一株高阿魏酸抗逆性拜氏梭菌及其应用

摘要

本发明公开了一株对阿魏酸具有高抗逆性的拜氏梭菌及应用，分类命名为Clostridium beijerinckii M11，其保藏登记号为CCTCC NO：M2013423，保藏日期：2013年9月14日。本发明采用等离子体诱变拜氏梭菌，经含有阿魏酸的刃天青平板和摇瓶发酵筛选，得到的突变菌株能够在含0.8g/L阿魏酸的发酵培养基中正常生长，丁醇产量达到6.1g/L，而同等条件培养的出发菌株基本不生长。并且，以未脱毒的玉米芯酸解糖液作为碳源，在2L发酵罐中丁醇产量达到了6.4g/L，而同等条件培养的出发菌株基本不生长。其抗逆性强、丁醇产量高、重复性好，是一种适合利用玉米芯等木质纤维原料发酵产丁醇的优良菌种。

说明书

技术领域

本发明涉及一株对阿魏酸具有高抗逆性的拜氏梭菌，以及其在丙酮丁醇发酵工业中 的应用，属于生物发酵技术领域。

背景技术

丁醇作为新型可再生的液体能源，被世界越来越多的国家重视；丁醇具有能量密度 大、可与汽油任意比混合、可直接用于内燃机、运输方便等优点。目前，丁醇的生产方 法主要通过化学法合成，随着能源危机日益严峻，石油资源加速枯竭和价格飞涨，生物 法生产丁醇，作为一种有效的、利用生物质资源生产重要平台化合物及燃料的生物转化 技术，又开始重新被人们重视。自2008年以来，我国建立了不少生物丁醇生产线，年 产能达到10万吨；但是由于淀粉质、糖蜜质原料的不断攀升，使得生物丁醇生产厂家 大都处于停产状态。在粮食短缺与能源危机的双重威胁下；探索可再生的木质纤维质原 料生产燃料丁醇成为生物质能源发展战略的重要组成，也是研究的热点之一。

近年来，国内外对纤维原料发酵产丁醇的研究很多。Nasib Qureshi等（Biomass and  Bioenergy.2008,32:176-183）利用拜氏梭菌P260，在小麦秸秆中加入纤维素酶、木聚糖 酶等进行同步糖化发酵，经过533小时的连续发酵，其溶剂的产率为0.41。Annous等 （Appl.Environ.Microbiol.1991,57:2544-2548）利用化学诱变，得到了超级菌株BA101， 单批发酵总溶剂最高可达25g/L以上；Thaddeus Ezeji等（Bioresource Technology.2008, 99:5915-5922）利用突变株BA101，以XAD-4resin脱毒的玉米芯酸解和酶解糖液为底 物发酵，总溶剂产量为9.30g/L；但突变株BA101不能利用未脱毒的酸解和酶解糖液发 酵产丁醇，尤其阿魏酸浓度在0.5g/L以上时，基本不生长。木质纤维原料经稀酸处理 后，会产生有机酸、糠醛、酚类等抑制物，这些抑制物的除去成本较高、并对微生物生 长有一定的抑制作用；Thaddeus Ezeji等（Biotechnology＆Bioengineering.2007, 97(6):1460-1469）研究发现有机酸、糠醛等抑制物不影响丁醇的发酵，而酚类抑制物（尤 其是阿魏酸）对丁醇发酵有明显的抑制效应。中国专利ZL201110020102.6报道：通过 粒子束诱变育种得到的Clostridium beijerinckii IB4对酚类化合物具有较高的抗逆性，其 能以未脱毒的玉米芯酸解糖液作为碳源，在2L发酵罐中总溶剂产量和丁醇产量分别达 到了10.3g/L和7.1g/L；郭亭等（J Ind Microbiol Biotechnol.,2012,39(3),401–407）研究 发现，当玉米芯水解液中的酚类化合物的浓度提升到1.5g/L以上时，Clostridium  beijerinckii IB4基本不生长。

可见，木质纤维原料中的毒素抑制物（尤其是阿魏酸）严重抑制产丁醇梭菌的发酵 性能；而菌种改良是提高菌株对抑制物的耐受性、发酵经济性的关键手段之一。

发明内容

本发明要解决的技术问题之一在于提供一株对阿魏酸具有高抗逆性的拜氏梭菌，使 其在高浓度阿魏酸存在下，仍能生长与发酵。

本发明要解决的技术问题之二在于提供所述高抗逆拜氏梭菌的应用。

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

一株高阿魏酸抗逆性拜氏梭菌，其分类命名为拜氏梭菌（Clostridium beijerinckii） M11，已保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO：M2013423，保 藏日期为2013年9月14日。

本发明的拜氏梭菌Clostridium beijerinckii M11的筛选方法，将拜氏梭菌出发菌株 NCIMB8052（购于美国菌种保藏中心（ATCC））经等离子体诱变后，利用刃天青平板 筛选得到还原力强的菌株，再经厌氧瓶发酵筛选获得总溶剂产量高的拜氏梭菌目标菌 株。

其具体步骤如下：

a）等离子体诱变：将拜氏梭菌原始菌株活化培养，培养温度33～37℃，25mL的 肖特厌氧瓶装液量为10～15mL，培养时间12～18h，得到处于对数生长期的菌液，将 培养的细胞稀释至OD₆₀₀=0.1～1.0，滴加在灭菌冷却后的载片上，用无菌空气吹干；以 氦气为放电气体，以80～120W作为射频功率，以10～30SLM作为气体流量，以10～ 1800s作为辐照时间对菌株进行等离子体诱变；

b）刃天青平板初筛：将诱变后的载片置于装有1～2mL生理盐水的具塞试管中， 剧烈震荡，将载片上的菌株洗脱，稀释成不同浓度涂布于含刃天青（0.002%）和阿魏酸 （0.5g/L）的培养基平板上，33～37℃厌氧培养24～36h，挑选出变色圈明显大于出发 菌的菌落；

c）厌氧瓶发酵筛选：将步骤b）筛出的菌落接入种子培养基扩大培养，培养温度 33～37℃，厌氧培养培养时间10～18h，然后在发酵培养基中发酵，接种量5%～10% （v/v），发酵温度33～37℃，厌氧发酵发酵时间60～90h；考察步骤b）筛选出的菌落 发酵产丁醇和总溶剂的产量，同时选出丁醇和总溶剂产量最高的菌株。

d）在上述筛选方法中：步骤a）中所述的等离子体诱变方法中，优选100W作为射 频功率，10SLM作为气体流量，180s作为辐照时间。

在上述筛选方法中：步骤b）所采用的常规固体培养基、碳源为葡萄糖或淀粉；氮 源为有机或无机含氮化合物，其中无机含氮化合物为乙酸铵，有机含氮化合物为蛋白胨、 酵母粉和玉米浆中的一种或多种；无机盐为钠盐、钾盐、镁盐、钙盐、磷酸盐、亚铁盐 中的一种或多种，固体培养基中添加琼脂。

在上述筛选方法中：步骤c）所采用的种子培养基和发酵培养基中，碳源为葡萄糖 或玉米芯酸解糖液中；氮源为有机或无机含氮化合物，其中无机含氮化合物为乙酸铵、 氯化铵中的一种或多种，有机含氮化合物为蛋白胨、酵母粉、牛肉膏和玉米浆中的一种 或多种；无机盐为钠盐、钾盐、镁盐、钙盐、磷酸盐、亚铁盐中的一种或多种；生长因 子为对氨基苯甲酸、维生素B1、生物素和玉米浆中的一种或几种的混合。

上述高阿魏酸抗逆性拜氏梭菌在发酵生产丁醇中的应用。

其中，所述的发酵生产丁醇的方法包含如下步骤：

1）平板培养：将拜氏梭菌Clostridium beijerinckii M11接种至平板培养基厌氧培养， 培养温度33～37℃，培养时间12～18h；

2）种子培养：将平板培养的拜氏梭菌Clostridium beijerinckii M11接种到种子培养 基中，100mL厌氧瓶装液量40～60mL，充氮气3～5min，培养温度33～37℃，培养 时间12～18h；

3）发酵产丁醇：将种子培养液接种到发酵培养基中，接种量5～10(v/v)%，充氮 气3～5min，发酵温度33～37℃，发酵培养时间为60～90h。

所述的平板培养基包含如下质量百分数的组分：碳源0.3%～1%、氮源0.5%～1%、 无机盐0.5%～0.8%、琼脂1.5%～2%、其余为水；其中，所述碳源为淀粉或葡萄糖；所 述氮源为有机或无机含氮化合物，其中无机含氮化合物为乙酸铵，有机含氮化合物为蛋 白胨、酵母粉和玉米浆中的一种或几种的混合；所述无机盐为钠盐、钾盐和镁盐中的一 种或几种的混合。

所述的种子培养基包含如下质量百分数的组分：碳源0.5%～1%、氮源0.2%～1%、 无机盐0.5%～0.8%、其余为水；其中，所述碳源为葡萄糖和淀粉中的一种或两种的混 合；所述氮源为有机或无机含氮化合物，其中无机含氮化合物为乙酸铵和氯化铵中的一 种或两种的混合，有机含氮化合物为蛋白胨、酵母粉和玉米浆中的一种或几种的混合； 所述无机盐为钠盐、钾盐、镁盐和钙盐中的一种或几种的混合。

所述的发酵培养基包含如下质量百分数的组分：碳源3%～6%、氮源0.1%～0.3%、 无机盐0.1%～0.2%、生长因子0.05%～0.1%、其余为水；其中，所述碳源为葡萄糖、 木糖、蔗糖、阿拉伯糖和糖蜜中的一种或多种的混合；所述氮源为乙酸铵、氯化铵和酵 母粉中的一种或多种的混合；所述无机盐为钠盐、钾盐、镁盐和钙盐中的一种或几种的 混合；所述生长因子为对氨基苯甲酸、维生素B1、生物素和玉米浆中的一种或几种的 混合。

本发明的有益效果在于：

本发明采用等离子体诱变拜氏梭菌，利用含阿魏酸的刃天青平板筛选出还原力较强 的菌株，该菌株能够在含0.8g/L阿魏酸的发酵培养基中正常生长，丁醇产量达到6.1 g/L，而同等条件培养的出发菌株基本不生长。并且，以未脱毒的玉米芯酸解糖液作为 碳源，在2L发酵罐中丁醇产量达到了6.4g/L，而同等条件培养的出发菌株基本不生长。 其抗逆性强、丁醇产量高、重复性好，是一种适合利用玉米芯等木质纤维原料发酵产丁 醇的优良菌种。

附图说明

本发明的微生物分类命名为拜氏梭菌Clostridium beijerinckii M11，保藏单位全称为 中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，邮编430072， 保藏编号为CCTCC NO：M2013423，保藏日期为2013年9月14日。

图1为拜氏梭菌的等离子体诱变存活率曲线。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实 施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会 限制权利要求书中所详细描述的本发明。

实施例1

本实施例说明将拜氏梭菌原始菌株进行第一步等离子体诱变的方法。

拜氏梭菌原始菌株进行第一步等离子体诱变的方法如下：

将拜氏梭菌NCIMB8052原始菌株活化培养，培养温度33～37℃，50ml肖特厌氧 瓶装液量为15～20ml，充氮气3min，培养时间12～18h，得到生长旺盛的菌液；取新 鲜培养的细胞稀释至细胞浓度OD₆₀₀=1～1.5，滴加在灭菌冷却后的载片上，用无菌空气 吹干；以氦气为放电气体，以100W作为射频功率，以10SLM作为气体流量，以10～ 1800s作为辐照时间对菌株进行等离子体诱变，诱变后，将载体上的菌膜洗脱下来，计 算存活率。实验结果如附图1所示；由图1可知，180s是最佳的诱变辐照时间。

实施例2

本实例说明筛选优良拜氏梭菌的方法。

其中，所使用的培养基配方（%为质量百分比）：

（1）固体平板培养基：酵母粉0.3%，蛋白胨0.5%，可溶性淀粉1%，乙酸铵0.2%， 氯化钠0.2%，七水合硫酸镁0.3%，磷酸二氢钾0.1%，磷酸氢二钾0.1%，七水合硫酸 亚铁0.01%，琼脂1.5%，pH6。

（2）刃天青平板培养基：酵母粉0.3%，蛋白胨0.5%，可溶性淀粉1%，乙酸铵0.2%， 氯化钠0.2%，七水合硫酸镁0.3%，磷酸二氢钾0.1%，磷酸氢二钾0.1%，七水合硫酸 亚铁0.01%，琼脂1.5%，刃天青0.002%，阿魏酸0.5%，pH6。

（3）种子培养基：酵母粉0.3%，蛋白胨0.5%，可溶性淀粉1%，乙酸铵0.2%，氯 化钠0.2%，七水合硫酸镁0.3%，磷酸二氢钾0.1%，磷酸氢二钾0.1%，七水合硫酸亚 铁0.01%，pH6。

（4）摇瓶发酵筛选培养基：葡萄糖3%，乙酸铵0.22%，磷酸二氢钾0.05%，磷酸 氢二钾0.05%，氯化钠0.001%，七水合硫酸镁0.02%，七水合硫酸亚铁0.001%，一水 合硫酸锰0.001%，玉米浆0.1%，pH6.6。

筛选步骤：

1、刃天青平板初筛

将诱变后的载片置于装有1～2ml生理盐水的具塞试管中，剧烈震荡，将载片上的 菌株洗脱，稀释成不同浓度涂布于含刃天青（0.002%）的培养基平板上，33～37℃厌氧 培养12～36h，挑选出变色圈明显大于出发菌的菌落50株。

2、摇瓶发酵筛选

将菌株M5，M11和原始菌株接入种子培养基扩大培养，培养温度35℃，250mL肖 特厌氧瓶装液量100mL，充氮气3min，培养时间12h。然后在发酵培养基中发酵，接 种量10%（v/v），发酵温度35℃，100mL肖特厌氧瓶装液量50mL，发酵时间72h后 检测各菌株的总溶剂产量和丁醇产量如表1所示：

表1

经过组合筛选获得的两株突变株在发酵过程中总溶剂产量和丁醇产量均明显高于 出发菌株，其中M11的总溶剂产量和丁醇产量也最高。这与平板筛选的结果一致。

实施例3

本实施例说明突变株M11的传代稳定性。

在以葡萄糖为碳源的发酵培养基中，检测突变株M11的传代稳定性，菌株M11传 代发酵试验结果如表2所示：

表2

从实验结果可知，经过7次连续传代，两株突变株的总溶剂产量和丁醇产量较稳定， 具有较好的传代稳定性，可作为进一步研究和开发的生产菌株。

实施例4

本实施例说明拜氏梭菌Clostridium beijerinckii M11对阿魏酸的高抗逆性。

本实施例所述的培养基配方（%为质量百分比）：

平板培养基：酵母粉0.3%，蛋白胨0.5%，可溶性淀粉1%，乙酸铵0.2%，氯化钠 0.2%，七水合硫酸镁0.3%，磷酸二氢钾0.1%，磷酸氢二钾0.1%，七水合硫酸亚铁0.01%， 琼脂1.5%，其余为水，pH6。

种子培养基：酵母粉0.3%，蛋白胨0.5%，可溶性淀粉1%，乙酸铵0.2%，氯化钠 0.2%，七水合硫酸镁0.3%，磷酸二氢钾0.1%，磷酸氢二钾0.1%，七水合硫酸亚铁0.01%， 其余为水，pH6。

发酵培养基：葡萄糖3%，乙酸铵0.22%，磷酸二氢钾0.05%，磷酸氢二钾0.05%， 氯化钠0.001%，七水合硫酸镁0.02%，七水合硫酸亚铁0.001%，一水合硫酸锰0.001%， 玉米浆0.1%，阿魏酸0.08%，其余为水，pH6.6。

将拜氏梭菌Clostridium beijerinckii M11接种至平板培养基厌氧培养，培养温度 35℃，培养时间12h。将平板培养的M11接种到种子培养基中，培养温度35℃，50mL 肖特厌氧瓶装液量30mL，充氮气3min，培养温度35℃，培养时间12h；将种子接种 到发酵培养基中，接种量10%(v/v)，发酵温度35℃，100mL肖特厌氧瓶装液量50mL， 充氮气3min，发酵培养72h后，检测丁醇产量达到了6.1g/L，而同等条件培养的C. beijerinckii IB4（CCTCC NO：M2010310）和出发菌株基本不生长。

实施例5

本实施例说明拜氏梭菌Clostridium beijerinckii M11利用玉米芯酸解糖液，在2L发 酵罐中发酵生产丁醇的工艺。

本实施例所述的培养基配方（%为质量百分比）：

平板培养基：酵母粉0.3%，蛋白胨0.5%，可溶性淀粉1%，乙酸铵0.2%，氯化钠 0.2%，七水合硫酸镁0.3%，磷酸二氢钾0.1%，磷酸氢二钾0.1%，七水合硫酸亚铁0.01%， 琼脂粉1.5%，其余为水，pH6。

种子培养基：酵母粉0.3%，蛋白胨0.5%，可溶性淀粉1%，乙酸铵0.2%，氯化钠 0.2%，七水合硫酸镁0.3%，磷酸二氢钾0.1%，磷酸氢二钾0.1%，七水合硫酸亚铁0.01%， 其余为水，pH6。

发酵培养基：乙酸铵0.22%，磷酸二氢钾0.05%，磷酸氢二钾0.05%，氯化钠0.001%， 七水合硫酸镁0.02%，七水合硫酸亚铁0.001%，一水合硫酸锰0.001%，玉米浆0.1%， 用未脱毒的玉米芯酸解糖液（总还原糖为3%）配置，其余为水，pH6.6。

将拜氏梭菌C.beijerinckii M11接种至平板培养基厌氧培养，培养温度35℃，培养 时间12h。将平板培养的IB4接种到种子培养基中，250mL肖特厌氧瓶装液量150mL， 充氮气3min，培养温度35℃，培养时间12h；将种子接种到装有1L发酵培养基的2L 发酵罐中，接种量10%（v/v），发酵温度35℃，连续通入氮气，流速为0.3L/min，发 酵培养72h后，检测丁醇产量达到了6.4g/L，而同等条件培养的出发菌株基本不生长。

实施例6

本实施例说明拜氏梭菌Clostridium beijerinckii M11对玉米芯酸解糖液的高抗逆性。

本实施例所述的培养基配方（%为质量百分比）：

平板培养基：酵母粉0.3%，蛋白胨0.5%，可溶性淀粉1%，乙酸铵0.2%，氯化钠 0.2%，七水合硫酸镁0.3%，磷酸二氢钾0.1%，磷酸氢二钾0.1%，七水合硫酸亚铁0.01%， 琼脂粉1.5%，其余为水，pH6。

种子培养基：酵母粉0.3%，蛋白胨0.5%，可溶性淀粉1%，乙酸铵0.2%，氯化钠 0.2%，七水合硫酸镁0.3%，磷酸二氢钾0.1%，磷酸氢二钾0.1%，七水合硫酸亚铁0.01%， 其余为水，pH6。

发酵培养基：乙酸铵0.22%，磷酸二氢钾0.05%，磷酸氢二钾0.05%，氯化钠0.001%， 七水合硫酸镁0.02%，七水合硫酸亚铁0.001%，一水合硫酸锰0.001%，玉米浆0.1%， 用未脱毒的玉米芯酸解糖液（总还原糖为4%）配置，其余为水，pH6.6。

将拜氏梭菌C.beijerinckii M11接种至平板培养基厌氧培养，培养温度35℃，培养 时间12h。将平板培养的IB4接种到种子培养基中，250mL肖特厌氧瓶装液量150mL， 充氮气3min，培养温度35℃，培养时间12h；将种子接种到装有1L发酵培养基的2L 发酵罐中，接种量10%（v/v），发酵温度35℃，连续通入氮气，流速为0.3L/min，发 酵培养72h后，检测丁醇产量达到了3.2g/L，而同等条件培养的C.beijerinckii IB4 （CCTCC NO：M2010310）和出发菌株均基本不生长。