳杆菌A的添加量为30-50重量%，可以更加显著延长线虫的寿命；将实 施例1.1分别与实施例1.6和实施例1.7进行比较可以看出，在65-85℃灭活 0.5-1.5h，更有利于延长线虫的寿命。

（二）采用小鼠作为受试对象

在下述实施例和对比例中：

昆明种雄性小鼠：购自北京维通利华公司，体重20±2g。

唾液乳杆菌A为本发明的唾液乳杆菌（该菌株于2012年6月25日被保 藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（地址：北京市朝阳区 北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101）（保 藏单位的缩写为CGMCC），保藏编号为CGMCC No.6288）。

MRS培养基：购于北京陆桥公司。

考马斯亮蓝G250：购于上海沪宇生物有限公司。

肝脂褐质含量、脑MAO-B活性、脑SOD活性和脑Na⁺/K⁺-ATP酶活性 的测定参见《水溶性山药多糖对小鼠的抗衰老作用》（詹彤，陶靖，王淑如， 药学进展，1999年23卷第6期）：

肝脂褐质含量测定：取肝脏，用氯仿-甲醇混合液制成5%匀浆液，40℃ 温水浴5分钟，以3000rpm离心10分钟，取上清液测荧光，发射波长为 435nm，激发波长为365nm，置灵敏度×1，狭缝10nm，用0.1μg/mL的硫酸 奎宁调节仪器荧光强度为50。

脑MAO-B（B型单胺氧化酶）活性测定：取脑组织，加入冰冷的0.2mol/L pH7.4的磷酸缓冲液（0.1mol/L K₂HPO₄80.2ml与0.1mol/L KH₂PO₄19.8ml 混合），超声匀浆2次，于4℃以3000rpm离心10分钟，沉淀悬浮在PBS 液(pH7.4)中，随即水浴振荡混匀，以3000rpm离心10分钟,将环乙烷层 于242nm处测吸光值，粗酶液蛋白浓度用考马斯亮蓝G250测定，以小牛血 清白蛋白作标准蛋白，酶活力单位定义为37℃产生0.01/3h的光密度改变的 酶量。

脑SOD（超氧化物歧化酶）活性测定：取脑组织，组织样品测定采用南 京铁道医学院病生教研组的SOD超微量快速测定试剂，酶活性以U/mg酶量 来表示，计算公式：[(对照管光密度-测定管光密度)/对照管光密度]/50/100× 样品稀释度/样品蛋白浓度。样品蛋白浓度用考马斯亮蓝G250来测定,小牛 血清作标准蛋白。

脑Na⁺/K⁺-ATP酶活性测定：取脑组织0.1g，迅速加入1ml提取液（内 含蔗糖250mmol/L、组氨酸30mmol/L、EDTA 5mmol/L、去氧皮质酮10重 量%。冰浴匀浆，三层纱布过滤，得粗酶液，蛋白浓度用考马斯亮蓝G250 测定。酶促反应分为二组：A组，加0.4mL的介质ATP液（MgCl₂ 6mmol/L、 NaCl 100mmol/L、KCl 20mmol/L、Tris 30mmol/L、ATP 3mmol/L）。50μL介 质液（MgCl₂ 6mmol/L、NaCl 100mmol/L、KCl 20mmol/L、Tris 30mmol/L） 和粗酶液50μL；B组，加Quabain抑制Na⁺/K⁺-ATP酶，用50μL的5mmol/L  Quabain取代50μL介质液，其余相同。在37℃水浴中分别反应20分钟，加 入30%冰冷三氯乙酸0.3mL，移入冰浴中，以1500rpm离心5分钟，取上清 液0.5ml，测其无机磷含量。步骤为：取0.5mL测定液，加2mL显色剂（1 体积10%钼酸铵+9体积新鲜配制的9.15%的FeSO₄·7H₂O）和2mL蒸馏水 混匀，25℃反应8分钟,于652nm处测吸光值，用标准磷溶液作标准曲线， 求得无机磷含量，最后Na⁺/K⁺-ATP酶所分解的无机磷含量为A组-B组的量。 酶活性表示为μmol pi/h·rmg蛋白，蛋白浓度用考马斯亮蓝G250测定，小 牛血清作标准蛋白。

实施例2.1

本实施例用于说明本发明的唾液乳杆菌延缓衰老的功效。

（1）将唾液乳杆菌A用无菌接种环接种于10L的MRS培养基，并且 在厌氧条件下，在37℃的温度下培养12小时后，得到培养液。将得到的培 养液在4000×g的速度下离心10分钟后弃去上清，得到唾液乳杆菌A的活菌 体。

（2）随即选取15只昆明种雄性小鼠，每天眼球后注射D-半乳糖 0.12mg/g，并饲喂含1×10⁹CFU/g的唾液乳杆菌A的活菌体的饮用水，连续 一个月。测昆明种雄性小鼠的肝脂褐质含量、脑MAO-B活性、脑SOD活 性以及脑Na⁺/K⁺-ATP酶活性，结果见表2。

实施例2.2

本实施例用于说明本发明的唾液乳杆菌延缓衰老的功效。

（1）将唾液乳杆菌A用无菌接种环接种于10L的MRS培养基，并且 在厌氧条件下，在37℃的温度下培养12小时后，得到培养液。将得到的培 养液在4000×g的速度下离心10分钟后弃去上清，得到唾液乳杆菌A的活菌 体。

（2）随即选取15只昆明种雄性小鼠，每天眼球后注射D-半乳糖 0.12mg/g，并饲喂含1×10⁸CFU/g的唾液乳杆菌A的活菌体的饮用水，连续 一个月。测昆明种雄性小鼠的肝脂褐质含量、脑MAO-B活性、脑SOD活 性以及脑Na⁺/K⁺-ATP酶活性，结果见表2。

实施例2.3

本实施例用于说明本发明的唾液乳杆菌延缓衰老的功效。

（1）将唾液乳杆菌A用无菌接种环接种于10L的MRS培养基，并且 在厌氧条件下，在37℃的温度下培养12小时后，得到培养液。将得到的培 养液在4000×g的速度下离心10分钟后弃去上清，得到唾液乳杆菌A的活菌 体。

（2）随即选取15只昆明种雄性小鼠，每天眼球后注射D-半乳糖 0.12mg/g，并饲喂含1×10⁷CFU/g的唾液乳杆菌A的活菌体的饮用水，连续 一个月。测昆明种雄性小鼠的肝脂褐质含量、脑MAO-B活性、脑SOD活 性以及脑Na⁺/K⁺-ATP酶活性，结果见表2。

实施例2.4

本实施例用于说明本发明的唾液乳杆菌延缓衰老的功效。

按照实施例2.1的方法进行实验，不同的是，饮用水中唾液乳杆菌A的 活菌体的含量为1×10¹⁰CFU/g。测昆明种雄性小鼠的肝脂褐质含量、脑 MAO-B活性、脑SOD活性以及脑Na⁺/K⁺-ATP酶活性，结果见表2。

实施例2.5

本实施例用于说明本发明的唾液乳杆菌延缓衰老的功效。

按照实施例2.1的方法进行实验，不同的是，饮用水中唾液乳杆菌A的 活菌体的含量为1×10⁵CFU/g。测昆明种雄性小鼠的肝脂褐质含量、脑MAO-B 活性、脑SOD活性以及脑Na⁺/K⁺-ATP酶活性，结果见表2。

实施例2.6

本实施例用于说明本发明的唾液乳杆菌延缓衰老的功效。

按照实施例2.1的方法进行实验，不同的是，将步骤（1）得到唾液乳杆 菌A的活菌体在75℃下热灭活1h，得到菌体物质，将该菌体物质加入到饮 用水中而不加入活菌体，饮用水中菌体物质的含量为40重量%。测昆明种 雄性小鼠的肝脂褐质含量、脑MAO-B活性、脑SOD活性以及脑Na⁺/K⁺-ATP 酶活性，结果见表2。

实施例2.7

本实施例用于说明本发明的唾液乳杆菌延缓衰老的功效。

按照实施例2.1的方法进行实验，不同的是，将步骤（1）得到唾液乳杆 菌A的活菌体在65℃下热灭活1.5h，得到菌体物质，将该菌体物质加入到 饮用水中而不加入活菌体，饮用水中菌体物质的含量为50重量%。测昆明 种雄性小鼠的肝脂褐质含量、脑MAO-B活性、脑SOD活性以及脑 Na⁺/K⁺-ATP酶活性，结果见表2。

实施例2.8

本实施例用于说明本发明的唾液乳杆菌延缓衰老的功效。

按照实施例2.1的方法进行实验，不同的是，将步骤（1）得到唾液乳杆 菌A的活菌体在85℃下热灭活0.5h，得到菌体物质，将该菌体物质加入到 饮用水中而不加入活菌体，饮用水中菌体物质的含量为30重量%。测昆明 种雄性小鼠的肝脂褐质含量、脑MAO-B活性、脑SOD活性以及脑 Na⁺/K⁺-ATP酶活性，结果见表2。

实施例2.9

本实施例用于说明本发明的唾液乳杆菌延缓衰老的功效。

按照实施例2.6的方法进行实验，不同的是，饮用水中菌体物质的含量 为65重量%。测昆明种雄性小鼠的肝脂褐质含量、脑MAO-B活性、脑SOD 活性以及脑Na⁺/K⁺-ATP酶活性，结果见表2。

实施例2.10

本实施例用于说明本发明的唾液乳杆菌延缓衰老的功效。

按照实施例2.6的方法进行实验，不同的是，饮用水中菌体物质的含量 为15重量%。测昆明种雄性小鼠的肝脂褐质含量、脑MAO-B活性、脑SOD 活性以及脑Na⁺/K⁺-ATP酶活性，结果见表2。

实施例2.11

本实施例用于说明本发明的唾液乳杆菌延缓衰老的功效。

按照实施例2.6的方法进行试验，不同的是，灭活温度为90℃，灭活时 间为0.3h。测昆明种雄性小鼠的肝脂褐质含量、脑MAO-B活性、脑SOD 活性以及脑Na⁺/K⁺-ATP酶活性，结果见表2。

实施例2.12

本实施例用于说明本发明的唾液乳杆菌延缓衰老的功效。

按照实施例2.6的方法进行试验，不同的是，灭活温度为60℃，灭活时 间为2.0h。测昆明种雄性小鼠的肝脂褐质含量、脑MAO-B活性、脑SOD 活性以及脑Na⁺/K⁺-ATP酶活性，结果见表2。

对比例2.1

按照实施例2.1的方法进行实验，不同的是，用CN 101538545A公开的 菌株替代唾液乳杆菌A。测昆明种雄性小鼠的肝脂褐质含量、脑MAO-B活 性、脑SOD活性以及脑Na⁺/K⁺-ATP酶活性，结果见表2。

对比例2.2

按照实施例2.6的方法进行实验，不同的是，用CN 101538545A公开的 菌株替代唾液乳杆菌A。测昆明种雄性小鼠的肝脂褐质含量、脑MAO-B活 性、脑SOD活性以及脑Na⁺/K⁺-ATP酶活性，结果见表2。

对比例2.3

按照实施例2.1的方法进行实验，不同的是，饮用水中不加入菌种。测 昆明种雄性小鼠的肝脂褐质含量、脑MAO-B活性、脑SOD活性以及脑 Na⁺/K⁺-ATP酶活性，结果见表2。

对比例2.4

按照实施例2.1的方法进行实验，不同的是，不注射D-半乳糖，饮用水 中不加入菌种。测昆明种雄性小鼠的肝脂褐质含量、脑MAO-B活性、脑SOD 活性以及脑Na⁺/K⁺-ATP酶活性，结果见表2。

表2

代谢过程中产生的自由基能作用于生物膜磷脂中的多不饱和脂肪酸，产 生脂质过氧化物，如丙二醛(MDA)，进而与磷脂酰乙醇胺和蛋白质交联成大 分子复合物-脂褐质（老年色素），这是机体老化的一种标志。

人脑中MAO-B活性在45岁后随年龄增长而增加，Fowier发现人脑19 区域的MAO-B活性与年龄呈正相关，脑组织内MAO-B随年龄的变化可引 起脑内儿茶酚胺含量紊乱，促使生理活动失调，从而导致衰老发生。

SOD是一类重要的体内氧自由基清除酶，但是随年龄增长，机体组织内 的SOD活性逐渐减低。

Na⁺/K⁺-ATP酶又称钠钾泵，是生物体内广泛存在的一种极为重要的膜 酶，该酶在维持生理活动、体温及正常代谢和细胞膜内外离子平衡中起着重 要作用。生物衰老时，会出现多种生物化学的变化，其中脑细胞功能的变化 较明显，这可能与脑细胞能量降低有关。有报道，老龄大鼠的一些组织中其 Na⁺/K⁺-ATP酶活性较年轻鼠有所降低。

将对比例2.3与对比例2.4进行比较可以看出，在小鼠眼球后注射D-半 乳糖，可加速小鼠的衰老。将实施例2.1至实施例2.12与对比例2.3进行比 较可以看出，本发明的唾液乳杆菌具有延缓衰老的功效；将实施例2.1与对 比例2.1进行比较，将实施例2.6与对比例2.2进行比较可以看出，本发明的 唾液乳杆菌比CN 101538545A公开的菌株具有更加显著的延缓衰老的功效。

将实施例2.1分别与实施例2.4和实施例2.5进行比较可以看出，饮用水 中唾液乳杆菌的活菌体的含量为10⁷-10⁹CFU/g，更有利于延缓衰老；将实施 例2.6分别与实施例2.9和实施例2.10进行比较可以看出，饮用水中唾液乳 杆菌的活菌体灭活后得到的菌体物质的含量为30-50重量%，更有利于延缓 衰老；将实施例2.6分别与实施例2.11和实施例2.12进行比较可以看出，在 65-85℃灭活0.5-1.5h，更有利于延缓衰老。

本发明提供的唾液乳杆菌的活菌体及灭活后的菌体物质均具有延缓衰 老的功效。