重组犬流感病毒毒株、其制备方法及由其制备得到的疫苗

摘要

本发明公开了一种重组犬流感病毒毒株、其制备方法及由其制备得到的疫苗。该重组犬流感病毒包含：H3N2亚型犬流感病毒的HA和NA基因，以及H9N2禽流感病毒的PB2、PB1、PA、NP、M和NS六个内部基因。本发明的一种犬流感重组病毒毒株、命名为rH3N2-DL，该毒株的保藏号为CGMCC No.8162。本发明还公开了该犬流感重组病毒的制备方法以及由其制得的疫苗。与亲本株相比，本发明的犬流感重组病毒在鸡胚和MDCK细胞上均能产生很高的病毒滴度和血凝效价。动物实验结果表明由本发明的犬流感重组病毒制得的疫苗具有良好的免疫原性和保护效力。

说明书

技术领域

本发明涉及一种重组病毒株，尤其涉及一种犬流感重组病毒、其制备方法及由其 制备得到的疫苗。本发明属于生物工程技术领域。

背景技术

犬流感（Canine influenza，CI）是由正黏病毒科、流感病毒属的A型流感病毒中 的犬流感病毒（Canine influenza virus，CIV）引起的犬的一种呼吸道急性高度接触性 传染病，多呈暴发性流行，传播非常迅速而且广泛。

目前流行的犬流感主要是由H3N8亚型和H3N2亚型犬流感病毒引起的。H3N8 亚型犬流感是由马流感病毒跨种传播而导致，主要在国外流行，我国尚没有马流感病 毒感染犬的报道。自2006年以来，在我国江苏、广东、北京、浙江和辽宁等地相继发 生了禽源H3N2亚型流感病毒感染犬并导致犬发生严重呼吸道疾病的事件，血清学调 查发现犬群中禽源H3N2犬流感的阳性率达到10%以上，表明H3N2CIV在犬群中已 经占据了一定的生态地位，具有普遍流行的特征。禽源H3N2CIV不仅可以感染犬， 而且可以感染雪貂和猫，表明该病毒已经跨越种间障碍，具备了感染哺乳动物的能力。 而犬是一种伴侣动物，与人之间的接触非常密切，这也增加了人感染H3N2CIV的风 险。

疫苗是防控病毒性传染病的有效手段，而H3N2CI是犬的新发传染病，目前国内 外尚没有预防该病的疫苗。因此研发一种拥有我国自主知识产权、保护性良好的新型 高效CI疫苗具有重要的公共卫生学意义。

发明内容

本发明目的之一是提供一株重组犬流感病毒（CIV），其包含H3N2亚型CIV的 HA和NA基因、以及H9N2亚型禽流感病毒（AIV）的6个内部基因。

本发明目的之二是提供一种上述重组犬流感病毒的制备方法。

本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的：

本发明的一株重组犬流感病毒（CIV），是通过以下方法制备得到的：

（1）将H3N2亚型犬流感病毒的HA基因插入到流感基因转录/表达双向载体中， 获得含犬流感病毒HA基因的重组质粒；

（2）将H3N2亚型犬流感病毒的NA基因插入到流感基因转录/表达双向载体中， 获得含犬流感病毒NA基因的重组质粒；

（3）将H9N2亚型禽流感病毒的六个内部基因PB2、PB1、PA、NP、NS和M分 别插入到流感基因转录/表达双向载体中，分别获得含有各基因的重组质粒；

（4）将以上获得的8个重组质粒共转染293T细胞和MDCK细胞共培养细胞单 层，转染后的细胞经培养后，反复冻融3次，使细胞裂解，释放出病毒粒子，将含有 细胞裂解物的培养液离心后，取上清液接种SPF鸡胚，培养2-3天后，取鸡胚尿囊液， 检测其血凝活性，获得重组犬流感病毒。

在本发明中，优选的，所述的流感基因转录/表达双向载体为pHW2000。

在本发明中，优选的，所述的H3N2亚型犬流感病毒的HA基因的核苷酸序列如 SEQ ID NO.1所示，或与SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列具有95%以上同源性的核苷 酸序列。

在本发明中，优选的，所述的H3N2亚型犬流感病毒的NA基因的核苷酸序列如 SEQ ID NO.2所示，或与SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列具有95%以上同源性的核苷 酸序列。

在本发明中，优选的，所述的H9N2亚型禽流感病毒的六个内部基因PB2、PB1、 PA、NP、NS和M的核苷酸序列分别为SEQ ID NO.3-8所示，或与SEQ ID NO.3-8 所示的核苷酸序列具有95%以上同源性的核苷酸序列。

在本发明的一个具体实施例中，将得到的一株重组犬流感病毒命名为rH3N2-DL， 分类命名为：H3N2犬流感病毒；保藏时间是：2013年9月6日；保藏单位是：中国 微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号 院3号，中国科学院微生物研究所，其保藏号为CGMCC No.8162。

本发明的目的之三在于提供该重组CIV在制备预防或治疗犬流感药物，特别是犬 流感疫苗中的应用。

实验证明，本发明的重组CIV，在鸡胚和MDCK细胞上均能产生比亲本毒株高很 多倍的病毒滴度和血凝滴度，可作为研制犬流感疫苗的优良种毒。

本发明的一种犬流感疫苗，其特征在于由下述方法制备：用以上任一项所述的重 组CIV接种SPF鸡胚或MDCK细胞，收获鸡胚尿囊液或细胞培养上清，灭活，乳化， 即得。

进一步的，本发明还提出了一种疫苗组合物，其特征在于包含所述的犬流感疫苗， 以及药物学上可接受的载体、佐剂或赋形剂等。

从免疫效力试验结果可以看出，用本发明获得的重组犬流感病毒制备得到的灭活 疫苗免疫犬后能够对H3N2犬流感病毒强毒攻击提供100%的保护。由此可见，本发明 重组犬流感病毒制备的灭活疫苗具有良好的免疫原性，可有效预防或治疗犬流感，是 理想的疫苗候选毒株。

附图说明

图1是本发明实施例1重组CIV rH3N2-DL的制备流程图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明，本发明的优点和特点将会 随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限 制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技 术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1本发明重组CIV rH3N2-DL的拯救

1、H3N2亚型犬流感病毒HA和NA基因的RT-PCR扩增

使用Axygen柱式病毒RNA提取试剂盒提取H3N2亚型犬流感病毒 A/Canine/Liaoning/27/2012(H3N2)株(简称CIV LN27，中国农业科学院哈尔滨兽医研 究所兽医微生物菌种保藏中心保藏)的RNA，具体步骤参见试剂盒说明书。以A型流 感病毒反转录通用引物Uni-12：5’-AGCAAAAGCAGG-3’为反转录引物制备LN27 cDNA，反转录体系如下：DEPC H2O19.0μL、LN27RNA5.0μL、AMV RT buffer8.0μL、 2.5mmol/L dNTP mixture4.0μL、Uni-12通用引物2.0μL、RNase Inhibitor1.0μL和AMV Reverse Transcriptase1.0μL，总体积40.0μL。将上述反转录体系混匀，室温静置10min 后，放于42℃水浴锅中反转录1h，然后将反转录产物立即冰浴静置2min，随后使用 或置于-20℃保存。以CIV LN27cDNA为模板，用HA和NA基因的特异性引物（表 1）分别进行PCR扩增。PCR反应体系为：10×PCR buffer10.0μL、Ex Taq酶0.5μL、 2.5mmol/L dNTP mixture2.0μL，10pmol/L HA或NA基因上、下游引物各1.0μL、cDNA 模板2.0μL和ddH2O83.5μL，总体积100.0μL。PCR反应程序如下：94℃预变性5min、 94℃变性30sec、53℃退火45sec、72℃延伸2min、72℃后延伸10min，共计30个循 环。同时设无模板的阴性对照。反应结束后，PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳鉴定大 小。结果：有2条PCR条带出现，大小分别为HA1.7kb和NA1.4kb，与预期的相符。

表1扩增CIV HA和NA基因的特异性引物

2、HA和NA基因的酶切

HA和NA基因的纯化：首先根据CIV HA和NA基因的大小，找出目的HA和 NA基因片段，然后将目的基因片段从琼脂糖凝胶上切下来，置于离心管中进行纯化， 具体试验方法参见试剂盒说明书进行。

HA和NA基因以及载体的酶切：将纯化后的HA和NA基因分别用BsmBⅠ和 BsaⅠ限制性内切酶进行酶切，pHW2000双向转录/表达质粒用BsmBⅠ进行酶切。体 系如下：HA基因和pHW2000质粒的BsmBⅠ酶切：ddH2O14.0μL/34.0μL、HA/pHW2000 30.0μL/10.0μL、10×NEB Buffer45.0μL、BsmBⅠ1.0μL和石蜡油50.0μL，总体积 100.0μL。55℃水浴8h后，HA基因酶切产物用PCR纯化试剂盒进行纯化；pHW2000 质粒酶切产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定完全切开后，用胶回收试剂盒进行纯化。NA基 因的BsaⅠ酶切：ddH2O14.0μL、NA30.0μL、10×NEB Buffer45.0μL、BsaⅠ1.0μL和 石蜡油50.0μL，总体积100.0μL。55℃水浴8h后，NA基因酶切产物用PCR纯化试剂 盒进行纯化。

3、HA和NA基因与载体的连接和转化：

在T4DNA连接酶作用下，将经限制性内切酶处理的HA和NA基因分别与线性 化的pHW2000进行连接，体系如下HA（BsmBⅠ△）和NA（BsaⅠ△）各10.0μL、 pHW2000（BsmBⅠ△）各5.0μL、10×T4DNA连接酶Buffer2.0μL、T4DNA连接酶 1.0μL和dd H2O2.0μL，总体积20.0μL。上述连接反应混合物置于16℃水浴锅中连接 过夜。将连接产物加入到TOP10感受态细胞中，轻轻混匀后，冰浴30min，42℃热激 90sec，立即冰浴2min，加入800μLSOC培养基，于37℃摇床内，震荡培养45min； 取出后于4000r/min离心2min；弃去大部分上清，留200μL重悬培养物，涂布于含 氨苄青霉素的LB琼脂平板上，37℃温箱过夜培养。

4、HA和NA基因重组质粒的鉴定

将菌落PCR初步鉴定为阳性的菌液分别接种于含氨苄青霉素的LB液体培养基 中，于37℃摇床振荡培养过夜。每个样品分别取1.5mL菌液提取质粒进行琼脂糖凝胶 电泳鉴定，并设有pHW2000质粒作为阴性对照。将进一步鉴定为阳性的重组质粒送 往北京华大基因公司测序鉴定。利用DNASTAR软件中Seqman程序进行序列拼接比 对，结果表明重组质粒pHWLN27-HA和pHWLN27-NA构建成功，HA基因的核苷酸 序列如SEQ ID NO.1所示，NA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

5、含有H9N2亚型禽流感病毒的PB2、PB1、PA、NP、M和NS六个内部基因的 重组质粒pHWDL-PB2、pHWDL-PB1、pHWDL-PA、pHWDL-NP、pHWDL-M和 pHWDL-NS的构建。

取含H9N2亚型禽流感病毒A/Goose/Dalian/34/2004(H9N2)株(简称AIV DL)的鸡 胚尿囊液（中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医微生物菌种保藏中心保藏)，使用 Axygen柱式病毒RNA提取试剂盒提取病毒RNA，具体步骤参见试剂盒说明书。采用 Uni-12引物：5’-AGCAAA AGCAGG-3’反转录合成病毒的cDNA，分别采用各基因片 段特异引物(Hoffmann et al,Arch Viro12001,146:2275-2289)PCR反应扩增获得流感 病毒6条内部基因片段，分别依次为PB2、PB1、PA、NP、NS和M（SEQ ID NO.3-SEQ  ID NO.8所示的核苷酸序列)，然后分别将其克隆入载体pHW2000（Hoffmann et al. Vaccine2002,20:3165-3170)，经酶切鉴定和序列测定，获得的重组质粒分别命名为： pHWDL-PB2、pHWDL-PB1、pHWDL-PA、pHWDL-NP、pHWDL-NS和pHWDL-M。

6、重组CIV的拯救

将含有CIV LN27HA和NA基因的重组质粒pHWLN27-HA和pHWLN27-NA以 及含有AIV DL病毒PB2、PB1、PA、NP、M和NS六个内部基因的重组质粒 pHWDL-PB2、pHWDL-PB1、pHWDL-PA、pHWDL-NP、pHWDL-M和pHWDL-NS 各1.0μg，通过脂质体Lipofectamine2000转染混合培养于六孔板中的293T和MDCK 细胞，具体方法见Lipofectamine2000转染说明书。转染的细胞培养72h后，将6孔培 养板置于-20℃冰箱中反复冻融3次，使细胞裂解，释放出病毒粒子。将含有细胞裂解 物的培养液3000r/min离心后，取上清200μl经尿囊腔接种5枚9-11日龄SPF鸡胚。 接种后72h收取鸡胚尿囊液，用1%鸡红细胞进行血凝试验，结果表明收集的鸡胚尿 囊液具有血凝活性，表明成功拯救出一株含有CIV LN27HA和NA基因的重组CIV， 命名为rH3N2-DL，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏 号为CGMCC No.8162。

7、重组CIV的鉴定

提取重组CIV rH3N2-DL的RNA，用A型流感病毒反转录通用引物Uni-12： 5’-AGCAAAAGCAGG-3’进行反转录，制备rH3N2-DL cDNA，用HA和NA基因特异 性引物分别进行PCR扩增，并用1.0%琼脂糖凝胶电泳鉴定大小。此外将PCR产物进 行测序鉴定。结果表明在琼脂糖凝胶上出现2条带，大小分别约为1.7kb和1.4kb，与 目的HA和NA基因片段大小相符。测序结果也进一步证实PCR产物确实为CIV LN27 HA和NA基因片段。

实施例2本发明重组CIV rH3N2-DL生物学特性鉴定

1、重组CIV rH3N2-DL的组织培养半数感染量（50%tissue culture infective dose， TCID₅₀）测定：

按照WHO流感操作手册进行操作，测得的第5代重组CIV rH3N2-DL的 TCID₅₀=10^4.8/mL，而第5代CIV LN27病毒的TCID₅₀=10^2.0/mL，重组CIV rH3N2-DL 在MDCK细胞上的复制滴度比亲本毒株CIV LN27的高出2log以上。

2、重组CIV rH3N2-DL的鸡胚半数感染量（50%egg infective dose，EID₅₀）测定：

将5代CIV LN27病毒和第5代重组CIV rH3N2-DL用灭菌的1×PBS分别做10⁵、 10⁶、10⁷、10⁸、10⁹和10¹⁰倍稀释，每个稀释度分别接种5枚SPF鸡胚，每胚0.2mL， 置于37℃温箱中孵化72h后收集尿囊液，用HA试验检测鸡胚尿囊液的血凝性，以 Reed-Muench公式计算毒株的EID₅₀。测得的第5代重组CIV rH3N2-DL的EID₅₀= 10^9.28/mL，而第5代CIV LN27病毒的EID₅₀=10^8.1/mL，重组CIV rH3N2-DL在SPF 鸡胚上的复制滴度比CIV LN27的高出1log以上。

3、重组CIV rH3N2-DL在鸡胚和细胞上复制的动力学

将第5代重组CIV rH3N2-DL和第5代CIV LN27病毒分别以10⁴EID₅₀接种SPF 鸡胚和MDCK细胞，分别于接种后24h、48h、72h、96h和120h测定病毒效价。结果 表明无论是在细胞上还是在鸡胚中重组CIV rH3N2-DL的复制效价均比CIV LN27亲 本病毒高。

4、rH3N2-DL HA和NA基因的遗传稳定性：

将含rH3N2-DL病毒的尿囊液分别做10倍倍比稀释接种10日龄SPF鸡胚，每个 稀释度接种3枚鸡胚，置于37℃温箱中孵化72h，然后收集鸡胚尿囊液测定HA效价， 将具有血凝活性的最高稀释倍数的尿囊液作为种毒分装，-70℃保存。重复上述操作， 传代病毒至15代次。分别选取第5、10和15代含病毒尿囊液提取病毒RNA，经RT-PCR 扩增，获得HA和NA基因片段后分别测序，与CIV LN27的HA和NA基因序列进行 比较分析，研究重组CIV rH3N2-DL HA和NA基因是否发生突变。结果表明所测得各 代次毒的HA和NA基因的氨基酸序列均未发生突变，表明重组病毒具有良好的遗传 稳定性。

实施例3本发明重组CIV制备的疫苗免疫效果评价

用重组CIV rH3N2-DL（保藏号为CGMCC No.8162）接种SPF鸡胚或MDCK细 胞，收获鸡胚尿囊液或细胞培养上清，用1‰甲醛于4℃灭活72h，经鸡胚接种鉴定完 全灭活后，作为疫苗抗原。将rH3N2-DL抗原与GEL A佐剂混合，乳化制成疫苗。将 1ml疫苗（含8μg HA抗原）和1ml PBS经后肢肌肉多点免疫4只犬，同时将1ml经 佐剂乳化的PBS经同样方法接种4只犬作为阴性对照。一免3周后加强免疫，剂量方 法同一免。二免后2周用10⁶EID50H3N2犬流感病毒强毒（在本发明实施例中所用攻 毒强毒为亲本毒株CIV LN27株）进行鼻腔攻毒，每天观察临床症状，并定时采集鼻 腔拭子，连续监测10天，用SPF鸡胚滴定检测排毒情况。免疫前1d、免疫后每周分 别采血，分离血清，测定HI抗体效价。结果表明免疫后第1周即可检测到HI抗体， 而对照组均未检测到HI抗体，抗体效价见表2。攻毒后排毒监测结果表明免疫组所有 犬在监测的10d内鼻拭子均没有检测到病毒，所有犬均未见到可视临床症状。对照组 在攻毒后第1d到第5d所有犬的鼻拭子均能够检测到病毒，第6d之后病毒检测为阴性， 而且所有犬均表现出明显的呼吸道疾病症状。

表2rH3N2-DL疫苗免疫犬后不同时间的HI抗体效价

ND代表未检出。

实验结论：本发明拯救的重组CIV比亲本毒株CIV LN27无论在鸡胚上还是在细胞 上均具有良好的复制能力，具有高产特性；而且毒力比亲本毒株显著降低；免疫攻毒 保护实验也证实该重组CIV制备得到的疫苗能够有效诱导犬产生HI抗体，攻毒后免疫 犬不排毒，具有良好的免疫保护效果。上述结果表明本发明制备得到的疫苗作为我国 H3N2亚型犬流感疫苗的理想候选疫苗将会带来巨大的社会和经济效益。