一种线虫凋亡调控基因ced-4诱导启动子、水稻表达载体及其制备方法

摘要

本发明公开了一种线虫凋亡调控基因ced-4诱导启动子wn-2、水稻表达载体pCA-Wn-2-CED-4及pCA-Wn-2-CED-4表达载体的制备方法。本发明利用已经被报道的W-box系列启动子中诱导效果最佳的核心序列，在其中加入动植物基因共享的TATA-box核心序列，创新设计了线虫体细胞凋亡基因在水稻表达的新的wn-2序列。将wn-2和水稻表达载体的固有启动子融合，构建成了新的水稻表达载体pCA-Wn-2-CED-4表达载体，具有诱导目的基因ced-4在水稻表达的优越效果，已筛选到连接正确的载体克隆，并且成功转化到水稻品种：日本晴和丽江新团黑谷。

说明书

技术领域

本申请属于生物技术领域，具体涉及一种线虫凋亡调控基因ced-4诱导启动子、水稻 表达载体及其制备方法。

背景技术

由于线虫细胞凋亡调控基因ced-4在水稻体内不存在，ced-4基因能否在水稻中顺利启 动而成功表达目的蛋白，对启动子的科学设计至关重要；即动物体的基因在植物体进行 表达，必须解决启动子在线虫与水稻之间的兼容性问题，而且还需要是病原物侵染诱导启 动基因表达，这就是本专利的技术目标。

从国内外最新的相关研究文献来看，由病原物侵染诱导在单子叶水稻的启动子及其表 达载体，未见详细报道。

诱导启动子W-box已经在烟草等双子叶植物研究并且在病原物侵染成功诱导表达，但 是在水稻中它启动诱导目的基因ced-4的表达载体尚未有报道。

发明内容

本发明旨在克服现有技术的不足，提供一种线虫凋亡调控基因ced-4诱导启动子、水 稻表达载体及其制备方法。

为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为：

本发明设计了一种线虫凋亡调控基因ced-4诱导启动子wn-2，所述诱导子wn-2序列 如SEQ ID NO.1所示，具体为：

TTCTAGCCACCAGATTTGACCAAACCATCAACTCATCTGTATATAATA。

本发明设计了一种水稻表达载体，所述水稻表达载体包括wn-2启动子，所述水稻表 达载体的序列如SEQ ID NO.2所示，命名为pCA-Wn-2-CED-4表达载体。

本发明还提供了pCA-Wn-2-CED-4表达载体的制备方法，所述制备方法如下：

（1）将启动子wn-2和P35S（SEQ ID NO.7）克隆至pCAMBIA1305.1载体（pCAMBIA1305.1 载体为市售）（wn-2位于P35S前面），得到中间载体pCA-Wn-2，扩增Wn-2-P35S融合产 物的引物如下：

Wn-2-P35S-FP:

AAAGAATTC-TTCTAGCCACCAGATTTGACCAAACCATCAACTCATCTGTATATAATAT  GGAGTCAAAGATTCAAATAGAGGACC（SEQ ID NO.3）；

Wn-2-P35S-RP:

AAAACTAGTCTGCAGAGTCCCCCGTGTTCTCTCCA（SEQ ID NO.4）；

具体过程是：通过EcoRI和SpeI位点插入到pCAMBIA1305.1载体中的EcoRI和SpeI（p35S 启动子前和GUS前端部分），得到中间载体pCA-Wn-2；

（2）将目的基因ced-4克隆至pCA-Wn-2载体（通过PstI和PmlI位点），即得所述水稻表达载 体，命名为pCA-wn-2-CED-4表达载体；

扩增CED-4的引物如下：

Ced-4FP:

AAACTGCAGATGCTCTGCGAAATCGAATGC（SEQ ID NO.5）；

Ced-4RP:

AAAACTAGTTTAACAGCATGCAAAATTTTTGAGGG（SEQ ID NO.6）。

本发明方法设计的具体克隆方式及酶切等步骤均为本领域常规实验操作。

下面对本发明作进一步解释：

由于CED-4是线虫细胞凋亡主要调控基因表达的蛋白，因此必须考虑这个调控基因如 何在水稻中启动表达蛋白。

为了解决启动子在线虫和水稻两者的兼容性问题，经过设计和无数次的实验筛选和验 证，在前人报道的W-box基础上，本发明加入了动物和植物均共享的启动子TATA-box序 列，以图在水稻上诱导顺利启动目的基因ced-4，表达线虫细胞凋亡蛋白CED-4。经过从 多个改造的W-TATA-box启动子中，筛选到的诱导启动子：wn-2启动子，诱导目的基因ced-4 在水稻表达CED-4效果明显。

本发明构建了以wn-2启动子为基础的表达载体，转化水稻获得转基因水稻，转化水 稻苗根部在寄生线虫侵染时可诱导水稻表达CED-4蛋白。

本发明的表达载体转化水稻的转化苗，在水稻寄生线虫侵染时成功诱导ced-4基因的 表达。

目前，国内外研究表明TIR结构域蛋白仅发现在双子叶植物存在，其表达也具有相应 的启动子，如在拟南芥表达；但在单子叶水稻中尚未发现有TIR结构域蛋白的表达。线虫 细胞凋亡TIR结构域蛋白基因，在表达载体中目的基因之前32—45个碱基处加入w-box 诱导序列，在病原线虫侵染时，目的基因启动子可以应答对寄生线虫侵染伤口时启动反应， 诱导目的基因表达蛋白增强。因此，进行这一类诱导启动子的设计在理论研究和实际应用 中均具有很大的价值。

总之，本发明利用已经被报道的W-box系列启动子中诱导效果最佳的核心序列，在其 中加入动植物基因共享的TATA-box核心序列，创新设计了线虫体细胞凋亡基因在水稻表 达的新的wn-2序列。将wn-2和水稻表达载体的固有启动子融合，构建成了新的水稻表达 载体pCA-Wn-2-CED-4表达载体，具有诱导目的基因ced-4在水稻表达的优越效果，已筛 选到连接正确的载体克隆，并且成功转化到水稻品种：日本晴和丽江新团黑谷。

附图说明

图1为pCA-Wn-2-CED-4表达载体酶切图；

图2为蛋白杂交检测水稻表达目的蛋白CED-4的电泳图；图中：泳道1、3为诱导启 动子wn2载体转化日本晴接种线虫，2、4为wn2载体转化日本晴未接种线虫；M为蛋白 Marker，9为Wn2载体转化丽江苗接种线虫。

具体实施方式

实施例1

所述wn-2启动子序列如SEQ ID NO.1；

将启动子wn-2和P35S（SEQ ID NO.7）克隆至pCAMBIA1305.1载体（wn-2位于P35S 前面），得到中间载体pCA-Wn-2，扩增Wn-2-P35S融合产物的引物如下：

Wn-2-P35S-FP:

AAAGAATTC-TTCTAGCCACCAGATTTGACCAAACCATCAACTCATCTGTATATAATAT  GGAGTCAAAGATTCAAATAGAGGACC（SEQ ID NO.3）；

Wn-2-P35S-RP:

AAAACTAGTCTGCAGAGTCCCCCGTGTTCTCTCCA（SEQ ID NO.4）；

具体过程是：通过EcoRI和SpeI位点插入到pCAMBIA1305.1载体中的EcoRI和SpeI（p35S 启动子前和GUS前端部分），得到中间载体pCA-Wn-2；

将目的基因ced-4克隆至pCA-Wn-2载体（通过PstI和PmlI位点），即得所述水稻表达载 体，命名为pCA-wn-2-CED-4表达载体，pCA-wn-2-CED-4表达载体序列如SEQ ID NO.2所 示；

扩增CED-4的引物如下：

Ced-4FP:

AAACTGCAGATGCTCTGCGAAATCGAATGC（SEQ ID NO.5）；

Ced-4RP:

AAAACTAGTTTAACAGCATGCAAAATTTTTGAGGG（SEQ ID NO.6）。

实施例2水稻表达载体的验证

构建的水稻表达载体，通过实验各种处理，实验设计及其诱导作用实验步骤及结果如 下：

（1）转基因水稻苗接种水稻潜根线虫。

（2）检测水稻根部表皮细胞凋亡和过敏性反应表型，见染色检测结果统计表。

（3）转基因目的基因表达蛋白CED-4检测，见说明书附图。

染色测定水稻根部细胞过敏反应方法：

水稻根部分别染色15min后以流水充分冲洗去除未结合染料，在50℃下用20mL含50% 甲醇和1%SDS的溶液抽提与死细胞结合的染料30min，测定抽提液光吸收值，溴酚蓝染 色的测定波长为595nm。

具体测定内容为：

(a)精确称量不同处理水稻和对照处理的根部组织，每个处理重复3次，每个样品随机取 10条水稻根，取相同品种野生型的水稻10条根，甲醇处理15min水稻根部细胞，分别用相 同浓度溴酚蓝染色后测定，测定比较不同处理在接种水稻寄生线虫之后对根部表皮发生细 胞凋亡的影响；接种水稻潜根线虫的影响（各处理分别接种水稻潜根线虫，在常温22℃的 光照培养箱，根部在500条有活力的潜根线虫水溶液接种96小时之后），与未接种线虫的样 品分别染色检测比较；

（b）用甲醇或乙醇处理，或煮沸处理水稻细胞不同时间后，再用0.03%溴酚蓝染色测定， 比较不同处理（野生型、诱导载体、非诱导载体；接种线虫与不接种线虫）水稻根部表皮 细胞发生凋亡数量的差异；

（c）用可见-紫外分光光度计(UV-6100和Perkin Elmer Lambda35)对不同处理溴酚蓝 染色并且洗脱之后进行波长(595nm)扫描检测，记录结果进行分析。

（d）对这些同样数量的水稻根部样品进行染色，测定表皮细胞凋亡的数量，计算各处理 表皮细胞凋亡的发生率。

（e）按公式计算：细胞凋亡发生率(%)=(OD595处理-OD595对照)/(100-OD595对照校正 值)×100%计算。

（f）已知的野生型水稻表皮活细胞，在线虫侵染过程中发生细胞损伤均会增加染色测定的 结果值。

（g）不同水稻（日本晴）处理在不接种线虫、接种线虫情况下的表皮细胞染色处理的检 测结果如下：

表1 各处理未接种线虫的检测结果

表2 各处理接种水稻潜根线虫的检测结果