甜瓜枯萎病抗性与全雌系分子标记辅助选择的引物及方法

摘要

本发明公开一种甜瓜枯萎病抗性与全雌系分子标记辅助选择的引物及方法。本发明根据甜瓜的A基因DNA序列上的第6045个碱基与a基因相应位点存在单基因突变，由此设计CAPS引物A-as、A-s，根据甜瓜G与g基因分别设计SCAR引物对G-as、G-s及g-as、g-s，用于区分标记甜瓜的性别基因；同时根据MR-1与WI998Fom-2基因SCOP功能域的比对结果确定显示能够在此区域仅第481个碱基能开发为CAPS的标记位点，由此设计引物对F-s、F-as。通过PCR反应进行扩增后酶切的多态性，可用于甜瓜枯萎病抗性与全雌系的分子标记辅助育种。利用本发明进行辅助育种，具有选择目标明确，节约成本等优点。

说明书

技术领域

本发明涉及分子遗传学领域，具体涉及一种甜瓜枯萎病抗性与全雌系分子标 记辅助选择的引物及方法。

背景技术

甜瓜(Cucumis melonL.)是我国重要的经济作物。目前，雄全同株作为商 业栽培时的主要品种。在杂交制种时必须在蕾期将完全花花冠剥除，做去雄处理。 在此期间套袋，授粉，标记，种子纯度鉴定等操作规程增大了劳动强度、制种成 本高且种子纯度难以保证。薄皮甜瓜完全花的雄蕊相对厚皮甜瓜较小，纯度更加 难以保证，而且薄皮甜瓜是我国甜瓜的主要栽培品种。

在传统的甜瓜制种过程中，要按照在花蕾期将完全花花冠剥除，去雄，套袋， 授粉，标记等操作流程以保证种子纯度，而后还要对种子进行纯度鉴定确保万无 一失。不仅劳动强度大，制种成本高，而且种子纯度难以保证。加之薄皮甜瓜作 为我国甜瓜主要栽培品种，其完全花的雄蕊相对较小，使得去雄难度加大，种子 纯度更加难以保证。与此同时，枯萎病的连年蔓延更是影响着甜瓜的品质与产量。

甜瓜植株花型共有7种性型分别为：雌雄异花同株、雄全同株、两性花株、 雌全同株、三性花株、全雌系、全雄系。2005年Zalapa通过构建甜瓜遗传图谱 确定了A、G和M(gy)3个基因控制甜瓜性别分化，并提出存在影响三性花株 与雌全同株转化的微效基因，且能够产生该影响的微效基因受环境因素影响。 2008年Boualem通过染色体步移方法，利用甜瓜遗传图谱上距离a基因25.2cM 的RFLP标记，明确了控制甜瓜性别分化雄全同株基因a即为控制ACC合成酶 基因ACS7，并成功克隆了该基因；Antoine Martin等(2009)报道了在甜瓜花 芽分化第6阶段a、g基因表达量最高，利用雌雄异花同株和全雌系杂交，图位 克隆得到了引起雄花向雌花过渡的基因位点，并鉴定出全雌系与一个基因家族的 转座子插入有关，引起WIP1(G)基因启动子的甲基化。WIP1编码一个转录 因子，阻止雌性器官发育。在全雌系中，WIP1基因的甲基化使WIP1基因表达 沉默，形成雌花。另外，WIP1抑制直接导致了另一个基因活化，即ACS7基因， a基因编码一个乙烯合成酶基因ACS7，它阻止了雄性器官发育，形成单性的雌 花。雄性器官是因为WIP1的抑制和一个无功能ACS7基因的出现而形成。WIP1 和ACS7相互作用可以解释雄花、雌花和完全花的形成机理。

甜瓜枯萎病(Fusariumoxysperium)是一种世界性的甜瓜病害，在国外已有二 三十年的历史。近年来，随着甜瓜面积的不断扩大，我国许多省市甜瓜枯萎病发 生严重，且为害程度逐年加重。该病是典型的土传病害，从苗期到成株期均可发 病，结瓜中期为发病高峰，常引起瓜秧枯萎死亡，对瓜的品质、产量影响很大。

在枯萎病的防治中，使用抗性品种是最有效的方法。尖孢镰刀菌甜瓜专化型 的病原菌被Risser划分为4个生理小种，分别为race0、race1、race2和race 1，2；3个抗病基因，分别为Fom-1、Fom-2和Fom-3，其中：Fom-1抗race0 和2，感race1和race1，2；Fom-2抗race0和1，感race2和race1，2；Fom-3 抗race0，1和2，感race1，2，且都是显性基因。Tarek等根据文库及Wang等 得到与Fom-2紧密连锁的分子标记，通过图位克隆方法克隆了基因Fom-2，这 是到目前为止，甜瓜中唯一克隆到的抗枯萎病基因。2011年杨加付等通过同源 克隆方法从薄皮甜瓜白啄瓜中克隆到了枯萎病抗性基因Fom-2，推定编码1099 个氨基酸，所推定的蛋白质序列经Blast分析与数据库中NBS-LRR类R基因具 有较高的同源性。进一步序列分析FOM-2蛋白具有典型的R基因的NB-ARC 及SCOP2个结构功能域。

发明内容

针对目前甜瓜在制种过程中存在的一系列问题，本发明提供了一种甜瓜枯萎 病抗性与全雌系分子标记辅助选择的引物及方法，通过PCR的方法，达到在甜 瓜植株早期便能完成对甜瓜全雌系及枯萎病抗性筛选的目的。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

1、一种甜瓜枯萎病抗性与全雌系分子标记辅助选择的引物，被确定为甜瓜 枯萎病抗性与全雌系植株所需的分子标记同时含有三个，所述的三个分子标记需 用四组引物对进行扩增：

(1)标记甜瓜性别基因A基因的引物对为：

A-as：如序列表Seq No.1所示，

A-s：如序列表Seq No.2所示；

(2)标记甜瓜性别基因G、g基因的两对引物对，其中标记G基因的引物 对为：

G-as：如序列表Seq No.3所示，

G-s：如序列表Seq No.4所示；

(3)标记g基因的引物对为：

g-as：如序列表Seq No.5所示，

g-s：如序列表Seq No.6所示；

(4)标记甜瓜枯萎病抗性的Fom-2基因的引物对为：

F-s：如序列表Seq No.7所示，

F-as：如序列表Seq No.8所示。

2、根据如上所述的一种甜瓜枯萎病抗性与全雌系分子标记辅助选择的引物 得出的一种甜瓜枯萎病抗性与全雌系分子标记辅助选择方法，通过如下步骤完 成：

(1)以全雌系感枯萎病材料WI998为母本，雄全同株抗枯萎病材料MR-1 为父本杂交，获得F₁代植株；

(2)将F₁代自交，得到F₂代植株；

(3)取F₂代植株叶片提取基因组DNA，对甜瓜抗枯萎病和全雌系性状进行 分子标记定位，以A-as、A-s引物对标记AA基因，以G-as、G-s引物对及g-as、 g-s引物对标记gg基因，以F-s、F-as引物对标记抗枯萎病FF基因；

(4)以酶切PCR产物及田间复查甜瓜植株的方式确定分子标记定位的准确 性，确定标记得到的甜瓜植株的基因型为AAggFF。

3、如上所述的一种甜瓜枯萎病抗性与全雌系分子标记辅助选择的引物，分 子标记的反应程序为：

将混合液在94℃预变性8min；然后94℃变性30s，51℃退火30s，72℃延伸 1min，35个循环；最后72℃终延伸10min；所述混合液组成如下：

扩增产物用质量浓度为1％琼脂糖凝胶电泳观察结果。

本发明具有如下优点：

1、利用本发明的甜瓜枯萎病抗性与全雌系分子标记辅助选择体系育种选择 目标明确，可节约成本。利用本发明的分子标记在瓜苗期就可以筛选出抗枯萎病 全雌系甜瓜，省去了去雄，套袋等一列操作，减少工作量，提高效率。

2、本发明利用采取传统育种方法，以全雌系感枯萎病材料WI998为母本， 雄全同株抗枯萎病材料MR-1为父本杂交。利用分子标记辅助选择，筛选出基因 型为AAggFF的F₂代抗枯萎病全雌系群体。

3、根据Fom-2蛋白存在的2个结构功能域：NB-ARC和SCOP功能域，即 NB-ARC功能域是植物R基因的典型结构功能域，SCOP为富含LRR的结构功 能域，对NBS-LRR类R基因的功能十分重要。针对FOM-2蛋白的SCOP结构 功能域对应的核苷酸序列进行扩增，比对两亲本(母本WI998，父本MR-1)， 设计CAPS引物，开发预期紧密连锁的分子标记。为甜瓜枯萎病抗病育种提供新 的技术基础。

附图说明

图1为甜瓜枯萎病感病级数图。

图2为A、a基因目的片段扩增图，

其中，1为MR-1的目的基因扩增结果，2为WI998的目的基因扩增结果， 3为F₁的目的基因扩增结果。

图3为A，a基因片段PCR的酶切结果图，

其中，1为MR-1目的基因PCR的酶切结果，2为WI998目的基因PCR的 酶切结果，3为F₁目的基因PCR的酶切结果图。

图4为A基因F₂群体的PCR扩增结果图；

图5为A基因F₂群体PCR产物的酶切结果图，

其中，1为基因型AA的植株，2为基因型为aa的植株，3为基因型为Aa 的植株。

图6为G、g基因目的片段的PCR扩增图，

其中，1为WI998的目的基因扩增结果，引物为g-as、g-s；2为MR-1的目 的基因扩增结果，引物为g-as、g-s；3为F₁的目的基因扩增结果，引物为g-as、 g-s；4为MR-1的目的基因扩增结果，引物为G-as、G-s；5为WI998的目的基 因扩增结果，引物为G-as、G-s；6为F₁的目的基因扩增结果，引物为G-as、G-s。

图7为g基因F₂群体的扩增结果图。

图8为G基因F₂群体的扩增结果图。

图9为MR-1与WI998Fom-2基因的SCOP功能域测序结果比对图。

图10为Fom-2基因目的片段扩增图，

其中，1为MR-1的目的基因扩增结果，2为WI998的目的基因扩增结果， 3为F₁的目的基因扩增结果。

图11为Fom-2基因片段PCR的酶切结果图，

其中，1为MR-1目的基因PCR的酶切结果，2为WI998目的基因PCR的 酶切结果，3为F₁目的基因PCR的酶切结果。

图12为Fom-2基因F₂群体的酶切结果图，

其中，1为基因型为FF的植株，2为基因型为ff的植株，3为基因型为Ff 的植株。

图13为F₃代中A基因酶切结果图，

其中，1为MR-1目的基因PCR的酶切结果，2为WI998目的基因PCR的 酶切结果，3为F₁目的基因PCR的酶切结果。

图14为F₃代中G基因扩增结果图，

其中，1为MR-1目的基因PCR的酶切结果，2为WI998目的基因PCR的 酶切结果，3为F₁目的基因PCR的酶切结果。

图15为F₃代中g基因扩增结果图，

其中，1为MR-1目的基因PCR的酶切结果，2为WI998目的基因PCR的 酶切结果，3为F₁目的基因PCR的酶切结果。

图16为F₃代中Fom-2基因酶切结果图，

其中，1为MR-1目的基因PCR的酶切结果，2为WI998目的基因PCR的 酶切结果，3为F₁目的基因PCR的酶切结果。

图17为20个品系的Fom-2基因酶切验证图，

其中，从左至右的DNA模板依次为BT3、No.26、TN、S3、M-021、3-1-3、 甜帅、PI1446928、PI1446931、台甜1-5-1、No.30、台甜3-1、MRIL7-165、，6-1-4-4、 PI508448、PI618848、PI1446930、3-2-2、台甜2-2-4、PI1446929。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述：

实施例1

供试甜瓜及其DNA提取

(一)供试甜瓜及其枯萎病抗性分析

(1)供试甜瓜材料：WI998与MR-1、F1代、F2代，抗病对照材料：3-1-3， PI1446928，PI1446931，PI1446930，PI1446929，PI618848，PI508448，台甜2-2-4， 台甜3-1，No.30，感病对照材料：甜帅、BT3、MRIL7-165、No.26、台甜1-5-1、 TN、6-1-4-4、S3、M-021、3-2-2。

(2)苗期枯萎病抗性分析：抗病性鉴定采用苗期伤根法接种枯萎病病菌， 当供试甜瓜幼苗长至1片真叶时，挖出，经清水洗净后，于孢子悬浮液(孢子悬 浮液中含孢子数一般为5.5×10⁵个/mL)中浸泡15min，再植回营养杯培养，培养 条件：温度为28℃，光照时长为14～16h，相对湿度为70～80％，潜育发病，接 菌后7天，叶片病情分级及反应型划分标准各类病害的病情分级及反应型参照 《中华人民共和国农业行业标准》中的相关规程，具体如下：0级，无病症；1 级，子叶萎蔫或部分子叶与真叶轻微萎蔫；2级，1片真叶萎蔫或子叶较重萎蔫； 3级，子叶及部分真叶萎蔫；4级，整株轻度萎蔫，部分枯死，但是心叶仍然成 活；5级，整株严重萎蔫并枯死。苗期具体表现形式如图1所示。依据上述分级 标准调查病情，并计算病情指数(DI)，抗性分级标准为：高抗(HR)：DI＜10； 抗病(R)：10≤DI＜30；中抗(MR)：30≤DI＜50；感病(S)：DI≥50。之后每两天观 察一次感病情况，共观察3次。

(二)供试甜瓜基因组DNA的提取

(1)叶片采集：将WI998、MR-1、F₁代、F₂代、对照材料播种于培养钵中， 待三叶一心时期，取植株顶部较为幼嫩的叶片，每份0.2g，在-80℃下保存备用。

(2)DNA提取：采用改进的CTAB法提取甜瓜基因组DNA。称取0.2g叶 片，液氮中研磨后加入800μL2％CTAB混匀，65℃水浴1h，13000r/m离心10min， 吸取750μL上清液，加入等体积24：1氯仿异戊醇，振荡均匀后静10min，13000r/m 离心10min，吸取650μL上清液，加入等体积24：1氯仿异戊醇，振荡均匀后静 置10min，13000r/m离心10min，吸取550μL上清液，加入3μL RNA酶，水浴 1h，加入550μL24：1氯仿异戊醇，振荡均匀后静置10min，13000r/m离心10min， 吸取450μL上清液，加入冰浴的异丙醇，-20℃静置1h，13000r/m离心10min， 弃上清，沉淀用70％无水乙醇清洗两次，吹干后加入150μL H₂O溶解，于-80℃ 保存备用。

实施例2

目的基因分子标记筛选

(一)目的基因分子标记筛选的引物设计：采取传统育种方法，以全雌系感 枯萎病材料WI998为母本，雄全同株抗枯萎病材料MR-1为父本杂交。根据A 与a基因所转录蛋白序列在第56个氨基酸上存在的差异，即在A基因DNA序 列上的第6045个碱基与a基因相应位点存在单基因突变，并发现此碱基位点为 Alu I酶切位点，由此设计CAPS引物。在G基因的ORF2与ORF3之间，据ORF3 1.3kb的区域插入一段名为Gyno-hAT的转座子，使得G基因不能正常表达进而 失活。因此，分别在G与g基因上分别设计SCAR引物，用于区分显隐性基因。 分别扩增MR-1与WI998Fom-2基因在SCOP功能域，比对结果显示两品种在此 功能域中共存在37个SNP位点，但能够开发为CAPS标记的位点仅为在此区域 的第481个碱基。

根据NCBI(National Center for Biotechnology Information，美国国家生物技术 信息中心)公布的甜瓜性别基因ACS7(A)、WIP(G)、Fom-2(F)序列信息自 行设计合成引物。用于甜瓜枯萎病抗性与全雌辅助选择系分子标记中扩增引物具 有如下所示的核苷酸序列：

A-as：5′-ACCCAGGATAGTAAGGAGTG-3′

A-s：5′-GAATCGGAACATCAGAAACA-3′

G-as：5′-TAGGTCCAACCAACAACAAT-3′

G-s：5′-AAAATAGAGTCAGCCAACC-3′

g-as：5′-AACACGCAACTGAAACGA-3′

g-s：5′-ATGATAATAAGGAGAAAGGGAC-3′

F-s：5′-TGTGGATGGCACAAGGT-3′

F-as：5′-CAATGGTCCCAATTCAATAA-3′

(二)目的基因分子标记筛选及分析

(1)目的基因分子标记筛选体系

将混合液在94℃预变性8min；然后94℃变性30s，51℃退火30s，72℃延伸 1min，35个循环；最后72℃终延伸10min。所述混合液组成如下：

扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳观察结果。

(2)酶切PCR产物分析其基因型

将上述PCR产物进行酶切分析，以鉴定其基因型。

(A)用ALuI进行酶切反应。将混合液在37℃反应12h，然后用1％琼脂糖 凝胶电泳观察结果。混合液的体系如下：

(B)用BcLI进行酶切反应。将混合液在55℃反应12h，然后用1％琼脂糖 凝胶电泳观察结果。混合液的体系如下：

(3)具体操作步骤

分别以MR-1、WI998、F₁代的基因组DNA为模板，以A-as与A-s为引物， 进行PCR扩增，反应体系及反应条件如上所述，结果如图2所示。用ALuI进行 酶切分析，反应体系及反应条件如上所述，区分亲本及F₁代中A基因的多态性， 即验证基因型为纯和还是杂合，结果如图3所示。在图3中1、2、3的基因型分 别为aa、AA、Aa。将F₁代进行杂交，如上所述方法进行F₂代基因组DNA的 PCR扩增，反应体系及反应条件如上所述，PCR结果如图4所示。将F₂代基因 组DNA的PCR产物进行酶切，反应体系及反应条件如上所述，筛选出F₂代基 因型为AA的群体，酶切结果如图5所示。

分别以MR-1、WI998、F₁代的基因组DNA为模板，分别以G-as、G-s和 g-as、g-s两对引物进行PCR扩增，反应体系及反应条件如上所述，得到的扩增 产物多态性区分基因型的纯杂合，结果如图6所示。确定MR-1基因型为gg， WI998基因型为GG，F₁代基因型为Gg。将F₁代进行自交得到F₂代植株，并提 取基因组DNA。以F₂代基因组DNA为模板，分别用G-as、G-s和g-as、g-s两 对引物如上所述方法对F₂代基因组DNA进行PCR扩增，反应体系及反应条件 如上所述，结果如图7、8所示。对比两图可筛选出F₂代中基因型为gg的群体。

图9所示为抗枯萎病基因的筛选，图为MR-1与WI998(即父母本)在Fom-2 基因的SCOP功能域扩增片段比对结果，其中在此功能域中存在37个SNP位点， 本实验利用第481个碱基的SNP开发CAPS引物用于区分Fom-2基因的纯杂合。

分别以MR-1、WI998、F₁代的基因组DNA为模板，以F-as、F-s为引物进 行PCR扩增，反应体系及反应条件如上所述，结果如图10所示。用内切酶BcLI 进行分析，酶切体系及条件如上所述，区分亲本及F₁代中Fom-2基因的多态性， 即验证基因型为纯和还是杂合，结果如图11所示。在图11中1、2、3的基因型 分别为FF、ff、Ff。将F₁代进行杂交，如上所述方法进行F₂代基因组DNA的 PCR扩增，将F₂代基因组DNA的PCR产物进行酶切，酶切体系及条件如上所 述，筛选出F₂代基因型为FF的群体。酶切结果如图12所示。

(三)种子纯度的检测及Fom-2基因引物的多态性与感抗病一致性的检测

(1)种子纯度的检测

根据酶切结果，找到在双亲及F₁代具有多态性的引物，在F₂代群体中筛选 出抗枯萎病全雌系植株，观察植株花型，授粉，所得即为F₃代。在F₃代群体中 的每个群体分别随机挑选20粒种子播种，在苗期提取DNA，并将同一群体的 DNA混合，分别用上述4对引物验证种子纯度。结果如图13-16所示。图13为 F₃代中A基因酶切结果，其中1、2、3分别为MR-1、WI998、F₁的酶切结果； 图14为F₃代中G基因扩增结果，其中1、2、3分别为MR-1、WI998、F1的酶 切结果；图15为F₃代中g基因扩增结果，其中1、2、3分别为MR-1、WI998、 F1的酶切结果；图16为F₃代中Fom-2基因酶切结果，其中1、2、3分别为MR-1、 WI998、F1的酶切结果。结果证实F₂代所得抗枯萎病全雌系植株种子合格。

(2)Fom-2基因引物的多态性与感抗病一致性的检测

在本实验室现有的甜瓜品系中挑选出10个抗枯萎病品种，10个感枯萎病品 种用于验证Fom-2基因引物的多态性与感抗病一致性。将20个品种基因组DNA 的PCR扩增，将20个品种基因组DNA的PCR产物进行酶切，酶切体系及条件 如上所述，酶切结果如图17所示。证明Fom-2基因的引物多态性与感抗病一致。

(四)研究结果的田间复查

(1)基因型的鉴定：

在F₂群体、获得的F₂代果实F₃种子的每个群体中随机挑选20粒种子中利 用所设计的3对用于区分性别基因A、G的引物PCR扩增产物及酶切后获得多 态性片段与亲本、F₁代扩增酶切片段相比较。在F₂群体中基因型A_G_：aaG_： aagg：A_gg为1044：352：124：336，同时田间调查结果显示，雌雄异花同株 (A_G_)：雄全同株(aaG_)：两性花株(aagg)：雌全同株、三性花株、全雌系 (A_gg)为1086：276：97：404。

由此可见分子标记选择结果与田间调查结果基本符合。

(2)抗枯萎病的鉴定：

表1：甜瓜品系枯萎病抗性情况调查结果

由表1及图17可以得出标记Fom-2能够有效区分甜瓜材料枯萎病感抗性， 由此可认定图16中所筛选出的6个F₃群体即为抗甜瓜枯萎病群体。在此之前， 已鉴定在图16中的24个群体均为全雌系，因此通过本实验的分子标记辅助选择 体系在F₂代群体的1863株植株中筛选出基因型为AAggFF植株35株，获得符 合该基因型植株果实6个。