PDE2催化结构域/PDE2特异性抑制剂复合物的晶体及其生长方法

摘要

本发明涉及一种PDE2催化结构域/PDE2特异性抑制剂复合物的晶体及其生长方法，该晶体具有单斜晶系中的空间群P1，该晶体具有晶格常数：α=109.59°±0.1%,β=91.93°±0.1%,γ=90.88°±0.1%。

说明书

技术领域

本发明涉及一种磷酸二酯酶2（PDE2）催化结构域/PDE2特异性抑制剂复合物的晶体，以及生长该晶体的方法。 

背景技术

环腺苷酸（cAMP）和环鸟苷酸（cGMP）是细胞内信号传导的第二信使分子，在细胞生命活动中具有重要的意义。其细胞内浓度水平的调控主要由核苷酸环化酶的合成作用与磷酸二酯酶（PDE，Phosphodiesterase）的水解作用来实现。磷酸二酯酶能催化环磷酸腺苷（cAMP）和环磷酸鸟苷（cGMP）的磷酸二酯键的水解，生成无活性的腺苷酸（AMP）和鸟苷酸（GMP），使得细胞内的cAMP和cGMP的水平下降，从而调控细胞乃至生物体的多种代谢功能。 

磷酸二酯酶是一个庞大的蛋白质家族，迄今共计有11种磷酸二酯酶被鉴定，命名为PDE1-PDE11。磷酸二酯酶家族除了C端的催化结构域相对保守之外，N端的调控域不尽相同。一些磷酸二酯酶对cAMP的水解高度特异（PDE4、PDE7、PDE8），一些是对cGMP的水解高度特异（PDE5、PDE6、PDE9），磷酸二酯酶2（PDE2）则具有混合特异性，属于双底物磷酸二酯酶，即、既能催化水解cGMP和又能水解cAMP。已有研究表明底物cGMP结合至PDE2的GAFB区激活该酶的活性。磷酸二酯酶2（PDE2）全长约为940个氨基酸，由N端的GAFA/GAFB和C端的催化结构域组成。 

PDE2在人体组织中广泛表达，但在大脑和中枢神经系统中浓度尤为高。大量研究揭示了PDE2参与学习、记忆和认知等过程，同时抑制PDE2能增强神经元的塑性和抗抑郁。也有研究表明PDE2能改善内皮细胞的渗透性。PDE2作为潜在的药物靶标，其抑制剂也可以用来治疗中枢神经系统疾病、改善记忆力和内皮细胞的渗透性等。在这些研究中，都运用了PDE2的特异性抑制剂来阐明PDE2的生理功能。 

近年来，随着结构生物学的发展，利用X射线晶体学已经揭示了越来越多的蛋白质空间结构。通过分析蛋白质的空间，有助于理解蛋白质的生物学功能。同时，蛋白是重要的药物靶标。利用疾病相关蛋白质的三维结构信息，可以设计出针对该蛋白质的特异性抑制剂，从而达到治疗疾病的目的。WO2003/038080A公开一种PDE5的晶体以及PDE5/PDE5配体复合物的晶体。已有关于PDE2的全酶和其催化结构域与非特异性抑制剂IBMX的复合 物三维结构的报道(Pandit,J.,et al.Proc Natl Acad Sci USA,2009.106(43):p.18225-30)，但是PDE2与特异性抑制剂的三维结构尚未见报道。由于各PDE家族之间的催化域结构中蛋白质折叠模式相近，容纳底物分子的结合口袋形状也相似，因此了解PDE与特异性抑制剂的相互作用特征对于开发高选择性的PDE药物分子显得尤为重要。PDE2与非特异性抑制剂IBMX的相互结合模式并不能充分提供开发PDE2特异性抑制剂的有用信息。 

因此有必要阐明PDE2与某一种特异性抑制剂的空间结构，利用该信息可以指导基于结构的药物设计。 

BAY60-7550是一种PDE2的强力抑制剂，对于PDE2的半数抑制率IC50值为4.7nM。然而BAY60-7550与PDE2的结合模式尚未阐明。在本发明之前，人们无法获知参与PDE2与BAY60-7550结合的氨基酸残基和相应的结合作用力，如氢键、疏水作用力、范德华力等。因缺乏上述信息而无法设计、生产出针对PDE2的更好的药物分子。 

发明内容

面对现有技术存在的问题，本发明通过对PDE2催化区结构域与其特异性抑制物（例如BAY60-7550）复合物晶体的结构解析，揭示了PDE2催化结构域与BAY60-7550的空间结合特征，基于此获知参与PDE2与BAY60-7550结合的氨基酸残基和相应的结合作用力，如氢键、疏水作用力、范德华力等。 

在此，一方面，本发明提供一种PDE2催化结构域/PDE2特异性抑制剂复合物的晶体，该晶体具有单斜晶系中的空间群P1，该晶体具有晶格常数： α=109.59°±0.1%,β=91.93°±0.1%,γ=90.88°±0.1%。 

本发明通过原子坐标描述的催化结构域晶体结构与其特异性抑制剂复合物的三维结构，所述原子结构可通过该复合物的X-射线晶体学获得。基于该晶体可获得了关于该PDE2催化结构域与其特异性抑制剂（例如BAY60-7550）相互作用的特征信息。用于PDE2抑制剂的鉴定以及这类抑制剂在作为用于治疗中枢神经系统疾病的药物的筛选、评价。有望用于基于结构的药物设计， 

较佳地，在所述晶体中，一个不对称单元中有四个分子，每个分子的分子量约为39 ±0.5kD，溶剂含量约为61±1%。 

较佳地，所述晶体的三维结构符合表1限定的三维结构： 

表1：

修正好的结构显示PDE2催化结构域中参与和BAY60-7550作用的氨基酸残基有：Gln859,Gln812,Ile826,Phe862,Met 847,Ile822,Leu809,Leu770和Ile870等。

较佳地，PDE2催化结构域的结合口袋中结合有一个PDE2特异性抑制剂分子。 

较佳地，PPDE2催化结构域由16个α螺旋组成，在所述结合口袋的底部有一个Mg²⁺和一个Zn²⁺。 

在本发明中，所述PDE2特异性抑制剂可为BAY60-7550化合物， 

较佳地，所述PDE2催化结构域的氨基酸序列来源于人。 

较佳地，所述PDE2催化结构域具有SEQ ID NO:1中列出的氨基酸序列或其同系物、片段、变体。 

另一方面，本发明还提供一种生长上述PDE2催化结构域/PDE2特异性抑制剂复合物的晶体的方法，包括以下步骤： 

1)在缓冲液中制备含8-12mg/ml的PDE2催化结构域蛋白的蛋白缓冲液；

2)混合所述蛋白缓冲液和池液作为结晶溶液；

3)从所述结晶溶液中生长含PDE2催化结构域蛋白的蛋白晶体；以及

4)将所述蛋白晶体浸泡在含0.1-5mM PDE2特异性抑制剂的池液中以获得PDE2催化结构域/PDE2特异性抑制剂复合物的晶体。

又，所述蛋白缓冲液的制备包括： 

a)将PDE2催化结构域克隆至pET32a原核表达载体；

b)将重组载体转化入原核细胞BL21(DE3)Codon Plus中，IPTG诱导蛋白质表达；

c)纯化PDE2催化结构域蛋白；以及

d)将纯化的PDE2催化结构域蛋白浸入缓冲液中，然后浓缩至8-12mg/ml。

较佳地，所述缓冲液的pH值为7.5，并含有25mM的Hepes（羟乙基哌嗪3硫磺酸）(N-(2-羟乙基)哌嗪-N′-(2-乙磺酸)、25mM的NaCl、以及2mM的TCEP（三(2-羧乙基)膦盐酸盐）。 

较佳地，所述池液的pH值为8.5，并含有0.1M的Tris（三羟甲基氨基甲烷）-HCl、0.2M的MgCl₂、以及16-20%的PEG 6000。 

较佳地，所述蛋白晶体可通过蒸汽扩散悬滴方法来生长。 

本发明通过培养PDE2催化结构域/PDE2特异性抑制剂复合物的晶体并分析其三维结构示出了PDE2催化结构域与其特异性抑制剂，例如BAY60-7550的结合特征。关于PDE2催化结构域与BAY60-7550的三维结构的信息为设计和生产针对PDE2的中枢神经系统药物小分子药物（化学药物）提供给了一种方式（基于结构的药物设计）。比如，通过计算机模拟软件等可以根据上述信息虚拟筛选、设计抑制PDE2的小分子药物，从而达到治疗抑郁、改善记忆、提高认知功能等目的。或者利用本发明所提及的PDE2催化结构域与BAY60-7550复合物晶体的晶体结构，通过计算机模建的方法，设计出针对PDE2的小分子物质等，然后合成该种物质，与PDE2形成复合物，再利用X射线晶体衍射的方法分析复合物，从而获得真实的结合位点。根据X射线晶体衍射分析的结果，可对小分子物质进行调整，直 至获得最优化的物质分子。而在本发明之前，由于缺乏PDE2与选择性抑制剂的结合信息而无法针对性设计、生产出针对PDE2的更好的特异性药物。 

附图说明

图1示出一个非对称单元中含有四个等同的PDE2催化结构域与BAY60-7550复合物分子； 

图2示出PDE2催化结构域与BAY60-7550复合物结构总览；

图3示出显示PDE2催化结构域与BAY60-7550结合特征的三维图。

具体实施方式

以下结合附图及下述实施方式进一步说明本发明，应理解，下述实施方式和/或附图仅用于说明本发明，而非限制本发明。 

PDE2催化区结构域的表达和纯化： 

PDE2催化区结构域的基因序列表达：例如，将PDE2催化结构域基因序列克隆至原核表达载体pET32a中。该PDE2催化结构域基因序列表达后具有如SEQ ID No.1所表明的序列或其同系物、片段、变体。

PDE2催化区结构域的蛋白表达：例如，重组载体转化入E.coli细胞BL21(DE3)Codon Plus菌株中，在LB培养基中培养至OD600值为0.6～0.8时，加入IPTG诱导蛋白表达； 

蛋白纯化，例如表达蛋白利用Ni-NTA亲和树脂（Qiagene）和Superdex200（GE Healthcare）树脂等纯化出足够纯度的蛋白用于结晶，与PDE2共表达的Trx融合蛋白在此过程中被用TEV酶去除。 

蛋白晶体生长、复合物结晶： 

蛋白缓冲液的制备：将纯化的蛋白透析浸入缓冲液中，然后浓缩（例如使用离心设备(PALL Corp.)浓缩管浓缩）至8～12mg/ml（可按照Bradford测定法测定）。所使用的缓冲液可例如含有25mM Hepes((N-(2-羟乙基)哌嗪-N′-(2-乙磺酸)，pH7.5，25mM NaCl，2mMTCEP（三(2-羧乙基)膦盐酸盐）。

蛋白晶体生长：在18℃混合1μL蛋白质溶液和1μL池液（reservoir buffer）作为结晶液滴。所述池液可含有0.1M Tris-HCl，pH8.5，0.2M MgCl2，16～20%PEG 6000。若干天后，晶体生长至100～200μm大小。 

复合物结晶：将长大的晶体转移浸泡到含有0.5～2mM BAY60-7550的上述池液中。浸泡6小时后收集晶体并转移到含有20%甘油的池液中作为冷冻保护，随后将晶体速冻于液 氮中。晶体通常能衍射到 左右。应理解，这里采用BAY60-7550作为PDE2的特异性抑制剂配体，但可以采用其它的合适的特异性抑制剂。 

数据收集、处理和模型优化： 

在同步辐射装置SSRF的BL17U束线上进行数据收集，并使用iMOSFLM进行处理。X射线波长为 每隔1°收集一张衍射图，共收集180张。结构解析使用CCP4软件包中的MOLREP程序进行分子置换，采用PDB库中的编号为1Z1L的模型作为模板。得到初始结构后进一步在Refmac程序中优化。在PRODRG服务器产生化合物Bay60-7550的库文件后，将BAY60-7550分子构建入相应的电子云密度图中。复合物结构最终在PHENIX程序中得到优化。数据处理统计和结构优化数值如表1所示。

表1：

图1中说明解析后的结构显示一个非对称单元中含有四个等同的PDE2催化结构域与BAY60-7550复合物分子，图中箭头显示结合于PDE2催化结构域中的BAY60-7550分子。 

图2示出PDE2催化结构域与BAY60-7550复合物结构总览，该图中显示PDE2催化结构域 由16个α螺旋组成，在结合口袋底部有一个Mg²⁺和一个Zn²⁺。图3示出显示PDE2催化结构域与BAY60-7550结合特征的三维图，该图中显示PDE2催化结构域中参与和BAY60-7550作用的氨基酸残基有：Gln859、Gln812、Ile826、Phe862、Met847、Ile822、Leu809、Leu770和Ile870等。

通过计算机模拟软件等可以根据上述信息虚拟筛选、设计抑制PDE2的小分子药物，从而达到治疗抑郁、改善记忆、提高认知功能等目的。或者利用本发明所提及的PDE2催化结构域与BAY60-7550复合物晶体的晶体结构，通过计算机模建的方法，设计出针对PDE2的小分子物质等，然后合成该种物质，与PDE2形成复合物，再利用X射线晶体衍射的方法分析复合物，从而获得真实的结合位点。根据X射线晶体衍射分析的结果，可对小分子物质进行调整，直至获得最优化的物质分子。 

序列表

SEQ  ID  NO:1

 

<110>  上海美迪西生物医药有限公司

 

<120>  PDE2催化结构域/PDE2特异性抑制剂复合物的晶体及其生长方法

 

<160>  1    

 

<170>  PatentIn version 3.5

 

<210>  1

<211>  342

<212>  PRT

<213>  人类

 

<400>  1

 

Ser Asp Asp Glu Tyr Thr Lys Leu Leu His Asp Gly Ile Gln Pro

1                5               10                  15

Val Ala    Ala Ile    Asp Ser   Asn Phe  Ala Ser   Phe Thr   Tyr Thr   Pro

              20               25                  30

Arg Ser   Leu Pro   Glu Asp   Asp Thr   Ser Met   Ala Ile    Leu Ser   Met

              35               40                  45

Leu Gln   Asp Met  Asn Phe  Ile Asn    Asn Tyr   Lys Ile     Asp Cys  Pro

              50               55                  60

Thr Leu   Ala Arg   Phe Cys   Leu Met  Val Lys    Lys Gly   Tyr Arg   Asp

              65               70                  75

Pro Pro   Tyr His Asn Trp Met His       Ala Phe   Ser Val    Ser His    Phe

              80               85                  90

Cys Tyr   Leu Leu   Tyr Lys    Asn Leu  Glu Leu   Thr Asn   Tyr Leu   Glu

              95               100                105

Asp Ile    Glu Ile    Phe Ala   Leu Phe   Ile Ser     Cys Met  Cys His   Asp

              110             115                120

Leu Asp   His Arg   Gly Thr   Asn Asn  Ser Phe   Gln Val   Ala Ser   Lys

              125             130                135

Ser Val    Leu Ala   Ala Leu   Tyr Ser    Ser Glu   Gly Ser   Val Met   Glu

              140             145                150

Arg His   His Phe   Ala Gln   Ala Ile    Ala Ile    Leu Asn   Thr His   Gly

              155             160                165

Cys Asn   Ile Phe    Asp His   Phe Ser   Arg Lys   Asp Tyr   Gln Arg   Met

              170             175                180

Leu Asp   Leu Met  Arg Asp  Ile Ile      Leu Ala   Thr Asp   Leu Ala   His

              185             190                195

His Leu   Arg Ile    Phe Lys   Asp Leu  Gln Lys   Met Ala   Glu Val   Gly

              200             205                210

Tyr Asp   Arg Asn  Asn Lys   Gln His   His Arg   Leu Leu   Leu Cys   Leu

              215             220                225

Leu Met  Thr Ser   Cys Asp   Leu Ser   Asp Gln  Thr Lys   Gly Trp   Lys

              230             235                240

Thr Thr   Arg Lys   Ile Ala     Glu Leu   Ile Tyr     Lys Glu   Phe Phe   Ser

              245             250                255

Gln Gly   Asp Leu  Glu Lys   Ala Met   Gly Asn   Arg Pro   Met Glu  Met

              260             265                270

Met Asp  Arg Glu  Lys Ala    Tyr Ile     Pro Glu   Leu Gln   Ile Ser     Phe

              275             280                285

Met Glu  His Ile     Ala Met   Pro Ile    Tyr Lys    Leu Leu   Gln Asp   Leu

              290             295                300

Phe Pro   Lys Ala    Ala Glu   Leu Tyr   Glu Arg   Val Ala    Ser Asn   Arg

              305             310                315

Glu His   Trp Thr   Lys Val    Ser His    Lys Phe   Thr Ile    Arg Gly  Leu

              320             325                330

Pro Ser   Asn Asn  Ser Leu   Asp Phe  Leu Asp   Glu Glu                

              335             340