一株具有降解肌酐和尿素能力的乳酸菌及其筛选方法

摘要

本发明属于生物技术领域，公开了一株筛选于内蒙古地区酸奶中的乳酸菌菌株，该菌株具有较高的肌酐和尿素降解能力，鉴定为保加利亚乳杆菌（Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus）。本发明还公开了降解肌酐菌株的筛选方法。将该菌株用于保健食品领域，具有辅助治疗肾衰竭、尿毒症、提高机体免疫力等功效。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一株能够降解肌酐和尿素能力的乳酸菌，并涉及该菌株的筛选方法。本发明通过对内蒙古地区酸牛奶中的乳酸菌进行富集培养和分离纯化，随后对乳酸菌的驯化和富筛获得该菌株。 

背景技术

慢性肾衰竭，又称慢性肾功能不全、尿毒症，是各种原发性肾病或继发性于其他疾病引起的肾脏进行性损伤和肾功能的逐渐恶化。临床表现主要为代谢产物潴留、水和电解质紊乱及酸碱平衡失调、肾功能严重损害。到目前为止，慢性肾衰竭还缺乏有效的治疗手段，主要依靠血液透析、肾移植，所需费用昂贵，透析治疗每年所需的费用巨大，而肾移植肾源供求问题严重，所需费用更加昂贵。这些治疗方法给社会和家庭带来巨大的经济压力，也使病人承受着极大的痛苦。除了透析和肾移植的治疗方法，目前已有谷氨酸棒状杆菌经体外诱导产生脲酶和肌酐酶，将其提取分离后制成微囊口服在肠道分解肌酐、尿酸等毒素，但此法因对尿毒素无作用而未在临床广泛使用。近年来，消化道细菌治疗法成为了继消化道酶疗法的清除肠道毒素的小疗法，其治疗方法为：使用自然菌种，如低毒土壤菌，体外诱导产生尿素酶，口服进入肠道，分解肠道尿毒素；或将高产酶基因导入另一种细菌中，构建工程菌，将该工程菌摄入肠道，降解尿毒素。但这类方法摄入的菌存在安全隐患，可能导致肠道菌群失调，并诱发感染。 

益生菌是一种对宿主有益的活性微生物，可以定植于人体肠道内，改善肠道菌群平衡，控制肠道感染。激活肠淋巴细胞能启动全身免疫系统提高免疫力，还有降低患者血压、血脂等作用。Suzuki（K.Suzuki,Y.Benno,T.Mitsuoka,S.Takebe,K.Kobashi,J.Hase.Urease-Producing Species of Intestinal Anaerobes and Their Activities.[J]Applied and Environmental Microbiology,Mar.1979,379～382.）从慢性肾衰患者的粪便中分离到一株产脲酶的双歧杆菌，CHOW（Chow,Liu ZC,Prakash S,et al.Free and microencapsulated Lactobacillus and effects of metabolic induction on urea removal.Artif Cells Blood Substit Immobil Biotechnol2003Nov;31(4):425-34.）等发现德式乳杆菌在高浓度尿素培养基中多次传代后，表现出对尿素的降解能力。研究发现，口服嗜酸乳杆菌可以降低透析病人尿毒症毒素水平。因此开发具有将肌酐和尿素功能的活性益生菌对于慢性肾衰竭患者的治疗具有重大意义。 

发明内容

本发明的目的是提供一株具有降解肌酐和尿素能力的乳酸菌及其筛选方法。 

本发明所提供的菌株为乳杆菌属，其保藏编号为CGMCC No.7983，经16S rDNA核苷酸序列结果以及生理生化结果分析，确定为保加利亚乳杆菌（Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus）。 

本发明还提供一种筛选具有降解肌酐和尿素能力的乳杆菌的筛选方法。首先是乳酸菌的富集培养，选择内蒙古地区富含乳酸菌的酸牛奶，加入到MRS液体培养基进行富集培养，40℃静置培养24h，按5%的接种量加入含0.1%肌酐和0.05%尿素的MRS培养基中，富集培养24h；随后是乳酸菌的初步分离纯化，取上述富集培养液进行梯度稀释，取10^-5、10^-6、10^-7的稀释液，涂布于溴甲酚紫脱脂乳平板上，于40℃厌氧培养48h，挑取肉眼可见、产酸（培养基颜色变黄）的菌落分离纯化，并编号保存；随后是乳酸菌的驯化，将保存好的乳酸菌接种于含0.1%肌酐和0.05%尿素的MRS培养基中，40℃厌氧培养48h，取上述富集培养液进行梯度稀释，取10^-5、10^-6、10^-7的稀释液，涂布于含0.1%肌酐0.05%尿素的MRS培养基中，于40℃厌氧培养48h，挑取生长状况良好的菌株分离纯化，并编号保存。将保存好的乳酸菌连续驯化20次，将最终筛选得到可以在0.1%肌酐/0.05%尿素的MRS培养基中稳定存活的菌株，将菌株编号保藏；最后是乳酸菌的富筛，将保存好的菌株按前述方法活化并涂布于含0.1%肌酐/0.05%尿素的MRS培养基中，于40℃厌氧培养48h，挑取生长状况良好的菌株接种于含0.1%肌酐0.05%尿素的MRS培养基中，碱性苦味酸法测定肌酐的降解率，二乙酰一肟显色法测定尿素氮降解率，选取降解率高的一株菌株编号并保藏，其肌酐降解率达25%，尿素降解率达30%。 

同时，对筛选得到的降解肌酐乳酸菌进行了生理生化鉴定和16S rDNA序列分析鉴定，其16S rDNA序列如序列表SEQ ID No:1所示。 

根据该菌株16S rDNA序列的测序结果，其与已报道的德氏乳杆菌，保加利亚亚种（GenBank.No.CP000156）序列同源性达98%，根据上述结果，确定该菌株属于乳杆菌属的德氏乳杆菌保加利亚亚种（Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus），该菌株具有降低肌酐和尿素的能力，于2013年8月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物生物中心，保藏编号为CGMCC No.7983，保藏单位地址位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。 

本发明的另一个目的是提供所述的菌株在制备保健食品或功能性食品中的应用。 

本发明的另一个目的是提供所述的菌株在制备用于治疗慢性肾衰竭的药物中的应用。 

附图说明

图1基于保加利亚乳杆菌CGMCC No.7983菌株的16S rDNA序列为基础的系统发育树。 

图2保加利亚乳杆菌CGMCC No.7983菌株的菌落形态（图A）和菌体形态（图B） 

具体实施方式

实施例1.降解肌酐和尿素的乳酸菌的筛选 

⑴乳酸菌的富集培养。选择10ml内蒙古地区富含乳酸菌的酸牛奶，加入到100mlMRS液体培养基进行富集培养，40℃静置培养24h，取10ml加入200ml含0.1%肌酐和0.05%尿素的MRS培养基中，40℃静置培养24h，得富集培养液。 

所述的MRS培养基：葡萄糖2%、蛋白胨1%、酵母粉1%、牛肉膏1%、乙酸钠0.5%、柠檬酸三铵0.2%、吐温-800.1%、MgSO₄0.03%、MnSO₄0.002%、K₂HPO₄0.2%，pH6.8。 

⑵乳酸菌的初步分离纯化。取1ml上述富集培养液用PBS缓冲液进行梯度稀释，取10^-5、10^-6、10^-7的稀释液，涂布于溴甲酚紫脱脂乳平板上，于40℃厌氧培养48h，挑取肉眼可见、产酸（培养基颜色变黄）的菌落分离纯化，编号接种于0.1%肌酐和0.05%尿素MRS固体培养基斜面保存。 

所述的PBS缓冲液：Na₂HPO₄0.12%、NaH₂PO₄·2H₂O0.03%、NaCl0.9%、吐温-800.05%。 

所述的溴甲酚紫脱脂乳培养基平板：溴甲酚紫0.01%、脱脂乳10%。 

0.1%肌酐和0.05%尿素MRS固体培养基平板：葡萄糖2%、蛋白胨1%、酵母粉1%、牛肉膏1%、乙酸钠0.5%、柠檬酸三铵0.2%、吐温-800.1%、MgSO₄0.03%、MnSO₄0.002%、K₂HPO₄0.2%、肌酐0.1%、尿素0.05%，pH6.8。 

⑶乳酸菌的驯化。取保存好的乳酸菌斜面，用接种环挑取1环，接种于50ml含0.1%肌酐和0.05%尿素的MRS培养基中，40℃厌氧培养24h，取1ml上述富集培养液进行梯度稀释，取10^-5、10^-6、10^-7的稀释液，涂布于0.1%肌酐和0.05%尿素MRS固体培养基中，于40℃厌氧培养48h，挑取生长状况良好的单克隆菌株接种于0.1%肌酐和0.05%尿素MRS固体培养基斜面，编号保存。将保存好的乳酸菌重复步骤3连续驯化20次，将最终筛选得到可以在0.1%肌酐和0.05%尿素的MRS培养基中稳定存活的菌株，将菌株接种于0.1%肌酐和0.05%尿素MRS固体斜面编号保藏。 

⑷乳酸菌的富筛，取保存好的乳酸菌斜面，用接种环挑取1环，接种于50ml含0.1%肌酐和0.05%尿素的MRS培养基中，40℃厌氧培养24h，取1ml上述富集培养液进行梯度稀释，取10^-5、10^-6、10^-7的稀释液，涂布于0.1%肌酐和0.05%尿素MRS固体培养基 中，于40℃厌氧培养48h，观察生长状况良好的菌株并编号，用接种环挑取编号菌株接种于50ml含0.1%肌酐和0.05%尿素的MRS培养基中并编号，同时接种于0.1%肌酐和0.05%尿素MRS固体培养基斜面编号并保存，碱性苦味酸法测定肌酐的降解率，碱性苦味酸法使用德国罗氏诊断有限公司生产的肌酐检测试剂盒（苦味酸法），按试剂盒说明书所示方法进行操作。采用二乙酰一肟显色法测定尿素氮降解率，具体方法如下：酸性试剂5ml加入0.5ml二乙酰一肟为工作液，工作液加入0.02ml样品测定样品浓度，加入0.02ml水为空白，加入0.02ml尿素标准液为标准样。混匀后，沸水浴15min，取出放置冷水中冷却5min，在540nm下测定吸光度。计算方法：尿素浓度=A_样品/A_标准×5 

检测结果如表1所示： 

表1.肌酐和尿素测定结果 

其中15号菌株降解率较高，其肌酐降解率达25%，尿素降解率达30%，该菌株具有降低肌酐和尿素的能力，于2013年8月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物生物中心，保藏编号为CGMCC No.7983。 

实施例2.筛选菌株的鉴定 

⑴形态学描述 

在MRS固体培养基上菌落为圆形、光滑、乳白色，边缘清晰，呈粘液状，菌体很容易被挑起。菌体在放大400倍的显微观察下，革兰阳性、呈短杆状，如图2所示。 

⑵生理生化鉴定 

革兰阳性，不发酵乳酸盐，不液化明胶，不分解酪素，不产生吲哚和硫化氢，接触酶阴性，无细胞色素，联苯胺反应阴性，糖发酵试验如表2所示： 

表2.菌株的生理生化鉴定结果 

⑵16S rDNA序列分析鉴定 

对该菌株的16S rDNA进行测序，其序列如SEQ ID No.1所示，其与已报道的德氏乳杆菌，保加利亚亚种（GenBank.No.CP000156）序列同源性达98%。根据上述结果，该菌株被鉴定为保加利亚乳杆菌（Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus）。 

以上实施例进一步说明了本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。