一种猪肠道组织中白细胞介素17荧光定量PCR检测方法

摘要

本发明涉及一种猪肠道组织中白细胞介素17荧光定量PCR检测方法。该方法包括设计特异性荧光定量PCR引物，建立荧光定量PCR反应体系和反应程序，制备含有目的片段IL-17的质粒作为标准质粒绘制标准曲线，最后待测样品的目的基因和内参基因GAPDH同时扩增，根据相对定量△△C

说明书

技术领域

本发明涉及一种猪肠道组织中白细胞介素17荧光定量PCR检测方法，属于生物技术领域。

背景技术

白细胞介素17（IL-17）是一种重要的促炎症细胞因子，由辅助性T细胞（Th17）及先天性免疫细胞等分泌，在多种炎性反应及自身免疫性疾病病理过程中发挥关键作用。

在动物体内微环境作用下，幼稚型T细胞可分化为Th1，Th2，Th17，Th22，滤泡辅助性T细胞和Treg细胞亚型。其中Th17细胞是一种能够分泌IL17细胞因子的独特亚型。IL-17是一种由Th17细胞，自然杀伤性T细胞，γσT细胞等表达的促炎性细胞因子，在自身免疫性疾病及多种炎性反应中发挥关键作用。人类IL-17相关研究表明，该因子是联系天性免疫反应与获得性免疫反应重要桥梁，并对二者均有有效地促进作用。猪的IL-17因子于2004年由Katoh等人克隆并描述后，也成为猪免疫学研究检测的重要指标之一。猪的消化道是营养学与病理学研究的重要组织部位，对猪肠道部位IL-17进行精确定量可有助于我们对被检猪只免疫状态及其疾病过程分析提供有力的理论数据支持。

目前，检测细胞因子的常用方法主要分为从蛋白水平和基因水平检测两种。蛋白水平的检测包括：（1）流式细胞术，主要是利用荧光标记的抗细胞因子抗体标记表达该细胞因子的细胞，再通过流式细胞仪用单细胞分析的方式从蛋白水平检测。此方法虽特异性强，但操作过程繁琐代价较高，难于推广。（2）Western-blot方法，即通过酶标的抗细胞因子抗体与固定到变性凝胶上的蛋白样品进行杂交，该方法多用于定性检测，用于定量时操作水平要求较高，精确度较低。（3）ELISA方法，该方法主要用于检测分泌型的细胞因子，例如血清中的蛋白水平，难以反应细胞内的情况。基因水平的检测包括普通聚合酶链式反应（PCR）技术与实时荧光定量PCR技术。常规PCR由于灵敏度较低也仅常用于定性检测，而荧光定量PCR具有灵敏度高，且实时、定量、快速等特点。常用荧光定量PCR技术又分为荧光探针法（TaqMan探针技术）与荧光染料法（SYBRGreen法）。与TaqMan技术相比，SYBR Green法实验设计简单，无需设计多个探针即可快速检测多个基因，初始成本更低，通用性好。然而，目前关于用染料法检测猪肠道的白细胞介素-17的荧光定量的检测方法却鲜有报道。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供一种猪肠道组织中白细胞介素17转录本荧光定量PCR检测方法。

首先，本发明提供一种白细胞介素17转录本荧光定量PCR引物，正向引物具有SEQ ID No.1所示的序列，反向引物具有SEQ IDNo.2所示的序列。

进一步地，本发明还提供一种猪肠道组织中白细胞介素17转录本荧光定量PCR检测方法，其为将肠道样品制备成cDNA，用所述的引物进行荧光定量PCR反应。

在本发明一个具体实施方案中，所述猪肠道组织中IL-17转录本荧光定量PCR检测方法包括如下步骤：首先设计前述的特异性荧光定量引物，然后建立实时定量PCR反应体系和反应程序，制备含有目的片段的质粒作为标准质粒绘制标准曲线，最后将待测样品的目的基因IL-17与内参基因GAPDH同时扩增，根据相对定量△△C_T方法确定目的基因的表达变化。

本发明检测方法中，每20μl的荧光定量PCR反应体系如下：10μl荧光定量PCR预混液，5μmol/L正向引物、反向引物各0.5μl，2μl标准质粒或样本cDNA，用水补足至20μl。

本发明检测方法中，PCR反应程序如下：50℃2min，95℃10min，95℃15sec，60℃1min，扩增40个循环，最后95℃15sec，60℃1min，95℃30sec作熔解曲线。

本发明还提供一种猪肠道白细胞介素17转录本荧光定量PCR检测试剂盒，其含有所述的荧光定量PCR引物。优选地，本发明提供的试剂盒还可以含有本领域常规的荧光定量PCR所需的其他试剂。该试剂盒可实现对猪肠道部位IL-17进行精确定量，并有助于对被检猪只免疫状态及其疾病过程分析提供有力的理论数据支持。

本发明采用荧光定量PCR技术提供了一种能够实时、准确、快速检测猪肠道组织中白介素17（IL-17）的检测方法，从而填补了该细胞因子在猪肠道中检测方法方面的空白。本发明可实现对猪肠道部位IL-17进行精确定量，并有助于对被检猪只免疫状态及其疾病过程分析提供有力的理论数据支持。

附图说明

图1为荧光定量PCR标准品扩增的熔解曲线。图中横坐标代表解链温度，纵坐标代表相对荧光强度，图中不同颜色的曲线A、B、C、D、E、F、G、H代表标准品拷贝数10⁷、10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²拷贝数/μl及以DEPC处理水作为模版的空白对照的熔解曲线。

图2为荧光定量PCR标准品扩增的荧光信号图，图中横坐标代表循环数，图中纵坐标代表相对荧光强度，图中的不同颜色的曲线A、B、C、D、E、F、G、H代表标准品拷贝数10⁷、10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²拷贝数/μl及以DEPC处理水作为模版的空白对照的荧光信号。

图3为荧光定量PCR扩增的标准曲线y=－3.243log(conc)+22.67。图中横坐标代表标准质粒的拷贝数（拷贝/μl），纵坐标代表循环数。

图4是利用本发明所述实时定量PCR方法检测猪肠道部位IL-17表达水平的结果；其中A为回肠部位IL-17表达水平检测结果，B为结肠部位IL-17表达水平检测结果。

图5是利用ELISA方法检测猪肠道部位IL-17表达水平的结果；其中A为回肠部位IL-17表达水平检测结果，B为结肠部位IL-17表达水平检测结果。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

动物组织总RNA提取试剂盒（天根生化科技（北京）有限公司），反转录试剂盒（Thermo公司）、PowerGreen PCR Master Mix（ABI公司），PCR Mixture、pMD18-T、感受态细胞DH5α（TakaRa公司）。

实施例1制备含IL-17目的基因的标准曲线

一、引物设计与合成

先从http://www.ncbi.nlm.nig.gov/GenBank中查找猪IL-17序列（AB102693.1），然后根据猪IL-17mRNA保守序列（CDS区域），利用Perlprimer软件设计引物送上海英骏生物工程有限公司合成。引物、模板序列如下：

正向引物：5’-CTGGAGAAAGTGATGGTGAC-3’（SEQ IDNo.1）；

反向引物：5’-CCTGAAAGCCTAACTGATTTGG-3’（SEQ IDNo.2）；

模板（SEQ ID No.3）：

5’-CTGGAGAAAGTGATGGTGACAGTGGGCTGCACCTGTGTCACCCCCATCGTCCGCCATATTTCTTAAGAGCTTCTAGTCTGACCCCTGCTCCCCAAATCAGTTAGGCTTTCAGG-3’。

二、不同处理的仔猪肠道样品的采集

为检测干酪乳杆菌Lactobacillus casei Zhang在日粮中添加后对仔猪肠道IL-17表达水平的影响，本试验采用单因素随机试验设计，选取64头14日龄左右的杜×长×大仔猪，每组4个重复，每个重复8头猪。试验分为2个处理组：1)对照组，饲喂基础日粮（不添加抗生素和益生菌）；2）益生菌组，饲喂基础日粮并添加益生菌（干酪乳杆菌Lactobacillus casei Zhang，10⁷CFU/头/天）；试验全过程共28d。试验结束时每个重复随机选取一头仔猪采取肠道组织。

三、提取猪肠道组织总RNA

将采集的猪肠道组织样品取约10mg，加入RNA样本保存液，然后按照RNA提取试剂盒说明提取总RNA。

四、反转录猪肠道RNA

利用反转录试剂盒将上述猪肠道总RNA反转录成cDNA。反转录方法为：0.5μg total RNA、1μl random hexamer primer、其余用RNase Free H₂0补足至12μl，在65℃反应5min；将上述反应体系加入4μl5×Reaction Buffer、1μl RiboLock RNase Inhibitor(20U/μl)、2μl10mM dNTP Mix、1μl RevertAid M-MulLV ReverseTranscriptase(200U/μl)、其余用RNase Free H₂0补足至12μl，于PCR仪上25℃5min、42℃60min、70℃5min。

五、构建标准质粒

在20μl反应体系中以前述的2μl cDNA为模版，加入10μl荧光定量PCR预混液、5μmol/L前述正向引物、反向引物各0.5μl、ddH₂O补足至20μl。PCR反应程序如下：50℃2min，95℃10min，95℃15sec，60℃1min，扩增30个循环。PCR反应结束后取5μl产物用2%琼脂糖凝胶进行电泳，最后EB染料染色，凝胶图像分析仪上观察。

T-A克隆：PCR产物经纯化后，同pMD18-T载体按一定的比例混合，于16℃连接30min，然后该连接产物转化感受态细胞DH5α菌。根据蓝白斑筛选挑取阳性克隆。然后用碱裂解法抽提质粒，通过PCR和酶切鉴定，如鉴定阳性，则送公司测序。

稀释标准质粒：测定上述测序正确的阳性质粒的核酸浓度，并计算出拷贝数/μl，然后将阳性质粒先稀释成1×10¹⁰拷贝/μl，然后按10倍依次倍比稀释成1×10⁹、1×10⁸、1×10⁷、1×10⁶、1×10⁵、1×10⁴、1×10³、1×10²拷贝/μl。

六、制定标准曲线

以上述稀释的标准质粒作为模版，利用SYBR GreenⅠ能嵌合到双链DNA，结合荧光定量PCR仪能够实时检测荧光强度的特点来制定标准曲线。荧光定量PCR反应体系如下：在20μl反应体系中加入稀释的标准质粒各2μl、10μl Power Green PCR MasterMix，5μmol/L正向引物、反向引物各0.5μl，2μl标准质粒或样本cDNA，补充DEPC处理水至20μl。在ABI7500荧光定量PCR仪上进行扩增，扩增条件为50℃2min，95℃10min,95℃15sec,60℃1min，扩增40个循环。最后进行熔解曲线分析以确定PCR反应的特异性。

标准品的熔解曲线图参见图1，标准品的荧光信号图参见图2，标准品的标准曲线图参见图3。

实施例2样本猪肠道组织中IL-17基因表达的检测

一、猪肠道样品按前述的方法制备成cDNA，然后与内参基因GAPDH同时进行PCR反应，最后根据相对定量△△C_T方法确定样本中IL-17基因相对表达量。

4头空白组（Control）和4头益生菌组（Lc Zhang）仔猪回肠和结肠组织中IL-17转录本相对表达量（以GAPDH作为内参基因）的检测结果如下表：

二、通过ELISA方法检测猪肠道部位IL-17表达水平与荧光定量PCR方法检测结果进行对比。

采集猪肠道组织样品10mg，并加入200μl含5mM DTT,1mMPMSF的磷酸盐缓冲液（即PBS溶液：NaCl137mmol/L，KCl2.7mmol/L，Na₂HPO₄10mmol/L，KH₂PO₄2mmol/L，pH值为7.2-7.4）；超声波裂解（裂解参数：开2秒，停3秒；26%功率）后，20000g离心30分钟；取上清液包被于96孔酶标反应板，并用抗猪IL-17抗体（PY-10007，Thermo）和HRP标记的羊抗鸡IgG（6100-05，SouthernBiotech）进行IL-17表达水平的检测，读取各孔OD值。检测结果计算公式SI=（待测孔OD值－空白对照孔OD值）/（阴性对照孔OD值－空白对照孔OD值）。4头空白组和4头益生菌组仔猪回肠和结肠组织中IL-17相对表达量的ELISA检测结果如下表：

附图4是利用本发明所述实时定量PCR方法检测猪肠道部位IL-17表达水平的结果；其中A为回肠部位IL-17表达水平检测结果，B为结肠部位IL-17表达水平检测结果。

附图5是利用ELISA方法检测猪肠道部位IL-17表达水平的结果；其中A为回肠部位IL-17表达水平检测结果，B为结肠部位IL-17表达水平检测结果。

综合上述实验结果，在日粮中添加干酪乳杆菌Lactobacillus caseiZhang具有使肠道部位IL-17表达水平上调的趋势。根据实时定量PCR和ELISA两种检测方法的对比效果来看，用本发明所述的引物进行实时定量PCR检测回肠部位的IL-17表达水平时，试验组与对照组差异更为显著，这也体现了该方法具有更强的敏感性。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。