一种用离子液体和修饰剂处理后的秸秆制备纤维素酶固定化载体的方法

摘要

本发明公开了一种用离子液体和修饰剂处理后的秸秆制备纤维素酶固定化载体的方法，包括如下步骤：秸秆的预处理、秸秆的修饰以及载体干燥成型。本发明的优点为：1、采用离子液体和修饰剂修饰秸秆得到的纤维素材料来制备酶固定化载体，处理过程绿色环保、无污染、操作条件温和、处理工艺简易可行，且处理后的离子液体和修饰剂可以完全回收，可大大降低载体的生产成本。2、通过本发明方法制备得到的固定化酶载体上的酶吸附率高、稳定性高，提高了酶的催化活性。3、本发明方法制备的酶固定化载体可以重复使用多次，仍能保持较高的酶活性。

说明书

技术领域

本发明属于生物化工技术领域，涉及一种用离子液体和修饰剂处理后的秸秆制备纤 维素酶固定化载体的制备方法。

背景技术

酶是一种由氨基酸组成的具有特殊生物活性的物质，它存在于所有活的动植物体 内，是维持机体正常功能，消化食物，修复组织等生命活动的一种必需物质。酶是具有 生物催化功能的生物大分子，即生物催化剂，它能够加快生化反应的速度，但是不改变 反应的方向和产物。酶只能用于加速各类生化反应的速度，但并不是生化反应本身。酶 的固定化就是通过某些方法将酶与载体相结合后成为不溶于含有底物的相中，从而使酶 被集中或限制在一定的空间范围内进行酶解反应，因此称之为固定化酶。固定化酶与游 离酶相比，具有下列优点：①极易将固定化酶与底物、产物分开；②可以再较长时间内 进行反复分批反应和装柱连续反应；③在大多数情况下，能够提高酶的稳定性；④酶反 应过程能够加以严格控制⑤产物溶液中没有酶的残留，简化了提纯工艺；⑥较游离酶更 适合于多酶反应；⑦可以增加产物的收率；⑧酶的使用效率提高，成本降低。酶的固定 化方法可大致分为两大类:包埋法和连接法。包埋法可再分为两个小类：凝胶包埋法和 微囊包埋法。连接法又可分为：吸附法和共价连接法。纤维素是棉花、木材、亚麻、草 类等高等植物细胞壁的主要成分，每年由光合作用可产生几百亿吨，是自然界取之不尽、 用之不竭的可再生资源。

离子液体是指全部由阴阳离子组成的盐。由于离子液体具有非挥发性、良好的离子 导电性与导热性、高热容及高热稳定性，选择性溶解力等特点，使得离子液体成为目前 化学化工领域研究的热点之一。

现有载体上吸附的酶容易脱落，由此导致固定化酶稳定性和活性不高，同时酶固定 化载体很少能够重复利用，因此存在载体材料的后处理及废载体的闲置问题。

发明内容

发明目的：本发明的目的是提供一种用离子液体和修饰剂处理后的秸秆制备高酶负 载量、高酶活性、可重复利用且廉价环保的纤维素酶固定化载体的制备方法。

技术方案：本发明所述用离子液体和修饰剂处理后的秸秆制备纤维素酶固定化载体 的方法，包括如下步骤：

（1）秸秆的预处理：除去秸秆上的杂质、干燥并剪切成段；

（2）秸秆的修饰：先用离子液体溶解秸秆，再加入修饰剂搅拌均匀，得到纤维素 载体溶液，该修饰过程使用超声波，使秸秆的表面和内部结构发生变化；

（3）载体干燥成型：向上述纤维素载体溶液中加入溶剂，搅拌均匀，洗涤除去杂 质，然后干燥、真空脱气制成纤维素酶固定化载体。

步骤（1）中，秸秆选取茎节部位，并将秸秆茎节剪切成0.4-0.6cm的小段。

步骤（2）中，所述秸秆与离子液体的重量比为1：1-5；所述修饰剂的终浓度为 0.1-0.2M。所述离子液体为具有纤维素溶解功能的离子液体，且大多数为酸性离子液体。 所述的修饰剂为聚乙二醇或者溴代丁乙酰亚胺。所述的超声波处理的功率为30-60w，处 理时间为5-10min。

步骤（3）中所述的溶剂为水或短链醇，且加入的溶剂为纤维素载体溶液体积的1-5 倍。

发明原理：秸秆中含有大量的纤维素，加入的离子液体可以溶解、破坏秸秆中结晶 度低的纤维素，剩下的都是结晶度高、强度大的类似纳米纤维素的刚性纤维载体，而且 剩余纤维素载体的表面和内部形成多孔的结构，为酶的固定化提供很多的位点，为后续 反应提供条件；加入的修饰剂与纤维载体结合，并连接在纤维载体的表面和内部，可以 与酶分子上氨基等基团结合，进而实现酶的固定化。

有益效果：本发明与现有技术相比：其显著优点为：1、采用具有非挥发性、良好 的离子导电性与导热性、高热容及高热稳定性，选择性溶解力等优点的离子液体等处理 剂修饰秸秆得到的纤维素材料来制备酶固定化载体，处理过程绿色环保、无污染、操作 条件温和、处理工艺简易可行，且处理后的离子液体和修饰剂可以完全回收，可大大降 低载体的生产成本。2、通过本发明方法制备得到的固定化酶载体上的酶吸附率高、稳 定性高，提高了酶的催化活性。3、本发明方法制备的酶固定化载体可以重复使用多次， 仍能保持较高的酶活性。

附图说明

图1为用本发明方法制备的载体的扫描电镜图（放大1000倍）。

具体实施方式

下面对本发明技术方案进行详细说明。

实施例1：按如下步骤进行：

（1）取玉米秸秆的茎节，洗去秸秆上的污泥尘土等杂质，干燥后剪切成0.5cm左 右（0.4-0.6cm）的小段。

（2）取1g秸秆加入250ml的三口烧瓶中，在温度25℃（室温）时先加入5g离子 液体[DMIM][DMP]，用超声波清洗仪（设定功率60w）处理5min，再加入终浓度为0.2M 的聚乙二醇400060ml，搅拌均匀，超声波清洗仪（设定功率60w）处理10min，对秸秆 的表面和内部结构进行修饰，使秸秆内部结构发生变化，表面积增大，酶的吸附位点增 加，得到纤维素载体溶液。

（3）向上述纤维素载体溶液中加入3倍体积的水，均匀搅拌10min，将载体加入用 去离子水中，并且施以剧烈的搅拌，洗涤3-5次除去杂质，载体60℃干燥，真空脱气制 备成载体。

该载体的扫描电镜图如图1所示，竹片中结晶度低的纤维（NMMO处理容易脱落和溶 出）经过处理除去，通过上述处理方法得到的载体为多孔结构，为酶提供较多的吸附位 点。

实施例2：制备步骤与实施例1基本相同，不同之处为：1、加入1g离子液体[EMIM]Cl 处理秸秆；2、加入70ml终浓度为0.1M的聚乙二醇1000；3、两次使用超声波清洗仪 （设定功率30w），处理时间均为10min；4、步骤（2）处理秸秆的整个过程保温，温度 为90℃；5、加入与纤维素载体溶液等体积的乙醇洗涤除去杂质。

实施例3：制备步骤与实施例1基本相同，不同之处为：1、加入3g离子液体 [EMIM][oAc]处理秸秆；2、加入100ml终浓度为0.15M的溴代丁乙酰亚胺；3、两次使 用超声波清洗仪（设定功率50w），处理时间均为8min；4、步骤（2）处理秸秆的整个 过程保温，温度为50℃；5、加入的水为纤维素载体溶液体积的5倍。

实施例4：

取20ml的50mM pH5.0的醋酸-醋酸钠缓冲液，加入0.2mg纤维素酶，加入1g实施 例1制备的载体，在30℃水浴摇床中反应24h。过滤获得固定化酶，用醋酸-醋酸钠缓 冲液洗涤直至检测不到蛋白为止。采用考马斯亮蓝法检测纤维素酶的吸附率，测得其吸 附率1500mg/g（是原吸附率的96%）；同时采用DNS法、以葡萄糖作为标准品检测纤 维素酶的活性，测得该固定化酶的表观活性为40IU，催化降解纤维二糖底物（0.5mg/ml）， 每次催化时间2min，重复使用15次后，载体固定化酶活性达到90%左右。

实施例5：用实施例2制备的载体重复实施例4，测得纤维素酶的吸附率为1600mg/g （是原吸附率的98%）；该固定化酶的表观活性为43IU，催化降解纤维二糖底物 （1mg/ml），每次催化时间5min，重复使用15次后，该载体固定化酶活性残余85%左 右。

实施例6：用实施例3制备的载体重复实施例4，测得纤维素酶的吸附率为1800mg/g （是原吸附率的99%）；该固定化酶的表观活性为45IU，催化降解纤维素底物 （0.5mg/ml），每次催化时间5h，重复使用5次后，该载体固定化酶活性达到40%左右。