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2020-06-23
专利权人的姓名或者名称、地址的变更 IPC(主分类):C12N15/11 变更前: 变更后: 申请日:20130918
专利权人的姓名或者名称、地址的变更
2019-11-08
专利实施许可合同备案的注销 IPC(主分类):C12N15/11 合同备案号:2017320000171 让与人:南京世和基因生物技术有限公司 受让人:朱明赴 解除日:20191015 申请日:20130918
专利实施许可合同备案的生效、变更及注销
2017-09-08
专利实施许可合同备案的生效 IPC(主分类):C12N15/11 合同备案号:2017320000172 让与人:南京世和基因生物技术有限公司 受让人:刘思思 发明名称:用于与KRAS基因杂交的DNA探针库及采用其富集KRAS基因片段的方法 申请公布日:20140326 授权公告日:20150930 许可种类:普通许可 备案日期:20170817 申请日:20130918
专利实施许可合同备案的生效、变更及注销
2017-09-05
专利实施许可合同备案的生效 IPC(主分类):C12N15/11 合同备案号:2017320000166 让与人:南京世和基因生物技术有限公司 受让人:刘一川 发明名称:用于与KRAS基因杂交的DNA探针库及采用其富集KRAS基因片段的方法 申请公布日:20140326 授权公告日:20150930 许可种类:普通许可 备案日期:20170814 申请日:20130918
专利实施许可合同备案的生效、变更及注销
2017-07-07
专利实施许可合同备案的生效 IPC(主分类):C12N15/11 合同备案号:2017320000151 让与人:南京世和基因生物技术有限公司 受让人:南京高新精准医学科技有限公司 发明名称:用于与KRAS基因杂交的DNA探针库及采用其富集KRAS基因片段的方法 申请公布日:20140326 授权公告日:20150930 许可种类:普通许可 备案日期:20170613 申请日:20130918
专利实施许可合同备案的生效、变更及注销
2016-11-23
专利实施许可合同备案的生效 IPC(主分类):C12N15/11 合同备案号:2016320000197 让与人:南京世和基因生物技术有限公司 受让人:南京世和医疗器械有限公司 发明名称:用于与KRAS基因杂交的DNA探针库及采用其富集KRAS基因片段的方法 申请公布日:20140326 授权公告日:20150930 许可种类:普通许可 备案日期:20161019 申请日:20130918
专利实施许可合同备案的生效、变更及注销
2015-09-30
授权
授权
2014-09-24
专利申请权的转移 IPC(主分类):C12N15/11 变更前: 变更后: 登记生效日:20140903 申请日:20130918
专利申请权、专利权的转移
2014-04-23
实质审查的生效 IPC(主分类):C12N15/11 申请日:20130918
实质审查的生效
2014-03-26
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技术领域
本发明涉及基因检测领域,具体而言,本发明涉及一种KRAS基因的富集和提取方法,所述方法可以精准地富集KRAS基因,进而可以选择性地进行KRAS基因结构突变的检测。
背景技术
DNA测序技术正处在天翻地覆的剧变中,其突出特点为同时对众多的位点进行观察分析(大规模平行),从而逐步实现测序通量的大幅增长,原始数据中每个碱基的测序成本的急剧下跌。基于此,以前高不可攀的奢侈性活动(如个人基因测序、宏基因组学研究),逐渐变得越来越切实可行。特别是随着科学的发展,由于传统的Sanger测序已经不能完全满足研究的需要,下一代测序技术(第二代测序技术,Next-generation sequencing)应运而生。
下一代测序技术是同步化三磷酸核苷酸的洗脱方法和同步化的光学检测方法的结合。例如采用以鲁米那(Illumina)提供的仪器,以短的连续性的片段序列和测序阅读长度的形式,每周输出数亿以计的碱基的DNA序列。这是一种由DNA连接酶和聚合酶主导化学过程的第二代测序方法,DNA序列将会用生物信息学的方法拼接还原。在成本方面,下一代测序技术比第一代测序技术大体上降低了1000倍,并且还正以指数级的速度下降。目前下一代测序技术已经广泛应用于全基因组测序,但是在其它基因分析领域,例如特定基因结构突变的检测等方面尚未得到充分开发。
基因检测是利用血液、其他体液或细胞对核酸进行检测的技术,其通过特定设备对被检测者核酸分子信息作检测,分析它所含有的各种基因情况,从而使人们能了解自己的基因信息,判断身体患有疾病的情况或风险,从而可适应性地选择疾病治疗方案,甚至预防疾病的发生。
现有的基因突变检测方法还主要集中于以下3个技术:
1)PCR突变检测
基于PCR片段扩增和凝胶电泳分离的方法,从而分辨出野生型和突变性的差异。其缺点包括:其为单碱基突变类型检测,不能对mRNA进行定量,不能检测基因颠换;敏感性低;耗时长,单次只能检测一个基因突变;不能确定碱基的具体变化;无法进行高通量检测。
2)Q-PCR(定量PCR)检测
基于荧光和PCR片段扩增来对模板mRNA多少来进行定量。其缺点包括:不能检测单碱基类型突变;不能检测基因颠换;只能检测已知突变;耗时长,单次只能检测一个基因突变;不能确定碱基的具体变化。
3)基因芯片技术
用高精度技术将DNA片段打印在芯片上,然后通过DNA杂交结合特性来确定突变性质。其缺点包括:不能检测基因颠换;只能检测已知突变;成本高,通量较小;准确率低,通常需要重复2次以上才能确定结果。
因此可知,目前在基因检测技术方面尚缺少更为全面、快速、简便、准确的检测方法,特别是在目前拥有下一代测序技术这种以高通量、低成本基因测序为特点的技术的情况下,如何基于下一代测序技术开发新型基因检测和筛查技术,是本领域研究人员广泛关注的问题。并且,如果应用下一代测序技术来检测基因的结构突变情况,如何获得能够满足下一代测序技术要求的基因检测样本,也是期待解决的一个技术问题。
RAS基因家族的基因有三种:分别定位在11、12和1号染色体上的HRAS、KRAS和NRAS。其中,KRAS突变比例最大,起开关作用,当正常时能调控细胞生长通路;发生异常时,则阻止细胞自我毁灭,并导致细胞的生长,增殖,和血管生成的过程。而且,由于KRAS在EGFR下游,KRAS变异细胞不受上游EGFR的信号影响,所以对抗EGFR治疗效果差。
KRAS基因突变常见于大肠癌,胰腺癌,非小细胞肺癌,子宫内膜癌和胆道癌。其中在胰腺癌中,KRAS基因的点突变发生率高达90%以上。KRAS基因的检测不仅可以深入了解具体KRAS基因变异的情况,更重要的是能够预测对于抗EGFR靶向治疗药物的反应。大量研究资料证实,KRAS基因突变状态与针对EGFR的药物的疗效有关,因此应用抗EGFR的药物时应该检测KRAS基因的突变状态。KRAS基因突变一般发生在早期,而且KRAS基因型一般不会再次产生变化。
检测KRAS基因突变,对判断肿瘤的发生发展均有重要意义:正常人血 检出现KRAS基因变异,提示存在肿瘤易感性;良性肿瘤患者若带有KRAS基因突变,提示有恶变的可能;恶性肿瘤病人若KRAS基因突变阳性,即使病理组织学诊断淋巴结转移阴性,癌症复发的可能性也很高。
发明内容
针对上述技术问题,本发明人通过大量实验,开发了基于杂交选择而捕获KRAS基因序列的方法,采用该方法可以获得成几千倍富集的KRAS基因,该经富集的KRAS基因样本可以选择性地应用于各种基因检测技术,特别是可以应用下一代测序技术进行基因突变、缺失、增加、和颠换等方面的检测。
具体而言,本发明的技术方案如下:
一方面,本发明提供了一种用于与KRAS基因杂交的DNA探针库,所述DNA探针库包括一个或多个能够与KRAS基因杂交的DNA探针,所述DNA探针包含以下序列:
SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、或SEQ ID NO.10;
优选地,所述DNA探针的序列如以下序列所示:
SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、或SEQ ID NO.10。
另一方面,本发明提供一种富集KRAS基因片段的方法,所述方法包括以下步骤:
1)获得受试者的DNA样本库;
2)获得能够与KRAS基因杂交的DNA探针库;
3)使所述DNA探针库与所述DNA样本库进行杂交;和
4)分离步骤3)的杂交产物,然后释放经杂交富集的KRAS基因片段。
其中,所述步骤1)中的DNA样本库由双链DNA片段组成,并且,所述步骤1)包括:
1-1)提取全基因组DNA,然后将其片段化;或者
1-2)提取mRNA,将其片段化,然后以该经片段化的mRNA为模板合成双链cDNA;
其中,所述受试者为哺乳动物,优选人,且从受试者的细胞、组织或体液样本中提取全基因组DNA或mRNA;
优选地,所述DNA片段的长度为150-600bp;
进一步优选地,所述DNA片段的长度为150-200bp。
所述步骤2)中的DNA探针库为如上所述的DNA探针库。具体而言,所述DNA探针库包括一个或多个能够与KRAS基因杂交的DNA探针,所述DNA探针包含以下序列:
SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、或SEQ ID NO.10;
优选地,所述DNA探针的序列如以下序列所示:
SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、或SEQ ID NO.10。
此外,所述步骤3)包括:
3-1)采用选择性标记标记DNA探针库中的DNA探针;和
3-2)使所述DNA探针库与DNA样本库进行杂交;
优选地,所述步骤3-1)中的选择性标记为生物素;进一步优选地,所述步骤3-2)包括在PCR扩增仪中,在65℃下将所述DNA探针库与DNA样本库孵育24小时。
因此,所述方法的步骤4)中,优选利用DNA探针上的选择性标记分离杂交产物。进一步优选地,所述步骤3-1)中的选择性标记为生物素,所述步骤4)中利用链霉亲和素-生物素的亲和作用分离杂交产物。
另一方面,本发明还提供一种检测KRAS基因的基因结构突变的方法,所述方法包括以下步骤:
1)根据上述方法富集KRAS基因片段;和
2)检测所述KRAS基因的基因结构突变。
优选地,所述步骤2)中采用下一代测序技术,通过对富集到的KRAS基因片段进行测序而检测所述KRAS基因的结构突变。
又一方面,本发明提供一种用于富集KRAS基因片段的试剂盒,所述试剂盒包含上述的DNA探针库。具体而言,所述DNA探针库包括一个或多个能够与KRAS基因杂交的DNA探针,所述DNA探针包含以下序列:
SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、或SEQ ID NO.10;
优选地,所述DNA探针的序列如以下序列所示:
SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、或SEQ ID NO.10。
以下是本发明的详细描述:
本发明提供一种富集KRAS基因片段的方法。具体而言,本发明的方法包括:从哺乳动物例如人的细胞、体液或组织样本中提取基因组DNA或mRNA,经处理或合成cDNA,从而获得片段化的双链DNA作为DNA样本库;此外,针对要富集的KRAS基因,设计与该KRAS基因杂交的DNA探针,从中筛选出多个探针作为DNA探针库;然后,将该DNA样本库与DNA探针库进行杂交,从而从DNA样本库中富集得到KRAS基因片段。根据本发明的具体实施方式,可以先将DNA探针库中的各个探针进行生物素化,然后在杂交后用链霉亲和素磁珠吸附杂交产物,再从磁珠上释放出富集的KRAS基因片段。经适应性处理,可以采用下一代测序基因对KRAS基因片段进行基因结构突变的检测,包括单碱基突变、mRNA缺失或增多、mRNA结构颠换、mRNA剪接变化。
下面以富集得到的KRAS基因片段用于基于下一代测序技术的基因结构突变检测为例,示例性地说明本发明,其中总体工艺流程见图1。
一、准备mRNA/DNA样本库
1.准备基因组DNA样本(采用此种方式获得的DNA样本库称为“源自全基因组的DNA样本库”)
1.1DNA提取
DNA提取,包括新鲜组织,新鲜血液和细胞,固定和石蜡样本,商业化公司提取试剂盒。以上均按说明书指示方法操作。
使用分光光度定量仪以及凝胶电泳系统检测DNA模板质量和浓度。dsDNA模板260nm吸光率大于0.05以上,吸光率A260/A280比值在1.8到2之间为合格。
1.2DNA片段化
将3微克高质量的基因组DNA用低TE缓冲液稀释至120微升。按照 组织匀浆机使用说明书,将DNA片段化,片段长度为150-200碱基。
DNA过柱纯化,商业化公司纯化试剂盒。
1.3DNA样本库质量检测
用生物分析仪进行DNA定性定量分析,确认DNA片段长度峰值合理。
2.准备cDNA样本(采用此种方式获得的DNA样本库称为“源自mRNA的DNA样本库”即cDNA样本库)
2.1mRNA提取
mRNA提取,包括新鲜组织,新鲜血液和细胞,固定和石蜡样本,商业化公司提取试剂盒。以上均按说明书指示方法操作。
使用分光光度定量仪以及凝胶电泳系统检测mRNA质量和浓度,吸光率A260/A280比值在1.8到2之间为合格。
2.2mRNA片段化
采用NEBNext RNA Fragmentation系统或者其他商业化公司mRNA片段化试剂盒。
mRNA过柱纯化,商业化公司纯化试剂盒
2.3用商业化公司cDNA合成试剂盒进行mRNA合成第一链以及第二链cDNA。
cDNA过柱纯化,商业化公司纯化试剂盒。
3.cDNA/DNA末端修补
利用T4聚合酶及Klenow大肠杆菌聚合酶片断,对于cDNA/DNA5'突出粘末端补平以及3'突出粘末端打平,产生平末端,用于后续的平端连接。反应在PCR扩增仪中进行,20摄氏度,30分钟。
cDNA/DNA过柱纯化,商业化公司纯化试剂盒。
4.在cDNA/DNA样本3'末端加上碱基A
反应在PCR扩增仪中进行,37℃,30分钟。
cDNA/DNA过柱纯化,商业化公司纯化试剂盒。
5.在cDNA/DNA两端加上接头
cDNA/DNA过柱纯化,商业化公司纯化试剂盒。
如使用mRNA→cDNA,进行6和7;
如果是用基因组DNA,直接跳到8。
6.分离出合适长度的cDNA片段
使用电泳凝胶,对照DNA梯度标准,在凝胶上剪切出150-250碱基cDNA片段。
将含有cDNA样本库的凝胶样本过柱纯化,商业化公司纯化试剂盒。
7.cDNA片段样本库质量检测
使用生物分析仪,进行cDNA定性定量分析,并确认分离出的cDNA片断长度峰值合理。
8.扩增DNA模板
聚合酶链反应(PCR),在PCR扩增仪中进行。
[0093]
PCR条件:臵于PCR扩增仪中,98℃预变性30秒,98℃变性30秒,65℃退火30秒,72℃延伸30秒,共循环15次(cDNA样本库)或者4-6次(DNA样本库)。最后在72℃延伸5分钟。
PCR扩增产物过柱纯化,商业化公司纯化试剂盒。
9.扩增后cDNA/DNA样本库质量检测
使用生物分析仪,进行cDNA/DNA定性定量分析,并确认纯化后片段长度峰值合理,约200bp。
对于得到的cDNA/DNA样本库,如果cDNA小于30纳克/微升,DNA浓度小于150纳克/微升,须将样品经过真空浓缩机低温干燥(低于45℃),再用无核酸酶水溶解至所需浓度。
二、准备DNA探针库
针对KRAS基因准备DNA探针库。
探针设计策略见图2。其中,侧翼序列长度为目标区域外的碱基数,大部分时候属于重复或者内含子区域。探针重叠区域为每个探针之间的重叠碱基数目。重叠区域越大,目标区域覆盖率越高;重叠区域越小,甚至探针间隔分布,测序成本则越低。探针长度越长,测序时对于单核苷酸多态性(SNP)的容忍度越高。
具体探针设计模式包括:探针长度与探针重叠/间隔区域长度固定,侧翼序列长度变化。这种模式能够保证一致覆盖,通过多个探针对单个基因的富集能够保证富集度高,相对脱靶率低。
示例性地,最后将探针长度确定为120个碱基,以保证对SNP的容忍度和对基因颠换的敏感性。通过对primer软件的改进,对设计的探针进行分析,以准确的知道探针的退火温度、GC成分连续重复单基数量(如CCCCCCC)。
首先使用了2倍重叠的方法,对KRAS基因(基于mRNA)进行全程覆盖。通过对探针质量的分析,选择了退火温度在90-100度之间,GC成分大致控制在40%-60%之间,并且连续单基数量较少的探针。同时通过对人类 基因库的检索,保证所选探针的有较小的脱靶率。
经过筛选,共有67个探针符合标准,通过IDT DNA Technologies,单独合成了每一个探针并用质谱分析保证质量,在5’端有生物素(Biotin)。
使用每个探针分别对全基因组进行了富集和扩增,最后采用了29个富集效果明显,脱靶率低的探针。
通过对外显子的分析,在保证基本每个外显子有一个相吻合的探针的情况下,对29个探针进行进一步筛选和优化,最后选定以下10个探针组成用
于富集KRAS基因片段的探针库:
三、DNA捕获探针杂交
1.将DNA样本库与生物素化的DNA探针库杂交
将cDNA/DNA样本库与杂交缓冲液混合,反应条件为95℃5分钟,之后保持在65℃。反应在PCR扩增仪中进行。
然后将该混合物与探针库混合,反应条件为65℃5分钟。将杂交反应臵于PCR扩增仪中,65℃孵育24小时。
四、得到经杂交富集的KRAS基因片段
1.准备链霉亲和素(Streptavidin-Coated)磁珠
使用Dynabeads链霉亲和素磁珠或者其它商业化公司链霉亲和素磁珠。将磁珠臵于混匀仪上混匀,每个样本需要50微升磁珠。
磁珠洗涤:混合50微升磁珠和200微升结合缓冲液,在混匀仪上混匀,使用Dynal磁选机或者其它商业化公司磁选机,将磁珠与缓冲液分离纯化,缓冲液弃掉不用。重复三次,每次加入200微升结合缓冲液。
2.分离杂交产物
混合1中的杂交反应混合物与2中的链霉亲和素磁珠,反复颠倒试管5 次。在室温下振摇30分钟。使用Dynal磁选机或者其它商业化公司磁选机,将磁珠分离纯化。
然后向磁珠中加入500微升洗涤缓冲液,在65℃孵育10分钟,每隔5分钟混匀一次。使用Dynal磁选机或者其它商业化公司磁选机,将磁珠分离纯化。
以上步骤重复三次。
3.cDNA/DNA富集样本释放
将磁珠与50微升洗脱缓冲液混合,室温孵化10分钟,每隔5分钟混匀一次。使用Dynal磁选机或者其它商业化公司磁选机,将磁珠分离弃掉。此时上清液中即含有富集过的KRAS基因片段cDNA/DNA样本库。
将样本库过柱纯化,商业化公司纯化试剂盒。
经过RT-PCR对富集的KRAS基因片段进行定量,以全基因组为对照,表明上述方法能够将KRAS基因片段富集9547倍。
五、PCR扩增与纯化
将富集cDNA/DNA样本库进一步扩增,为测序仪器上样做准备。
PCR条件:臵于PCR扩增仪中,98℃预变性30秒,98℃变性30秒,65℃退火30秒,72℃延伸30秒,共循环15次(cDNA样本库)或者4-6次(DNA样本库)。最后在72℃延伸5分钟。
PCR扩增产物过柱纯化,商业化公司纯化试剂盒。
六、采用下一代测序技术检测KRAS基因的基因结构突变
使用下一代商业化的测序仪器进行测序,如Roche454、Illumina Hiseq等。测序结果用已有的测序软件分析包进行分析。
示例性地,使用TruSeq PE Cluster Kit v3-cBot-HS,使用桥式PCR对DNA样本库模板进行扩增:每个DNA样本片段将会在芯片上形成克隆簇,每条泳道上产生数百万这样的克隆簇。使用Illumina HiSeq2000下一代测序系统, PE-90bp其原理是边合成边测序。和传统Sanger方法相比,利用“可逆性末端终结反应”技术,四种dNTP碱基末端被保护基团封闭,并分别以不同颜色荧光标记。
经过QC筛选后,对测序结果使用了Bowtie对所得片段进行序列映射,百分之八十以上的测序片断能够被顺利映射。通过统计分析,百分之九十九以上的碱基被测序覆盖;百分之七十五以上碱基被覆盖六十次以上。
利用Bioconductor软件,成功映射片段进行突变分析。
综上所述,本发明人开发了基于杂交选择而捕获特定KRAS基因序列的方法,采用该方法可以获得成几千倍富集的KRAS基因片段,该经富集的KRAS基因片段样本可以选择性地应用于各种基因检测技术,特别是可以应用下一代测序技术进行基因突变、缺失、增加、和颠换等方面的检测。这种基于杂交选择的靶向捕获,在很多领域极为有用。例如,对于捕获保存久远的DNA,对于临床样本中癌症基因的深度测序,对于罕见基因突变的检测等,由于其特定基因的富集作用,可以获得良好的目标基因检测样本,从而应用检测技术、例如下一代测序技术得以检测。
并且,对于将通过本发明的方法富集得到的KRAS基因片段用于基于下一代测序技术的基因结构突变检测的应用而言,还具有以下有益效果:
使用本发明的基因富集方法及筛选得到的特定DNA探针库,能够成数千倍地富集KRAS基因片段,从而可以应用下一代测序技术、利用该KRAS基因片段的测序,而准确地获得KRAS基因中的各种突变。并且,由于采用下一代测序技术,因此能够一次性检测多种类型基因突变;准确性高,传统技术例如基因芯片技术,通常需要重复两次以上才能确定检测结果,而本发明在一次反应中,对单个碱基进行反复测序,保证了数据的精准度,并且缩短了检测周期;敏感性高,和传统检测技术相比,本发明产生的数据能够达到碱基级的分辨率,使敏感度有了大幅度提高。
附图说明
以下,结合附图来详细说明本发明的实施方案,其中:
图1为本发明技术方案的示例性工艺流程图,其中富集得到目标基因,并用于基于下一代测序技术的基因结构突变检测。
图2为本发明的探针设计策略的示意图。
图3为实施例1中经探针富集的DNA样本库的RT-PCR荧光定量分析 结果。此图为荧光定量分析软件SDS2.3的截图,图中右侧曲线为全基因组未富集样本KRAS基因扩增曲线,左侧线为使用本发明探针库富集后的样本中KRAS基因扩增曲线。
图4为实施例1中在MDA-MB-231(乳腺癌)和HCT-116(直肠癌)细胞系中检测得到的KRAS基因的突变情况。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述,给出的实施例仅为了阐明本发明,而不是为了限制本发明的范围。
用以上描述的实验方法,针对KRAS基因,对全基因组或基于mRNA合成的双链cDNA进行了杂交捕获。所用的细胞系为MDA-MB-231(乳腺癌),HT-29(直肠癌),K-562(血癌),HCT-116(直肠癌),NCI-H1975(非小细胞肺癌)等不同癌症的细胞系。
下述实施例中的实验方法,如无特殊说明,均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料,如无特殊说明,均为常规商店购买得到。
实施例1:富集并检测MDA-MB-231细胞系的KRAS基因
(一)准备待检测MDA-MB-231细胞系的DNA样本库
1.提取MDA-MB-231细胞系的全基因组DNA,然后将其片段化(采用此种方式获得的DNA样本库称为“源自全基因组的DNA样本库”)
1.1DNA提取
采用Qiagen Blood&Tissue DNeasy试剂盒(货号:69506),从MDA-MB-231细胞系(人类乳腺癌细胞系,来自ATCC细胞库,货号:HTB-26)提取全基因组DNA。按说明书指示方法操作。
使用分光光度定量仪以及凝胶电泳系统检测DNA的质量和浓度。dsDNA的260nm吸光率大于0.05以上,吸光率A260/A280比值在1.8到2之间为合格。
1.2DNA片段化
将3微克高质量的基因组DNA用低TE缓冲液稀释至120微升。按照组织匀浆机使用说明书,将DNA片段化,使片段长度为150-200碱基。
使用Beckman Coulter Ampure Beads试剂盒(货号:A63880)将DNA过柱纯化。
1.3DNA样本库质量检测
用生物分析仪进行DNA定性定量分析,确认DNA片段长度峰值合理。
2.提取MDA-MB-231细胞系的mRNA,将其片段化,然后合成双链cDNA(采用此种方式获得的DNA样本库称为“源自mRNA的DNA样本库”即cDNA样本库)
2.1mRNA提取
采用Qiagen Rneasy试剂盒(货号:74106),从MDA-MB-231细胞系提取mRNA。按说明书指示方法操作。
使用分光光度定量仪以及凝胶电泳系统检测mRNA质量和浓度,吸光率A260/A280比值在1.8到2之间为合格。
2.2mRNA片段化
采用NEBNext RNA Fragmentation系统或者其他商业化公司mRNA片段化试剂盒,将mRNA片段化。然后使用Beckman Coulter Ampure Beads试剂盒(货号:A63880)将mRNA过柱纯化。
2.3合成双链cDNA
以该经片段化的mRNA为模板,使用Life Technologies cDNA合成试剂盒(货号:AM1745)合成双链cDNA。
然后使用Beckman Coulter Ampure Beads试剂盒(货号:A63880)将cDNA过柱纯化。
3.cDNA/DNA末端修补
利用T4聚合酶及Klenow大肠杆菌聚合酶片断,对于cDNA/DNA5'突出粘末端补平以及3'突出粘末端打平,产生平末端,用于后续的平端连接。反应在PCR扩增仪中进行,20摄氏度,30分钟。
[0171] 使用Beckman Coulter Ampure Beads试剂盒(货号:A63880)将cDNA/DNA过柱纯化。
4.在cDNA/DNA样本3'末端加上碱基A
反应在PCR扩增仪中进行,37℃,30分钟。
使用Beckman Coulter Ampure Beads试剂盒(货号:A63880)将cDNA/DNA过柱纯化。
5.在cDNA/DNA两端加上接头
使用Beckman Coulter Ampure Beads试剂盒(货号:A63880)将cDNA/DNA过柱纯化。
6.从获得的cDNA库中分离出合适长度的cDNA片段
使用电泳凝胶,对照DNA梯度标准,在凝胶上剪切出150-250碱基cDNA片段。
使用Beckman Coulter Ampure Beads试剂盒(货号:A63880)将含有cDNA样本库的凝胶样本过柱纯化。
7.cDNA片段样本库质量检测
使用生物分析仪,进行cDNA定性定量分析,并确认分离出的cDNA片断长度峰值合理。
8.扩增步骤5获得的DNA片段样本库或步骤7获得的cDNA片段样本库
聚合酶链反应(PCR),在PCR扩增仪中进行。
PCR条件:臵于PCR扩增仪中,98℃预变性30秒,98℃变性30秒,65℃退火30秒,72℃延伸30秒,共循环15次(cDNA样本库)或者4-6次(DNA样本库)。最后在72℃延伸5分钟。
使用Beckman Coulter Ampure Beads试剂盒(货号:A63880)将PCR扩增产物过柱纯化。
9.扩增后cDNA/DNA样本库的质量检测
使用生物分析仪,进行cDNA/DNA定性定量分析,并确认纯化后片段长度峰值合理,约200bp。因此,分别获得了源自全基因组和mRNA的MDA-MB-231细胞系的DNA样本库。
对于得到的cDNA/DNA样本库,如果cDNA小于30纳克/微升,DNA浓度小于150纳克/微升,须将样品经过真空浓缩机低温干燥(低于45℃),再用无核酸酶水溶解至所需浓度。本实施例的下文将采用获得的源自全基因组的DNA样本库进行富集和检测。
二、针对KRAS基因准备DNA探针库
探针设计策略见图2。侧翼序列长度为目标区域外的碱基数,大部分时候属于重复或者内含子区域。探针重叠区域为每个探针之间的重叠碱基数目。重叠区域越大,目标区域覆盖率越高;重叠区域越小,甚至探针间隔分布,测序成本则越低。探针长度越长,测序时对于单核苷酸多态性(SNP)的容忍度越高。
探针设计模式:探针长度与探针重叠/间隔区域长度固定,侧翼序列长度变化。这种模式能够保证一致覆盖,通过多个探针对单个基因的富集能够保证富集度高,相对脱靶率低。
探针长度最后确定为120个碱基,以保证对SNP的容忍度和对基因颠 换的敏感性。通过对primer5软件的改进,我们能够对设计的探针进行分析,以准确的知道探针的退火温度,GC成分,连续重复单基数量(如CCCCCC)。
使用了2倍重叠的方法,对KRAS mRNA(NCBI登录号:NM_004985.3)进行全程覆盖。通过对人类基因库的检索,保证所选探针有较小的脱靶率。经过筛选,首先有67个探针符合标准,通过IDT DNA Technologies,单独合成了每一个探针并用质谱分析保证质量,并在5’端有生物素(Biotin)。
然后,通过对探针碱基的分析,选择退火温度在90-100度之间,GC成分大致控制在40%-60%之间,并且连续单基数量少于4个的探针。通过生物系学分析,排除相近基因及同一家族基因,最后采用29个富集效果明显、脱靶率低的探针。
之后,通过对外显子的分析,在保证基本每个外显子有一个相吻合的探针的情况下,对29个探针进行了筛选和优化,最终共筛选得到10个DNA探针,分别为SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.10。
商业合成这些探针。
三、将DNA样本库与生物素化的DNA探针库杂交
将DNA样本库与杂交缓冲液(10mM Tris-HCl,2%牛血清白蛋白,pH8.0)混合(混合后,DNA样本库浓度至多不超过50ng/ul),反应条件为95℃5分钟,之后保持在65℃。反应在PCR扩增仪中进行。
然后以DNA样本库:探针库为1:100的摩尔比,将探针库加入上述混合物,反应条件为65℃5分钟。将杂交反应臵于PCR扩增仪中,65℃孵育24小时。
四、得到经杂交富集的KRAS基因片段
1.准备链霉亲和素磁珠
使用Dynabeads(Life technologies,货号:11206D)链霉亲和素磁珠或者其它商业化公司链霉亲和素磁珠。将磁珠臵于混匀仪上混匀。
磁珠洗涤:混合50微升磁珠和200微升结合缓冲液(10mM Tris-HCl,2%牛血清白蛋白,pH8.0),在混匀仪上混匀,使用Dynal磁选机或者其它商业化公司磁选机,将磁珠与缓冲液分离纯化,缓冲液弃掉不用。重复三次,每次加入200微升结合缓冲液。
2.分离杂交产物
混合步骤三中得到的杂交反应混合物与步骤四的1中得到的链霉亲和素磁珠,反复颠倒试管5次。在室温下振摇30分钟。使用Dynal磁选机或者 其它商业化公司磁选机,将磁珠分离纯化。
然后向磁珠中加入500微升洗涤缓冲液(磷酸缓冲液,0.1%Tween-20,0.1%SDS,pH7.4),在65℃孵育10分钟,每隔5分钟混匀一次。使用Dynal磁选机或者其它商业化公司磁选机,将磁珠分离纯化。以上步骤重复三次。
3.DNA富集样本释放
将磁珠与50微升洗脱缓冲液(10mM氢氧化钠溶液)混合,室温孵化10分钟,每隔5分钟混匀一次。使用Dynal磁选机或者其它商业化公司磁选机,将磁珠分离弃掉。此时上清液中即含有富集过的KRAS基因片段DNA样本库。
使用Beckman Coulter Ampure Beads试剂盒(货号:A63880)将样本库过柱纯化。
采用RT-PCR荧光定量分析对经探针富集的样本进行KRAS基因片段富集效果的检验。其中,以未富集的全基因组DNA样本库作为对照,内参为b-actin,RT-PCR引物序列为:
SEQ ID NO.11(正向):TGTGGTAGTTGGAGCTGGTG
SEQ ID NO.12(反向):TGTTGGATCATATTCGTCCACAA
结果见图3和下表1。
表1
经RT-PCR检测,本发明的探针能够将KRAS基因片段富集9547倍。因此,能够从全基因组中有选择性的检测KRAS基因的相关突变。
此外,发明人还采用获得的源自mRNA的全转录组库DNA样本进行富集和检测,这一样本库与探针库的杂交以及经杂交富集的KRAS基因片段的分离与上文相同。经RT-PCR检测,发现本发明的探针能够将KRAS基因片段富集5649倍。因此,也能够从全转录组中有选择性的检测KRAS基因的相关突变。
五、PCR扩增与纯化
将富集cDNA/DNA样本库进一步扩增,为测序仪器上样做准备。
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PCR条件:臵于PCR扩增仪中,98℃预变性30秒,98℃变性30秒,65℃退火30秒,72℃延伸30秒,共循环15次(cDNA样本库)或者4-6次(DNA样本库)。最后在72℃延伸5分钟。
使用Beckman Coulter Ampure Beads试剂盒(货号:A63880)将PCR扩增产物过柱纯化。
六、采用下一代测序技术检测KRAS基因的基因结构突变
使用TruSeq PE Cluster Kit v3-cBot-HS,使用桥式PCR对DNA样本库模板进行扩增:每个DNA样本片段将会在芯片上形成克隆簇,每条泳道上产生数百万这样的克隆簇。使用Illumina HiSeq2000下一代测序系统,PE-90bp其原理是边合成边测序。和传统Sanger方法相比,利用“可逆性末端终结反应”技术,四种dNTP碱基末端被保护基团封闭,并分别以不同颜色荧光标记。
经过QC筛选后,对测序结果使用了Bowtie对所得片段进行序列映射,百分之八十以上的测序片断能够被顺利映射。通过统计分析,百分之九十九以上的碱基被测序覆盖;百分之七十五以上碱基被覆盖六十次以上。
利用Bioconductor软件,成功映射片段进行突变分析。
测序结果表明,在MDA-MB-231细胞系的KRAS基因中发现一处单碱基突变,为38G>A。结果见图4。图4中正对照为正常人类淋巴B细胞。
经过DNA提取、PCR扩增和Sanger测序法,以上突变已被验证。
实施例2:富集并检测HCT-116细胞系的KRAS基因
利用实施例1中得到的由SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.10组成的探针库,采用和实施例1中相同的方法检测HCT-116细胞系(人类大肠癌细胞系,来自ATCC细胞库,货号:ATCC-CCL-247)的KRAS基因,在HCT-116细胞系的KRAS基因中发现一处单碱基突变,为38G>A。结果见图4。
经过DNA提取,PCR扩增和Sanger测序法,以上突变已被验证。
机译: LNA阻断多重PCR和寡核苷酸生物微片段杂交之后的基因EGFR,KRAS和Braf体细胞突变分析方法
机译: 用于与微卫星不稳定性相关的微卫星基因座杂交的DNA探针库,检测方法和试剂盒
机译: 用于检测kRas基因突变的探针,液体及其检测方法