单形拟杆菌L8及在降解琼胶或琼胶寡糖中的应用

摘要

本发明公开了一株新菌株--单形拟杆菌（Bacteroides uniformis）L8及在降解琼胶或琼胶寡糖中的应用，该菌株能够将分子量为100～300kDa的琼胶降解为琼胶寡糖并进一步降解为D-半乳糖，或者将分子量0.5～10kDa的琼胶寡糖最终降解为D-半乳糖，同时琼胶寡糖具有特异性促进Bacteroides uniformis生长的作用，从而达到调节肥胖引起的相关症状的作用。

说明书

（一）技术领域

本发明涉及一种琼胶或琼胶寡糖的降解菌株，特别涉及单形拟杆菌 （Bacteroides uniformis）L8在降解琼胶或琼胶寡糖中的应用。

（二）背景技术

琼胶是一种海洋红藻来源的多糖，主要由(l→3)-β-D-半乳糖（下称G） 和(1→4)-3,6-内醚-α-L-半乳糖(下称A)交替连接而成，琼胶因其特殊的凝 胶特性而作为食品添加剂广泛地应用于食品行业。琼胶经过酶降解或是 酸降解可以得到分子量相对较低的琼胶寡糖(下称AO)，近期研究发现琼 胶寡糖具有促进肠道中双歧杆菌生长的益生作用。

健康人的胃肠道内寄居着种类繁多的肠道菌群，大约为10¹⁴左右。 肠道菌群与宿主和环境之间始终处于动态平衡状态中，形成一个互相依 存，相互制约的系统，因而在机体防御功能正常时其对人体有益无害。 正常肠道菌群有着许多重要的生理功能，如对宿主糖尿病、高血压、高 血脂的调节作用、免疫作用、排毒作用以及抗肿瘤作用等，但一旦出现 肠道菌群失调，势必会扰乱这些正常的生理功能。

食用益生菌可达到维持胃肠道健康的目的，目前我国批准在食品中 使用的益生菌有20余种，主要是乳杆菌和双歧杆菌。研究显示益生菌具 有多种生理保健功能，包括对细胞免疫促进作用、处理乳糖不耐症、降 低血清胆固醇，调节人体肠道菌群平衡，抗过敏，抑制致癌物质及其他 有害微生物。

益生元是一种膳食补充剂，通过选择性的刺激一种或几种细菌的生 长与活性而对寄主产生有益的影响，从而改善寄主健康。成功的益生元 应是在通过上消化道时，大部分不被消化而能被肠道菌群所发酵的。最 重要的是它只是刺激有益菌群的生长，而不是有潜在致病性或腐败活性 的有害细菌。一般认为，益生元给益生菌提供“食物”，能够被肠道内 有益细菌分解吸收，促进有益细菌生长繁殖。

文献（Gauffin et al，PLoS One,2012,7(7):e41079）报道，Bacteroides  uniformis CECT7771具有调节肥胖引起的代谢和免疫功能紊乱的作用， 具有潜在的益生作用。我们的研究结果发现，琼胶寡糖具有特异性促进 Bacteroides uniformis生长的作用。因此，琼胶寡糖与Bacteroides uniformis 共同使用时，琼胶寡糖可以通过促进Bacteroides uniformis的增长，从而 起到调节肥胖引起的相关症状的作用。

（三）发明内容

本发明目的是提供一株新菌株--单形拟杆菌（Bacteroides uniformis） L8及在降解琼胶寡糖（AO）或琼胶（AP）中的应用。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一株新菌株--单形拟杆菌（Bacteroides uniformis）L8，保 藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为 CGMCC NO.8711，保藏日期为2014年1月10日，保藏地址为北京市朝 阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101。

本发明还提供所述单形拟杆菌L8在降解琼胶或琼胶寡糖中的应用， 具体所述的应用方法为：将单形拟杆菌L8经种子培养后获得的种子液以 体积浓度2～10%的接种量接种至琼胶或琼胶寡糖培养基中，25～42℃培 养，薄层色谱层析（TLC）跟踪检测至原料聚合度降低至7（即分子量 1098Da）以下，实现琼胶或琼胶寡糖的降解；

所述琼胶培养基终浓度组成为：琼胶0.5～1g/L、胰蛋白胨3g/L、蛋 白胨3g/L、酵母提取物4.5g/L、粘蛋白0.5g/L、3号胆盐0.4g/L、L- 半胱氨酸盐酸盐0.8g/L、血红素0.05g/L、1ml/L吐温80、NaCl4.5g/L、 KCl2.5g/L、MgCl₂·6H₂O4.5g/L、CaCl₂·6H₂O0.2g/L、KH₂PO₄0.4g/L、 微量元素2ml/L，溶剂为蒸馏水，pH值为6.4～6.5；所述微量元素终浓度 组成为:MgSO₄·7H₂O3.0g/L、CaCl₂·2H₂O0.1g/L、MnCl₂·4H₂O0.32g/L、 FeSO₄·7H₂O0.1g/L、CoSO₄·7H₂O0.18g/L、ZnSO₄·7H₂O0.18g/L、 CuSO₄·5H₂O0.01g/L、NiCl₂·6H₂O0.092g/L；

所述琼胶寡糖培养基终浓度组成为：将琼胶培养基中的琼胶用1～50 g/L琼胶寡糖替换，其他组成同琼胶培养基。

进一步，所述琼胶培养基中琼胶的浓度为0.5～1g/L，所述琼胶的分 子量为100～300kDa，优选琼胶培养基中琼胶的浓度为0.8～1g/L，所述琼 胶的分子量为100～300kDa。

进一步，所述琼胶寡糖培养基中琼胶寡糖的浓度为1～50g/L，所述琼 胶寡糖的分子量为0.5～10kDa，优选琼胶寡糖培养基中琼胶寡糖的浓度 为10～30g/L，所述琼胶寡糖的分子量为0.5～10kDa。

进一步，所述单形拟杆菌L8经种子培养后获得的种子液以体积比 4%～6%的接种量接种。

更进一步，所述单形拟杆菌L8在降解琼胶或琼胶寡糖中的应用为： （1）斜面培养：将单形拟杆菌L8接种至斜面培养基，25～42℃培养2～4 天，获得斜面菌体；所述斜面培养基为在琼胶寡糖培养基中添加质量终 浓度1.5%的琼脂粉；

（2）种子培养：从斜面菌体挑取菌落接种至种子培养基，25～42℃ 培养2～4天，获得种子液；所述种子培养基同琼胶寡糖培养基；

（3）发酵培养：将种子液以体积比4%～6%的接种量接种至琼胶或琼 胶寡糖培养基中，25～42℃培养，薄层层析法（TLC）跟踪检测至原料聚 合度降低至7（即分子量1098Da）以下，实现琼胶或琼胶寡糖的降解。

与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：本发明提供一株 新菌株--单形拟杆菌（Bacteroides uniformis）L8，该菌株能够将分子量 为100～300kDa的琼胶降解为D-半乳糖，或者将分子量0.5～10kDa的琼 胶寡糖降解为D-半乳糖，同时琼胶寡糖（分子量为0.5～10kDa）具有特 异性促进Bacteroides uniformis生长的作用，从而达到调节肥胖引起的相 关症状的作用。

（四）附图说明

图1为TLC检测B.uniformis L8对AO的降解作用的薄层层析图， Gal：D-半乳糖。

图2为HPLC检测B.uniformis L8降解AO终产物色谱图，曲线1 为单糖标准品HPLC色谱分析图，Man-甘露糖、Rha-鼠李糖、GalA-半乳 糖醛酸、Glc-葡萄糖、Gal-D-半乳糖、Xyl-鼠李糖；曲线2为单形拟杆菌 L8降解琼胶寡糖192h发酵液HPLC色谱分析图。

图3为TLC检测B.uniformis L8对AP的降解作用的薄层层析图。

图4为HPLC检测B.uniformis L8降解AP终产物色谱图，曲线1为 单糖标准品HPLC色谱分析图，Man-甘露糖、Rha-鼠李糖、GalA-半乳糖 醛酸、Glc-葡萄糖、Gal-半乳糖、Xyl-鼠李糖；曲线2为单形拟杆菌L8 降解琼胶192h发酵液HPLC色谱分析图。

（五）具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范 围并不仅限于此：

实施例1菌株L8的分离鉴定

（1）琼胶寡糖的制备与分子量测定

将10g琼胶加入1L蒸馏水中（10mg/mL）加热溶解后，加入1mol/L HCl水溶液至HCl终浓度为0.1mol/L，60℃水浴加热反应1h，反应结 束后，向反应液中加入1mol/L NaOH水溶液中和反应液pH值至7，然 后采用截留分子量为200～500Da的纳滤膜过滤除盐后，截留液50℃减 压浓缩蒸干，获得琼胶寡糖8g，记为AO。

取AO用0.1mol/L Na₂SO₄配制5mg/ml溶液，用TSK-GEL G3000 PWXL凝胶色谱柱（30cm×7.8mm），采用HP1260型高效液相色谱仪分 析测定，流动相为0.1mol/L Na₂SO₄水溶液，柱温25℃，流速0.5ml/min， 采用示差检测器（G1362A，美国安捷伦公司）和多角度激光散射仪 （DOWN HeleosⅡ，美国Wyatt公司）检测，经测量AO的分子量为0.5～10 kDa，AO的结构为G-[A-G]_n(n为正整数，1≤n≤31，G代表D-半乳糖， A代表3,6-内醚半乳糖)。

（2）培养基的配制

配制VI-AO液体培养基，具体成分如下：AO（分子量0.5～10kDa） 5g/L、胰蛋白胨3g/L、蛋白胨3g/L、酵母提取物4.5g/L、粘蛋白0.5 g/L、3#胆盐0.4g/L、L-半胱氨酸盐酸盐0.8g/L、血红素0.05g/L、吐 温801ml、NaCl4.5g/L、KCl2.5g/L、MgCl₂·6H₂O4.5g/L、CaCl₂·6H₂O 0.2g/L、KH₂PO₄0.4g/L、微量元素2ml/L，溶剂为蒸馏水，pH值为6.4～6.5， 灭菌后置于厌氧工作站。

微量元素终浓度组成为:MgSO₄·7H₂O3.0g/L、CaCl₂·2H₂O0.1g/L、 MnCl₂·4H₂O0.32g/L、FeSO₄·7H₂O0.1g/L、CoSO₄·7H₂O0.18g/L、 ZnSO₄·7H₂O0.18g/L、CuSO₄·5H₂O0.01g/L、NiCl₂·6H₂O0.092g/L。

（3）粪便的前处理

取1名志愿者新鲜粪便，用PBS（pH7.0）配成20%（wt/vol）的悬 浮液，充分混匀后用直径为2mm的金属筛过滤，除去大的食物颗粒，得 到粪便PBS溶液。

（4）接种培养

所得粪便PBS溶液接种至VI-AO培养基（接种体积终浓度为2%）， 37℃厌氧培养24h进行初步的富集培养。将培养液采用10倍稀释法涂 板，平板为VI-AO液体培养基加终浓度2wt%琼脂。平板置于厌氧工作站 中37℃培养72h后，于厌氧工作站中挑取单菌落至VI-AO液体培养基 中37℃培养144h后取样用于检测降解情况。

（5）薄层色谱层析（TLC）检测降解情况

所取样品离心后取上清0.2μL于硅胶板上点样，以D-半乳糖标准品 和反应0h的样品作为参照，置于甲酸：正丁醇：水（体积比为6:3:1） 展开剂中展开后，吹干，在orcinol显色剂（地衣酚-硫酸溶液）中浸润后 吹干，120℃加热3min进行显色。根据TLC结果得到可降解AO的阳 性克隆，记为菌株L8，图1为TLC检测菌株L8对AO的降解，从图1 可以看出培养48h以后琼胶寡糖被降解，培养96h后降解至终产物D- 半乳糖。

（6）降解菌的鉴定

a、菌株L8生理生化特性

表1菌株L8生化特性（其中-表示阴性，+表示阳性）

b、16S rDNA序列分析

DNA的提取：将步骤（5）得到的菌株L8采用QIAGEN粪便试剂盒 （Qiagen公司，德国）提取DNA。

16S rDNA全长扩增：

引物序列:

27f(5'-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3')，

1492r(5'-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3')

扩增体系：反应体系25μL，DNA模板100ng，10×PCR Buffer2.5μL， dNTP mix(10Mm each)0.5μL，10μM上下游引物各0.5μL，Taq酶(5 U/μL)0.2μL，加去离子水补足至25μL。

扩增条件：预变性94℃5min，循环94℃35S，55℃35S，72℃1 min，35个循环，延伸8min。

PCR产物纯化后送至生工生物工程有限公司（上海，中国）进行DNA 测序（SEQ ID NO：1所示），将测序结果提交NCBI数据库中进行Blast 比对，比对结果显示该菌株与B.uniformis同源性为99%，根据生理生化 特性及16S rDNA序列比对，将菌株L8鉴定为单形拟杆菌（B.uniformis）， 命名为单形拟杆菌（B.uniformis）L8。

SEQ ID NO：1序列为：

CAGCATGAACTTAGCTTGCTAAGTTTGATGGCGACCGGCGCACGGGTGAGTAACACGTATCCAACCTGC  CGATGACTCGGGGATAGCCTTTCGAAAGAAAGATTAATACCCGATGGCATAATTCTTCCGCATGGTAGAACTA  TTAAAGAATTTCGGTCATCGATGGGGATGCGTTCCATTAGGTTGTTGGCGGGGTAACGGCCCACCAAGCCTTC  GATGGATAGGGGTTCTGAGAGGAAGGTCCCCCACATTGGAACTGAGACACGGTCCAAACTCCTACGGGAGG  CAGCAGTGAGGAATATTGGTCAATGGACGAGAGTCTGAACCAGCCAAGTAGCGTGAAGGATGACTGCCCTAT  GGGTTGTAAACTTCTTTTATACGGGAATAAAGTGAGGCACGTGTGCCTTTTTGTATGTACCGTATGAATAAGGA  TCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGATCCGAGCGTTATCCGGATTTATTGGGTTTAAAG  GGAGCGTAGGCGGACGCTTAAGTCAGTTGTGAAAGTTTGCGGCTCAACCGTAAAATTGCAGTTGATACTGGG  TGTCTTGAGTACAGTAGAGGCAGGCGGAATTCGTGGTGTAGCGGTGAAATGCTTAGATATCACGAAGAACTC  CGATTGCGAAGGCAGCTTGCTGGACTGTAACTGACGCTGATGCTCGAAAGTGTGGGTATCAAACAGGATTAG  ATACCCTGGTAGTCCACACAGTAAACGATGAATACTCGCTGTTTGCGATATACAGTAAGCGGCCAAGCGAAA  GCGTTAAGTATTCCACCTGGGGAGTACGCCGGCAACGGTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACA  AGCGGAGGAACATGTGGTTTAATTCGATGATACGCGAGGAACCTTACCCGGGCTTGAATTGCAACTGAATGA  TGTGGAGACATGTCAGCCGCAAGGCAGTTGTGAAGGTGCTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGCCGTGAGGT  GTCGGCTTAAGTGCCATAACGAGCGCAACCCTTATCGATAGTTACCATCAGGTTATGCTGGGGACTCTGTCGA  GACTGCCGTCGTAAGATGTGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCAGCACGGCCCTTACGTCCGGGGCTAC  ACACGTGTTACAATGGGGGGTACAGAAGGCAGCTACACGGCGACGTGATGCTAATCCCGAAAGCCTCTCTCA  GTTCGGATTGGAGTCTGCAACCCGACTCCATGAAGCTGGATTCGCTAGTAATCGCGCATCAGCCACGGCGCG  GTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCAAGCCATGAAAGCCGGGGGTACCTGAAGTGCGTAA  CCGCAAGGAGCGCCCTAGGGTAAAACTGGTGACTGGGGCTAAG

实施例2单形拟杆菌L8对琼胶寡糖的降解作用

将实施例1中VI-AO液体培养基中的AO分别替换为终浓度1g/L、 30g/L和50g/L的琼胶寡糖（平均分子量0.5～10kDa），得到VI-AO-1、 VI-AO-30和VI-AO-50培养基。斜面培养基为实施例1中VI-AO液体培 养基中加入终浓度1.5wt%的琼脂粉，种子液培养基为实施例1中VI-AO 液体培养基。

将单形拟杆菌L8接种至斜面培养基，37℃培养3天，获得斜面菌 体；从斜面菌体挑单克隆至种子液培养基，37℃培养3天，获得种子液， 将种子液以6%体积比分别接种至VI-AO-1，VI-AO-30和VI-AO-50液体 培养基，在37℃厌氧培养，分别培养至48h、96h、144h、192h取样， 分析降解情况、降解产物结构及降解能力。

（1）降解情况分析

采用薄层色谱层析法（方法同实施例1步骤（5））检测单形拟杆菌L8 对1g/L、30g/L和50g/L AO的降解，具体降解情况见表2，由表2可知， 单形拟杆菌L8可以降解1～50g/L范围内的AO。

表2B.uniformis L8对不同浓度AO的降解情况

AO浓度（g/L） 是否降解 1 降解 30 降解 50 降解

（2）HPLC分析降解终产物的结构

取100μL单形拟杆菌L8在AO终浓度30g/L的VI-AO液体培养基中发 酵培养192h获得的发酵液，采用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）柱前 衍生化高效液相色谱法测定单糖组成（具体方法参照：付海宁等，岩藻 多糖单糖组成分析的四种色谱方法比较，中国海洋药物，2008,27(4): 30）。通过与单糖标准品（甘露糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳 糖、木糖）保留时间的对照，确定最终降解产物为D-半乳糖(见图2)，分 子量为180Da。

（3）硫酸苯酚法分析降解后剩余AO含量

准确配制0.5mg/mL的标准D-半乳糖水溶液，精确吸取10、20、30、 40、50μL，加水补至100μL，加入6%（W/V）苯酚200μL，快速加入 浓硫酸（质量浓度98%）1.5mL，振荡摇匀，100℃水浴加热10min， 冷却后在490nm测吸光度。以100μL蒸馏水按同样操作作为空白，以 D-半乳糖质量作为横坐标，吸光度作为纵坐标绘制D-半乳糖标准曲线， 回归方程为y=0.0157x+0.0115（R²=0.9991），x为D-半乳糖质量，y 为吸光值。

取100μL单形拟杆菌L8在AO终浓度30g/L的VI-AO液体培养基 中发酵培养192h获得的发酵液离心取40μL上清液按D-半乳糖标准曲 线的操作，490nm检测吸光度，以D-半乳糖标准曲线回归方程计算发酵 液总糖含量。经计算，发酵液中剩余AO含量为3.25g/L，证明单形拟杆 菌L8可以降解AO，降解率为89%。

实施例3单形拟杆菌L8对琼胶（AP）的降解作用

将实施例1中VI-AO液体培养基的AO替换成AP（分子量为100～300 kDa），培养基中AP的终浓度分别为0.5g/L和1g/L，配制VI-AP-0.5和 VI-AP-1液体培养基。斜面培养基为实施例1中VI-AO液体培养基中加 入终浓度1.5wt%的琼脂粉，种子液培养基为实施例1中VI-AO液体培养 基。

将单形拟杆菌L8接种至斜面培养基，37℃培养3天，从斜面菌体 挑单克隆接种至种子培养基，37℃培养3天，获得种子液后，将种子液 以体积浓度6%的接种量分别接种至VI-AP-0.5液体培养基和VI-AP-1液 体培养基，37℃厌氧培养，分别于0h、48h、96h、144h和192h取样， 分析降解情况、降解产物结构及降解能力。

（1）降解情况

采用薄层色谱层析法检测降解情况，TLC显示培养基中AP终浓度为 0.5g/L和1g/L时，B.uniformis L8可以降解AP（表3），图3为TLC分 析AP终浓度为1g/L时的降解情况，图3表明反应48h以后琼胶被降解 为琼胶寡糖，反应96h后进一步降解至终产物。

（2）HPLC分析降解产物的结构

取100μl单形拟杆菌L8在AP终浓度为1g/L的VI-AP-1液体培养 基192h发酵液，采用实施例2中PMP-衍生法测定终产物的结构，通过 与单糖标准品（甘露糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、D-半乳糖、木 糖）保留时间的对照，确定最终降解产物为D-半乳糖（图4）。

（3）硫酸苯酚法测量L8降解后剩余AP含量

D-半乳糖标准曲线的制作同实施例2。

取100μL单形拟杆菌L8在AP终浓度1g/L的VI-AP-1液体培养基 中发酵培养192h获得的发酵液按实施例2方法，490nm检测吸光度， 以标准曲线回归方程计算总糖含量。经计算，发酵液中剩余AP含量为 0.3g/L，证明单形拟杆菌L8可以降解AP，降解率为70%。

表3B.uniformis L8对不同浓度AP的降解情况

AP浓度（g/L） 是否降解 0.5 降解 1.0 降解

实施例4琼胶寡糖在小瓶发酵中促进B.uniformis L8增殖

1.琼胶寡糖的制备方法及分子量测定同实施例1。

2.培养基的配制同实施例1中VI-AO的配制。

3.粪便的前处理

取3名志愿者新鲜粪便，处理方法同实施例1，获得粪便PBS溶液。

4.接种培养

所得粪便PBS溶液分别接种至VI-AO液体培养基（接种体积终浓度 为2%），37℃厌氧培养，并分别于0h和48h取样，分别编号为No.1、 No.2和No.3。

5.采用QIAGEN粪便试剂盒（Qiagen公司，德国）提取0h和48h 发酵液以及单形拟杆菌L8的DNA。

6.RT-Time PCR比较0h和48h发酵液中B.uniformis L8的数量

（1）引物选择：

采用文献报道Bacteroides uniformis特异引物（Eiji Ishikawa等，J  Biosci Bioeng.2013，116(2):265-70）

Buni188-F（TTCTTCCGCATGGTAGAAC），

Buni590-R（CTTTCACAACTGACTTAAGCG）

（2）扩增体系：反应体系25μL，DNA模板100ng（即Bacteroides  uniformis L8DNA），10×PCR Buffer2.5μL，dNTP mix0.5μL，10μM上 下游引物各0.5μL，Taq酶(5U/μL)0.2μL，加去离子水补足至25μL。

（3）扩增条件：预变性94℃5mim，循环94℃35S，55℃35S， 72℃1min，35个循环，延伸8min。

（4）外标准品的制备：应用特异性引物Buni188-F和Buni590-R扩 增的片段采用电泳检测后进行胶回收纯化，将纯化片段与pMD18-T载体 连接，连接后转化到大肠杆菌感受态细胞DH-5α中，挑选阳性克隆测序， 将验证过的阳性克隆提取质粒，采用微量核酸测定仪Nano Drop2000 （Thermo，USA）测定质粒浓度后，代入公式1计算得线性质粒溶液的 浓度为2.94×10⁸拷贝数/ng质粒DNA（公式1即：每1μg质粒DNA的 拷贝数=9.1×10¹¹/质粒DNA的大小（kb）），将提取得到的质粒用去离子 水按10倍梯度稀释，使用稀释后2.94×10⁸-2.94×10¹拷贝数/ng质粒DNA 作为标准曲线的模板，以供后续样品中该菌属的定量测定。

（5）RT-Time PCR测定粪便和发酵液中B.uniformis L8的数量

反应条件：20μL的反应体系，其中：2×SYBR Green Realtime PCR  Master Mix(Toyobo,Japan)10μL，上下游引物各0.5μM，DNA模板（分 别为步骤6中（4）所得标准曲线所用浓度的质粒DNA、步骤5中提取0 和48h发酵液DNA）加入20ng。

反应程序：95℃预变性1min；95℃变性15s，55℃15s，72℃ 延伸15s，共进行40个循环。

荧光定量的标准曲线是以PCR反应模板的浓度（取log值）为横坐 标，以Crossing Point值（CP值）为纵坐标所作的关于模板浓度与CP值 关系的曲线。该曲线的方程Y=-4.079X+47.258（R²=0.991），Y是CP值， X是模板浓度。

根据标准曲线计算得到0h和48h发酵液中B.uniformis L8数量见表 3，从表中可以看出，发酵液中B.uniformis L8数量明显高于粪便，说明 AO可以促进B.uniformis L8的增殖。

表3粪便和发酵液中B.uniformis L8数量