HAV检测

摘要

提供了用于检测生物样品中的HAV的方法，包括在反应混合物中扩增包含HAV的序列的靶核酸。该反应混合物包括可能含有靶核酸的生物样品和寡核苷酸组。本发明还提供了用于检测HAV的试剂盒。

说明书

本发明涉及利用寡核苷酸检测HAV的方法，寡核苷酸用于检测HAV的反应混合物和应用，以及包含用于检测HAV的寡核苷酸的试剂盒。

HAV(甲型肝炎病毒)是一种分类为肝病毒属的RNA病毒，其能导致肝炎，一种急性肝感染。HAV一般通过粪途径传播，通过摄取污染的食物或水或者通过与感染的人直接接触而在人与人之间传播。

甲肝有一个大约4周的潜伏期。病毒在肝中复制。在临床症状发作之前，潜伏期期间粪便中相对大量的病毒脱落，并出现短暂的病毒血症。疾病的严重性范围从无症状到无黄疸或者黄疸肝炎。当在细胞培养中生长时，该病毒是非引起细胞病变的。它的体内致病性，其涉及实质细胞坏死和组织细胞门静脉周围炎症，可通过细胞免疫应答介导。到症状发作的时间，粪便中病毒的分泌下降，可能已经停止，而且抗HAVIgM滴度增加。可以1到2周以后检测抗HAVIgG并持续多年。HAV基因组包含大约7500个核苷(nt)的正义RNA，其在3’末端聚腺苷酸化，而且具有与5’端连接的多肽(VPg)。一个大的开放式阅读框(ORF)占据了基因组的大部分，并编码理论分子量为M_r252,000的多聚蛋白。HAV多聚蛋白进行加工以产生结构(位于氨基末端)和非结构病毒多肽。已经从原型肠道病毒和鼻病毒，尤其是1型脊髓灰质炎病毒的研究中推断出了细小核糖核酸病毒的许多复制特征。

甲型肝炎病毒通过摄取和肠感染进入体内。然后病毒可能通过血流扩散到靶器官-肝。潜伏期期间，粪便中可以检测到大量病毒颗粒，从早到暴露之后10-14天开始，并一般持续到血清转氨酶的峰值高度。在疾病的急性阶段早期也在粪便中检测到病毒，但是临床黄疸发作以后相对不频繁。有趣的是，在潜伏期晚期也可以检测到持续存在的甲型肝炎病毒的抗体，这与肝损伤的生化证据发作大约一致。实验转移到黑猩猩以后，已经通过免疫荧光法把甲肝抗原定位于肝细胞的细胞质中。静脉接种以后，在肝以外的任何组织都没有发现该抗原。

各种血清学试验都可用于甲肝，包括免疫电子显微镜检查，补体结合，免疫粘连血凝试验，放射免疫分析和酶免疫分析。免疫粘连血凝试验，其已经广泛使用，是中度特异性和灵敏的。已经描述了几种放射免疫分析方法；其中，一种固相分析类型是非常方便的，很灵敏和特异性的。非常灵敏的酶免疫分析技术广泛应用。在用甲肝的MS-1株实验感染的志愿者中，在不同地理区域中肝炎不同爆发的患者中，以及在甲肝的随机案例中，只鉴定到了一种甲型肝炎病毒的血清型。在组织培养物中分离病毒需要延长适应作用，因此不适于诊断。

分子生物技术，例如基于病毒RNA的反转录和通过PCR进行扩增的那些技术，允许从任何种类的临床或环境样品检测非常小量的病毒RNA。可以通过本发明中提供的核酸检测方法检测HAV感染。

概述

本发明提供了检测生物样品中的HAV的方法，包括在反应混合物中扩增靶核酸，该靶核酸包含HAV的核酸序列。该反应混合物可包含生物样品和至少第一和第二引物，该生物样品可含有靶核酸，其中第一引物的核酸序列选自SEQID NO：5-8，第二引物的核酸序列选自选自SEQ ID NO：10-11。扩增产生了能被检测的扩增的靶核酸。

此外本发明提供了在扩增期间或之后检测扩增的靶核酸的方法。该方法也可包含反应混合物，该反应混合物进一步包含用于检测扩增的靶核酸的探针。探针的核酸序列选自SEQ ID NO：13-14。

还提供了这样的方法，其中在不含有HAV的单独小瓶中，在相同的循环条件下，和在包含相同比例的扩增试剂的反应混合物中，与HAV平行检测第二靶核酸。

本发明还提供了包含第一引物和第二引物的反应混合物，其中第一引物的核酸序列选自SEQ ID NO：5-8，第二引物的核酸序列选自SEQ ID NO：10-11。反应混合物另外可包含探针，其中探针的核酸序列选自SEQ ID NO：13-14。本发明还提供了包含聚合酶，核苷酸，第一引物和第二引物的试剂盒，而且任选提供探针。此外，例如第一引物的核酸序列可以是SEQ ID NO：7，第二引物的核酸序列可以是SEQ ID NO：11，探针的核酸序列可以是SEQ ID NO：14。

本发明另外提供了进一步包括在反应混合物中扩增和检测生物样品中的第二靶核酸的方法。例如第二靶核酸可以是细小病毒B19，或者可以是另一个病毒或细菌或微生物或包括遗传靶或对照靶的其他目标序列。

详细描述

公开了检测生物样品中的HAV的方法，包括在反应混合物中扩增包含HAV的序列的靶核酸。反应混合物包括可能含有靶核酸的生物样品，和一组寡核苷酸或一对引物。第一引物的核酸序列可选自SEQ ID NO：5-8，第二引物的核酸序列可选自SEQ ID NO：10-11。扩增步骤可产生扩增的靶核酸。该方法进一步包括检测扩增的核酸的步骤。

术语“生物样品”涉及可进行靶向核酸的诊断分析的材料，而且一般来源于生物来源。在一些实施方案中，所述生物样品来源于人而且是体液。在本发明的一个实施方案中，生物样品是人血液，尿液，痰，汗液，拭样，可吸移的粪便，或脊液。生物样品也可以是可从中提取靶核酸的组织。

本文使用的术语“扩增”一般指从靶核酸产生许多核酸分子，其中引物与靶核酸分子上的特异性位点杂交以提供起始位点，用于通过聚合酶进行延伸。可通过本领域通常已知的任何方法进行扩增，如但不限于：标准PCR，长PCR，实时PCR，热启动PCR，qPCR，RT(反转录)PCR和等温扩增。其他扩增反应包括连接酶链式反应，聚合酶连接酶链式反应，缺口-LCR，修复链式反应，3SR，NASBA，链置换扩增(SDA)，转录介导的扩增(TMA)和Qβ-扩增等。扩增过程产生了扩增产物，称为例如扩增子或扩增的核酸或扩增的靶核酸。

例如一种核酸扩增的方法是聚合酶链式反应(PCR)，其公开于美国专利号4,683,202，4,683,195，4,800,159和4,965,188及其他的文献。PCR一般应用两个或多个寡核苷酸引物，该引物与选择的核酸模板(例如，DNA或RNA)结合。用于核酸分析的引物包括能用作靶核酸的核酸序列内核酸合成起始位点的寡核苷酸。可以通过常规方法从限制性消化物纯化引物，或者合成产生引物。为了最大的扩增效率，引物可以是单链的，但是引物可以是双链的。首先对双链引物进行变性，也即进行处理以分离链。一种变性双链核酸的方法是通过加热。

“热稳定聚合酶”是一种热稳定的聚合酶，也即，它是一种催化与模板互补的引物延伸产物形成，而且当经受提高的温度持续实现双链模板核酸变性所需的时间时，不会不可逆变性的酶。一般，在每个引物的3’末端起始合成，并沿着模板链以5’到3’方向进行。已经从例如黄色栖热菌(Thermus flavus)，红色栖热菌(T.ruber)，嗜热栖热菌(T.thermophilus)，水生栖热菌(T.aquaticus)，乳栖热菌(T.lacteus)，T.rubens，嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)和炽热甲烷嗜热菌(Methanothermus fervidus)分离了热稳定聚合酶。另一种示例性聚合酶是Z05。还可以从它们的起始状态对聚合酶进行修饰，例如，以执行另外的功能和/或具有改良的功能性。例如Z05D是一种修饰的Z05聚合酶，例如如US2009/0148891中所述。“具有逆转录酶活性的聚合酶”是能基于RNA模板合成DNA的核酸聚合酶。一旦RNA已经被逆转录成单链cDNA，它也能形成双链DNA。在本发明的一个实施方案中，聚合酶是热稳定的。不是热稳定的聚合酶也可以用于PCR分析，只要补充该酶。也可以在一个反应混合物中混合多种聚合酶以提供多种功能。

“靶核酸”是核苷酸的聚合化合物，如本领域技术专家已知的。本文使用的“靶核酸”指将被分析的样品中的核酸，也即，将测定样品中该核酸存在，不存在和/或其含量。靶核酸可以是基因组序列，例如，特定基因的部分，或者RNA或DNA。在其他的实施方案中，靶核酸可以是病毒或微生物的。在一个特定的实施方案中，靶核酸可以是HAV或细小病毒B19。靶核酸也可以是对照靶。

术语“反应混合物”涉及其中发生扩增反应的介质。该介质可以是液体，颗粒的悬浮液或液体与固相一起。介质包括获得靶核酸的扩增所需的盐，试剂如dNTP，酶和寡核苷酸，以及可能包含靶核酸的样品。

在一个实施方案中，反应混合物另外包含用于检测扩增的靶核酸的核酸探针。在一个特定的实施方案中，例如，探针的核酸序列可以是SEQ ID NO：14。

术语“其可能包含靶核酸”指不但测试包含或者，由于某些原因，怀疑含有靶核酸的样品，而且测试可能包含靶核酸，甚至最终不含有靶核酸的样品。

本文使用的术语“引物”和“探针”涉及寡核苷酸。在本发明的上下文中，术语“寡核苷酸”指从许多核苷酸(作为它们的单体单元)形成的成分。术语“寡核苷酸”还包括修饰的寡核苷酸，也即，引物和/或探针包括修饰的核苷酸，或者也称为核苷酸类似物的非核苷酸化合物。术语“引物”进一步涉及这样的寡核苷酸，其用于扩增反应，并与靶序列退火。术语“探针”进一步涉及与靶核酸或扩增子杂交的寡核苷酸，用于定性或定量检测的目的。在探针的情况中，修饰可包括染料，如FAM，HEX，JA270，CY5，CY5.5等，和/或淬火分子。染料分子可与接头偶联。但是，这种染料也可以存在于引物中。其他示例性修饰包括3’末端的磷酸根基团。常见的引物修饰包括3’核苷酸的修饰以防止非特异性扩增产物如引物二聚体。这种修饰是本领域熟知的，而且包括，作为非限制性实例，叔-丁基苄基-dA或(叔)-丁基苯基-dC。这种修饰也包括在术语“引物”中。

一对引物指正向和反向引物，如果经受允许产生下述扩增子的条件时，它们一起能从与其退火的靶核酸产生扩增子。反应混合物中可发现超过两个引物。一组用于扩增的寡核苷酸可包括多个引物和1或2或更多个探针。

术语“检测”涉及测定扩增产生的信号。测定可以是定性或定量的。适合的核酸检测方法是本领域专家已知的，而且描述于标准教科书中，如Sambrook J.等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Habor Laboratory Press，Cold Spring Habor，New York，1989和AusubelF.等：Current Protocols in MolecularBiology1987，J.Wiley and Sons，NY。还可以在进行核酸检测步骤之前，进一步存在纯化步骤，如例如沉淀步骤。检测方法可包括但不限于结合或插入特异性染料如溴化乙锭，其插入到双链DNA中并其后改变它的荧光。也可以通过电泳方法分离纯化的核酸，任选在限制性消化以后，并其后目测检验。还有基于探针的分析，其利用寡核苷酸与特异性序列杂交和随后的杂交物检测。

可以在扩增反应期间或之后检测扩增的靶核酸以便评估分析的结果。一种实时检测方法是使用核酸探针或多个探针。其他的实时方法是本领域熟知的，而且包括例如使用DNA结合染料如SYBR绿或溴化乙锭。

通过使用商业可获得的实时PCR仪器(例如，或系统)，可以在一个封闭容器中联合PCR扩增和扩增产物检测，同时具有显著降低的循环时间。由于检测和扩增同时发生，实时PCR方法避免了操作扩增产物的需要，并减少了扩增产物之间交叉污染的风险。实时PCR大大降低了周转时间，而且在临床实验室中是常规PCR技术的一种有吸引力的选择。但是，也可以使用技术人员已知的其他检测方法。

根据本发明的方法，通过使用内部对照核酸，测定了可能干扰扩增和检测反应的样品特异性的，以及样品非特异性的抑制作用(不依赖靶区域的抑制)的水平，其导致更精确的滴度。“内部”指在与靶核酸相同的反应混合物中对对照核酸进行扩增，检测和定量，而不是在单独的实验中。例如本发明提供了添加对照寡核苷酸-正向引物，反向引物和探针-到反应混合物中。

“检测极限”或“LOD”指在预先规定的命中率的情况中样品中可检出的最低核酸含量或浓度。低的“LOD”对应高的灵敏度，反之亦然。“LOD”经常通过单位“cp/ml”表达，尤其是如果核酸是病毒核酸时，或者以IU/ml。“cp/ml”指“每毫升的拷贝数”，其中“拷贝”是各核酸的拷贝。IU/ml表示“国际单位/ml”，指WHO标准。

一种广泛用于计算LOD的方法是“概率值分析(Probit analysis)”，其是一种分析刺激物(剂量)与可数性(quantal)(全有或全无)反应之间的关系的方法。在典型的可数性反应实验中，给多组动物提供不同剂量的药物。记录每个剂量水平的百分比濒死。然后使用概率值分析对这些数据进行分析。概率值模型假定百分比反应与对数剂量的关系呈累积正态分布。也即，可以使用对数剂量作为变量来从累积法线中读出百分比濒死。使用正态分布，而不是其他的概率分布，影响在可能的剂量的高和低端点处的预测反应率，但是接近中间影响很小。

“概率值分析”可以以独特的“命中率”应用。如本领域已知的，“命中率”通常以百分数[％]表示，并表示在特定浓度的分析物时阳性结果的百分数。因此，例如，可以以95％命中率测定LOD，其指对95％的有效结果呈阳性的设定计算LOD。

在一个实施方案中，在反转录和扩增之前，富集生物样品中存在的核酸。

本文中使用的术语“富集”涉及任何处理包含靶核酸的样品的方法，其允许从样品中存在的至少一部分其他材料分离靶核酸。“富集”因此可以理解为较之其他材料产生含量更高的靶核酸。

有几种用于富集核酸的方法：

-依赖序列的或生物特异性的方法，如例如：

·亲和层析

·与固定化探针杂交

-不依赖序列的或物理-化学方法，如例如：

·用例如苯酚-氯仿进行液-液提取

·用例如纯乙醇沉淀

·用用滤纸提取

·用形成胶团的试剂如十六烷基三甲基溴化铵提取

·与固定化的，插入的染料结合，例如吖啶衍生物

·吸附至硅胶或硅藻土

·离液条件下吸附至磁性玻璃颗粒(MGP)或有机硅烷颗粒

一种富集靶核酸的示例性方法是使用从Qiagen可商业获得的Puregene试剂盒(例如，订购号158389)进行的富集。

本发明的另一个方面是如上所述的方法，其中在富集前通过裂解许多不同液体样品中可能存在的细胞和/或病毒衣壳，从它们的细胞和/或病毒环境释放核酸。

为了释放细胞或病毒颗粒的内含物，可以用酶或用化学试剂对它们进行处理以溶解，降解或使细胞壁或病毒颗粒变性。该过程通常称为裂解。得到的包含这种裂解的材料的溶液称为裂解物。

在一个实施方案中，文本前面描述的方法的扩增和检测步骤之前有以下步骤：提供包含不同种类的液体样品的多个容器。在足以允许包含靶核酸的核酸固定化到固体支持材料上的一段时间和条件下，把固体支持材料在容器中与许多不同类型的液体样品合并到一起。然后在分离站中从液体样品中存在的其他材料分离固体支持材料，并在分离站中通过从固体支持材料分离液体样品和用洗涤缓冲液洗涤固体支持材料一次或多次，纯化核酸。对于许多不同种类的液体样品中任何一种而言，合并固体支持材料和许多不同种类液体样品的物理条件和时间段都是相同的。

在本发明的一个实施方案中，上述方法中的裂解缓冲液包括选自以下的一种或多种组分：

·离液剂

·缓冲物质

·醇

·还原剂

离液剂，其通常干扰溶液中水分子的有序结构和分子内或分子间的非共价结合力，能对样品分离过程产生一些贡献。特别地，但不仅仅是，它们能通过干扰核酸酶的三级结构而用作RNA酶抑制剂。通常没有另外的RNA酶抑制剂必须用于裂解缓冲液。此外，离液剂有助于破坏生物膜，如质膜或细胞器的膜，如果存在。而且，它们还在核酸与表面如玻璃的附着连接中发挥重要作用(参见上文)。在本发明的上下文中离液剂是胍盐如硫氰酸胍或盐酸胍或氯化胍或异硫氰酸胍，尿素，高氯酸盐如例如高氯酸钾，其他的硫氰酸盐或碘化钾。但是，其他的离液剂也可以用于本发明的范围内。

在一个实施方案中，可以在与检测细小病毒B19相同的反应混合物中同时进行HAV的检测。例如US2007-0281294中公开了用于检测细小病毒B19的寡核苷酸序列。在一个实施方案中，可以在与扩增和检测HAV相同的反应混合物中进行扩增和检测第二靶核酸。在一个实施方案中，在相同的反应混合物中扩增和检测HAV和细胞病毒B19。在一个实施方案中，提供包含用于扩增HAV和第二靶的寡核苷酸组的试剂盒。在一个实施方案中，例如第二个靶是细小病毒B19。在另一个实施方案中，试剂盒另外包括用于另外的靶的寡核苷酸组。

在一个实施方案中，可以在扩增期间，例如使用实时PCR技术，检测扩增的核酸。在另一个实施方案中，可以在完成扩增以后检测扩增的核酸。

在本发明的另一个实施方案中，在相同的循环条件下并在包含相同比例的扩增试剂的反应混合物中，在单独的小瓶中与HAV平行检测第二靶核酸，该小瓶中不含有HAV。术语“平行”指HAV与第二靶核酸在单独的小瓶中进行该方法，但是同时而且在相同的条件下。

本发明还提供了包含第一和第二引物的引物对或一组寡核苷酸，其中第一引物的核酸序列包括SEQ ID NO：5-8之一，第二引物的核酸序列包括SEQ IDNO：10-11之一。该引物对可用于与互补核酸的杂交反应中。而且，本文描述的引物对和探针可用于检测HAV。

本发明另外提供了包含第一和第二引物的寡核苷酸组和探针，其中第一引物的核酸序列包括SEQ ID NO：5-8之一，第二引物的核酸序列包括SEQ ID NO：10-11之一，其中探针的核酸序列包括SEQ ID NO：13-14之一。

本发明还提供了包含如本文所述的聚合酶，核苷酸和寡核苷酸的试剂盒。在一个实施方案中，试剂盒另外包含探针，其中所述探针的核酸序列包括SEQID NO：13-14之一。试剂盒可用于检测HAV。而且试剂盒组分的实施方案如本文所述。

在一个实施方案中，对于本文所述的方法、引物对、寡核苷酸组和试剂盒，正向引物是SEQ ID NO：2，反向引物是SEQ ID NO：10。在一个实施方案中，探针是SEQ ID NO：13或14。在一个实施方案中，对于本文所述的方法，引物对，寡核苷酸组和试剂盒，正向引物是SEQ ID NO：2，反向引物是SEQ ID NO：11。在一个实施方案中，探针是SEQ ID NO：13或14。在一个实施方案中，对于本文所述的方法，引物对，寡核苷酸组和试剂盒，正向引物是SEQ ID NO：3，反向引物是SEQ ID NO：10。在一个实施方案中，探针是SEQ ID NO：13或14。在一个实施方案中，对于本文所述的方法，引物对，寡核苷酸组和试剂盒，正向引物是SEQ ID NO：3，反向引物是SEQ ID NO：11。在一个实施方案中，探针是SEQ ID NO：13或14。在一个实施方案中，对于本文所述的方法，引物对，寡核苷酸组和试剂盒，正向引物是SEQ ID NO：4，反向引物是SEQ ID NO：10。在一个实施方案中，探针是SEQ ID NO：13或14。

在一个实施方案中，对于本文所述的方法，引物对，寡核苷酸组和试剂盒，正向引物是SEQ ID NO：4，反向引物是SEQ ID NO：11。在一个实施方案中，探针是SEQ IDNO：13或14。在一个实施方案中，对于本文所述的方法，引物对，寡核苷酸组和试剂盒，正向引物是SEQ ID NO：5，反向引物是SEQ ID NO：10。在一个实施方案中，探针是SEQ ID NO：13或14。在一个实施方案中，对于本文所述的方法，引物对，寡核苷酸组和试剂盒，正向引物是SEQ ID NO：5，反向引物是SEQ ID NO：11。在一个实施方案中，探针是SEQ ID NO：13或14。在一个实施方案中，对于本文所述的方法，引物对，寡核苷酸组和试剂盒，正向引物是SEQ ID NO：6，反向引物是SEQ ID NO：10。在一个实施方案中，探针是SEQ ID NO：13或14。在一个实施方案中，对于本文所述的方法，引物对，寡核苷酸组和试剂盒，正向引物是SEQ ID NO：6，反向引物是SEQ ID NO：11。在一个实施方案中，探针是SEQ ID NO：13或14。

在一个实施方案中，对于本文所述的方法，引物对，寡核苷酸组和试剂盒，正向引物是SEQ ID NO：7，反向引物是SEQ ID NO：10。在一个实施方案中，探针是SEQ ID NO：13或14。在一个实施方案中，对于本文所述的方法，引物对，寡核苷酸组和试剂盒，正向引物是SEQ ID NO：7，反向引物是SEQ ID NO：11。在一个实施方案中，探针是SEQ ID NO：13或14。在一个实施方案中，对于本文所述的方法，引物对，寡核苷酸组和试剂盒，正向引物是SEQ ID NO：8，反向引物是SEQ ID NO：10。在一个实施方案中，探针是SEQ ID NO：13或14。在一个实施方案中，对于本文所述的方法，引物对，寡核苷酸组和试剂盒，正向引物是SEQ ID NO：8，反向引物是SEQ ID NO：11。在一个实施方案中，探针是SEQ ID NO：13或14。

在下面所述的实施例中，另外如表2提供的，相较于R2-HAVref寡核苷酸组，对于SEQ ID NO：7，11观察到了R2-HAV寡核苷酸组增加的灵敏度。在一个实施方案中，使用了SEQ ID NO：7，11和14。

实施例

提供下面的实施例用于例示，而不是限定要求的发明。

两个寡核苷酸组的比较

比较两组寡核苷酸进行HAV的并行检测极限(LOD)研究。

试剂MMx R2-HAV包括寡核苷酸，其包含SEQ ID NO：5-8之一，SEQ ID NO：10-11，和SEQ ID NO：13-14之一的的核酸序列。

试剂MMx R2-HAVref(参照组)包括寡核苷酸，其包含SEQ ID NO：1，SEQID NO：9和SEQ ID NO：12的核酸序列。

用于产生测试水平节点的HAV阳性标本另外掺入细小病毒B19作为病毒背景水平。如表1所示制备标本稀释组。

表1：标本稀释组

对于节点1至7的每个标本重复，人工移液850μl样品到深孔板(处理板)。使用如US-2012-0045751中所述的通用样品制备方法，在半自动功能模件(Roche)上，处理板进行样品制备用于核酸提取。

在最终的样品制备步骤(洗脱物冷却)期间，人工添加Master混合物(MMx)，其含有扩增试剂MMx R1和MMx R2(R2-HAV或R2-HAVref)，到微孔板的每个孔中(扩增-检测平板)。扩增试剂R1和R2下面进一步限定。然后通过仪器把洗脱物(含有分离的核酸)从处理板转移到微孔板，并与MMx混合。然后自动密封微孔板并人工转移到独立分析循环仪用于扩增和检测。使用合适的PCR模式，在两种Master混合物相同的条件下，同时进行扩增和检测(实时PCR)。

扩增和检测

为了扩增，以下面的方式合并两种试剂MMx R1和MMx R2(R2-HAV或R2-HAVref)并与分离的核酸混合到总反应体积50μl：

合并10μlMMx R1试剂(3.3mM MnOAc，pH6.1，和0.02％叠氮化钠，pH7.0)，15μl MMx R2试剂(R2-HAV或R2-HAVref)和25μl分离的核酸以产生反应溶液。

MMx R2-HAV与MMx R2-HAVref制剂的区别仅在于它们的HAV寡核苷酸组成。在该实施例中，MMx R2-HAV包括寡核苷酸组1(SEQ ID NO：7，11和14)，MMx R2-HAVref包括寡核苷酸组2(SEQ ID NO：1，9和12)。两组都用相同的引物/探针浓度进行检测。

对于本实施例，具有寡核苷酸组1的反应混合物包括0.03％叠氮化钠pH7.0，5.4％DMSO，120mM KOAc pH7.0，3％甘油，0.02％Tween20，60mMTricine pH8.0，0.2222μM aptamer，10U UNG，0.4mM dGTP，0.4mM dATP，0.4mMdCTP，0.8mMdUTP，45UZ05D聚合酶，0.35μMHAV正向引物，0.15μMHAV正义探针，0.35μMHAV反向引物，0.3μM内部参照正向引物，0.3μM内部参照反向引物，0.15μM内部对照探针。用于HAVref的反应混合物包括如HAV反应混合物相同浓度的寡核苷酸。

数据分析

使用自动软件对分析循环仪的原始数据文件进行分析。使用概率值-剂量反应工具测定LOD。表2中列出了计算的概率值数据(95％)。

表2：MMx R2-HAV和MMx R2-HAV ref的概率值数据(95％)

概率值浓度IU/mlR2-HAV0.951.27R2-HAVref0.951.97

该概率值数据显示相对于R2-HAVref寡核苷酸组(1.97)，R2-HAV寡核苷酸组导致了增加的灵敏度(1.27)。

应当理解，本文描述的实施例和实施方案仅仅用于例示的目的，而且其各种修饰或改变将建议给本领域技术人员并且包括在本申请的精神和范围内以及所附权利要求的范围内。本文引用的所有出版物，序列登录号，专利和专利申请都以其全部内容引入这里作为参考用于所有目的。