一种多花黑麦草组织培养再生体系的建立方法

摘要

本发明公开了一种能够为选育多花黑麦草优良品种提供技术参考的多花黑麦草组织培养再生体系的建立方法。本发明采用多花黑麦草成熟种子作为外植体，将多花黑麦草成熟种子清洗灭菌后接种到愈伤组织诱导培养基中培养18～22d得到愈伤组织，接着将愈伤组织转入愈伤组织继代培养基中培养18～22d，再将其转接到愈伤组织分化培养基中培养18～22d，当幼苗长至2～3cm时，将幼苗接入生根培养基中培养20～30d，通过上述方法建立了高效的多花黑麦草组织培养再生体系，为建立多花黑麦草组织高效遗传转化体系奠定基础，为选育多花黑麦草组织优良品种提供了技术参考。适合在生物技术领域推广运用。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种多花黑麦草组织培养再生体系的建立方法。

背景技术

多花黑麦草是一年生或越年生植物，须根密集细弱，秆多数，直立高50～70厘米。穗状 花序扁平。多花黑麦草适口性好，各种家畜均喜采食。多花黑麦草适于刈割青饲，调制优质 干草，亦可放牧利用，也是养鱼的好饵料，我国南方各省区多利用鱼塘边旁种植，用以饲喂 草鱼。多花黑麦草品质优良，含有丰富的蛋白质，叶丛期由于茎秆少而叶量多，质量更佳。 多花黑麦草是重要的一年生或短期多年生禾本科牧草，适于作为大田轮作中的冬春作物。

多花黑麦草具有生长迅速、分蘖能力强、产量高、耐瘠薄等优良特性，是中国南方草地 农业生产中广泛使用的草种。但是，由于田间杂草与多花黑麦草之间进行着强烈竞争，严重 影响了多花黑麦草的产量及品质。为了提高多花黑麦草田间除杂效率，降低牧草生产成本， 需选育品种优良的多花黑麦草，以提高多花黑麦草的竞争力，但是，迄今尚未见到关于建立 多花黑麦草组织培养再生体系及转基因技术相关研究，不能为选育多花黑麦草优良品种提供 技术参考。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种能够为选育多花黑麦草优良品种提供技术参考的 多花黑麦草组织培养再生体系的建立方法。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案为：该多花黑麦草组织培养再生体系的建立方 法，包括以下步骤：

A、采用多花黑麦草成熟种子作为外植体，将多花黑麦草成熟种子清洗灭菌后接种到愈 伤组织诱导培养基中培养18～22d得到愈伤组织，所述愈伤组织诱导培养基由MS培养基、1～ 5mg/L的2,4-D和0.5～3mg/L的6-BA组成；

B、将愈伤组织转入愈伤组织继代培养基中培养18～22d，所述愈伤组织继代培养基由 MS培养基、1～3mg/L的2,4-D和0～0.3mg/L的6-BA组成；

C、将经过步骤B处理的愈伤组织转接到愈伤组织分化培养基中培养18～22d，所述愈伤 组织分化培养基由MS培养基、0.5～2mg/L的6-BA组成；

D、当幼苗长至2～3cm时，将幼苗接入生根培养基中培养20～30d，所述生根培养基由 1/2MS培养基组成；

E、当幼苗根系长出后，将其移栽。

进一步的是，在步骤A中，对多花黑麦草成熟种子清洗灭菌的处理方式如下所述：首先， 将多花黑麦草成熟种子放入瓶中，并在瓶中添加水和洗涤剂浸泡12小时，所述水与洗涤剂的 比例为1:3，接着再用清水冲走漂浮在液面上的不实种子，然后转移至超净工作台，先将挑选 出的种子浸泡在75％的乙醇溶液中1～2min，再转到浓度为0.1％的HgCl₂溶液中消毒8min， 消毒后用无菌水冲洗集几次并用双层无菌滤纸吸干。

进一步的是，所述愈伤组织诱导培养基、愈伤组织继代培养基、愈伤组织分化培养基中 含有的MS培养基包括KNO₃、NH₄NO₃、MgSO4·7H₂O、KH₂PO₄、CaCl₂·2H₂O、MnSO₄·4H₂O、 ZnSO₄·7H₂O、H₃BO₃、KI、NaMoO₄·2H₂O、CuSO₄·5H₂O、CoCl₂·6H₂O、Na₂-EDTA、FeSO₄·4H₂O、 甘氨酸、盐酸硫胺素、盐酸吡哆醇、烟酸、肌醇、蔗糖、琼脂，各组分的含量如下所述：KNO₃为1900mg/L，NH₄NO₃为1650mg/L，MgSO4·7H₂O为370mg/L，KH₂PO₄为170mg/L，CaCl₂·2H₂O 为440mg/L，MnSO₄·4H₂O为22.3mg/L，ZnSO₄·7H₂O为8.6mg/L，H₃BO₃为6.2mg/L，KI为 0.83mg/L，NaMoO₄·2H₂O为0.25mg/L，CuSO₄·5H₂O为0.025mg/L，CoCl₂·6H₂O为0.025mg/L， Na₂-EDTA为37.3mg/L，FeSO₄·4H₂O为27.8mg/L，甘氨酸为2.0mg/L，盐酸硫胺素为0.1mg/L， 盐酸吡哆醇为0.5mg/L，烟酸为0.5mg/L，肌醇为100mg/L，蔗糖30g/L、琼脂8g/L，pH值为 6.0。

进一步的是，在步骤A中，所述愈伤组织诱导培养中含有的2,4-D为2mg/L，含有的6-BA 为1mg/L。

进一步的是，在步骤B中，所述愈伤组织继代培养基中含有的2,4-D为2mg/L，含有的 6-BA为0.2mg/L。

进一步的是，在步骤C中，所述愈伤组织分化培养基中含有的6-BA为1mg/L。

进一步的是，在步骤C中，所述培养条件为培养温度25±2℃、光照强度1000lx。

进一步的是，所述生根培养基含有的1/2MS培养基包括KNO₃、NH₄NO₃、MgSO4·7H₂O、 KH₂PO₄、CaCl₂·2H₂O、MnSO₄·4H₂O、ZnSO₄·7H₂O、H₃BO₃、KI、NaMoO₄·2H₂O、CuSO₄·5H₂O、 CoCl₂·6H₂O、Na₂-EDTA、FeSO₄·4H₂O、甘氨酸、盐酸硫胺素、盐酸吡哆醇、烟酸、肌醇、蔗 糖、琼脂，各组分的含量如下所述：KNO₃为950mg/L，NH₄NO₃为825mg/L，MgSO4·7H₂O 为185mg/L，KH₂PO₄为85mg/L，CaCl₂·2H₂O为220mg/L，MnSO₄·4H₂O为11.15mg/L， ZnSO₄·7H₂O为4.3mg/L，H₃BO₃为3.1mg/L，KI为0.415mg/L，NaMoO₄·2H₂O为0.125mg/L， CuSO₄·5H₂O为0.0125mg/L，CoCl₂·6H₂O为0.0125mg/L，Na₂-EDTA为37.3mg/L，FeSO₄·4H₂O 为27.8mg/L，甘氨酸为2.0mg/L，盐酸硫胺素为0.1mg/L，盐酸吡哆醇为0.5mg/L，烟酸为 0.5mg/L，肌醇为100mg/L，蔗糖30g/L、琼脂8g/L，pH值为6.0。

进一步的是，在步骤D中，所述培养条件为培养温度23±2℃，光照强度为800～1000lx， 光照时间为每天16小时。

本发明的有益效果在于：本发明采用多花黑麦草成熟种子作为外植体，将多花黑麦草成 熟种子清洗灭菌后接种到愈伤组织诱导培养基中培养18～22d得到愈伤组织，由MS培养基、 1～5mg/L的2,4-D和0.5～3mg/L的6-BA组成的愈伤组织诱导培养基可以大大提高诱导率， 接着将愈伤组织转入愈伤组织继代培养基中培养18～22d，由MS培养基、1～3mg/L的2,4-D 和0～0.3mg/L的6-BA组成的愈伤组织继代培养基可以使愈伤组织增殖最快且质量好，再将 其转接到愈伤组织分化培养基中培养18～22d，由MS培养基、0.5～2mg/L的6-BA组成的 愈伤组织分化培养基可以大大提高分化率，当幼苗长至2～3cm时，将幼苗接入生根培养基 中培养20～30d，由1/2MS培养基组成的生根培养基可以大大幼苗的生根率且根系较为健壮， 通过上述方法建立了高效的多花黑麦草组织培养再生体系，为建立多花黑麦草组织高效遗传 转化体系奠定基础，为选育多花黑麦草组织优良品种提供了技术参考。

具体实施方式

本发明采用多花黑麦草成熟种子作为外植体，将多花黑麦草成熟种子清洗灭菌后接种到 愈伤组织诱导培养基中培养18～22d得到愈伤组织，由MS培养基、1～5mg/L的2,4-D和 0.5～3mg/L的6-BA组成的愈伤组织诱导培养基可以大大提高诱导率，接着将愈伤组织转入 愈伤组织继代培养基中培养18～22d，由MS培养基、1～3mg/L的2,4-D和0～0.3mg/L的 6-BA组成的愈伤组织继代培养基可以使愈伤组织增殖最快且质量好，再将其转接到愈伤组织 分化培养基中培养18～22d，由MS培养基、0.5～2mg/L的6-BA组成的愈伤组织分化培养 基可以大大提高分化率，当幼苗长至2～3cm时，将幼苗接入生根培养基中培养20～30d，由 1/2MS培养基组成的生根培养基可以大大幼苗的生根率且根系较为健壮，通过上述方法建立 了高效的多花黑麦草组织培养再生体系，为建立多花黑麦草组织高效遗传转化体系奠定基础， 为选育多花黑麦草组织优良品种提供了技术参考。具体的，本发明所述的多花黑麦草组织培 养再生体系的建立方法，具体包括以下步骤：

A、采用多花黑麦草成熟种子作为外植体，将多花黑麦草成熟种子清洗灭菌后接种到愈 伤组织诱导培养基中培养18～22d得到愈伤组织，所述愈伤组织诱导培养基由MS培养基、1～ 5mg/L的2,4-D和0.5～3mg/L的6-BA组成，所述2,4-D是2,4-二氯苯氧乙酸 2,4-dichlorophenoxy-acetic acid的缩写，所述6-BA是6-苄基氨基嘌呤6-Benzylaminopurine的 缩写；

B、将愈伤组织转入愈伤组织继代培养基中培养18～22d，所述愈伤组织继代培养基由 MS培养基、1～3mg/L的2,4-D和0～0.3mg/L的6-BA组成；

C、将经过步骤B处理的愈伤组织转接到愈伤组织分化培养基中培养18～22d，所述愈伤 组织分化培养基由MS培养基、0.5～2mg/L的6-BA组成；

D、当幼苗长至2～3cm时，将幼苗接入生根培养基中培养20～30d，所述生根培养基由 1/2MS培养基组成；

E、当幼苗根系长出后，将其移栽。

在上述多花黑麦草组织培养再生体系的建立方法过程中，在步骤A中，对多花黑麦草成 熟种子清洗灭菌的处理方式可以采用多种方式，为了使清洗效果、杀菌效果达到最佳，本发 明采用如下所述的方式：首先，将多花黑麦草成熟种子放入瓶中，并在瓶中添加水和洗涤剂 浸泡12小时，所述水与洗涤剂的比例为1:3，接着再用清水冲走漂浮在液面上的不实种子， 然后转移至超净工作台，先将挑选出的种子浸泡在75％的乙醇溶液中1～2min，再转到浓度为 0.1％的HgCl₂溶液中消毒8min，消毒后用无菌水冲洗3次并用双层无菌滤纸吸干。

所述愈伤组织诱导培养基、愈伤组织继代培养基、愈伤组织分化培养基中含有的MS培 养基包括KNO₃、NH₄NO₃、MgSO4·7H₂O、KH₂PO₄、CaCl₂·2H₂O、MnSO₄·4H₂O、ZnSO₄·7H₂O、 H₃BO₃、KI、NaMoO₄·2H₂O、CuSO₄·5H₂O、CoCl₂·6H₂O、Na₂-EDTA、FeSO₄·4H₂O、甘氨酸、 盐酸硫胺素、盐酸吡哆醇、烟酸、肌醇、蔗糖、琼脂，各组分的含量如下所述：KNO₃为1900mg/L， NH₄NO₃为1650mg/L，MgSO4·7H₂O为370mg/L，KH₂PO₄为170mg/L，CaCl₂·2H₂O为440mg/L， MnSO₄·4H₂O为22.3mg/L，ZnSO₄·7H₂O为8.6mg/L，H₃BO₃为6.2mg/L，KI为0.83mg/L， NaMoO₄·2H₂O为0.25mg/L，CuSO₄·5H₂O为0.025mg/L，CoCl₂·6H₂O为0.025mg/L，Na₂-EDTA 为37.3mg/L，FeSO₄·4H₂O为27.8mg/L，甘氨酸为2.0mg/L，盐酸硫胺素为0.1mg/L，盐酸吡 哆醇为0.5mg/L，烟酸为0.5mg/L，肌醇为100mg/L，蔗糖30g/L、琼脂8g/L，pH值为6.0。 这种配方是专门针对多花黑麦草配置的，更加适宜多花黑麦草组织培养。

将多个多花黑麦草成熟种子清洗灭菌后接种到不同的愈伤组织诱导培养基中，其不同的 愈伤组织培养基含有的MS培养基相同，其含有的2,4-D和6-BA的质量浓度如下表1所示， 然后在25±2℃的培养室中黑暗培养20d，观察愈伤组织的质量并统计愈伤组织数计算愈伤组 织诱导率，其结果如表1所示：

表1

注：同列不同小写字母表示LSD法多重比较的结果：大写字母表示6-BA浓度相同时不 同2,4-D浓度之间的差异显著，小写字母表示2,4-D浓度相同时不同6-BA浓度之间的差异 显著(P<0.05)。

由表1可见，不同2,4-D浓度诱导的多花黑麦草愈伤组织诱导率差异较显著(P<0.05)， 不同6-BA浓度诱导的多花黑麦草愈伤组织诱导率差异也较显著(P<0.05)。当所述愈伤组织 诱导培养中含有的2,4-D为2mg/L、含有的6-BA为1mg/L时的胚性愈伤组织诱导率最高， 达60.42％，而且愈伤组织生长速度快、品质最好，呈淡黄色、致密、较大(直径>1cm)颗 粒。

将经过愈伤组织诱导培养基培养得到的愈伤组织转入不同的愈伤组织继代培养基中，其 不同的愈伤组织继代培养基含有的MS培养基相同，其含有的2,4-D和6-BA的质量浓度如 下表2所示，然后在培养室中黑暗培养20d，观察愈伤组织的质量并统计愈伤组织最终重量， 然后计算增值系数，其结果如表2所示：

表2

继代培养主要作用是使愈伤组织扩增，更有利于培养出更多的再生植株。由表2可知， 所述愈伤组织继代培养基中含有的2,4-D为2mg/L、6-BA为0.2mg/L时增值系数均值最大， 且愈伤组织呈淡黄色的致密颗粒。

将经过愈伤组织继代培养基处理的愈伤组织转接到不同的愈伤组织分化培养基中培养 20d，其不同的愈伤组织分化培养基含有的MS培养基相同，其含有的6-BA的质量浓度如下 表3所示，然后在培养温度25±2℃、光照强度1000lx条件下培养20d，统计绿苗分化率、平 均芽点数，其结果如表3所示：

表3

注：每列末尾不同小写字母表示在0.05水平上的显著差异。

愈伤组织接种于分化培养基3d后，一些淡黄色的愈伤组织开始生长出幼嫩的绿色芽点； 一些愈伤组织继续生长增大但不出现绿色芽点，经过7d左右培养，绿色芽点长成一棵棵细 小直立或宽大弯曲的幼苗；而继续生长增大的愈伤组织则出现分化，由表3可知，当所述愈 伤组织分化培养基中含有的6-BA为1mg/L，分化率达到最高，其均值数达到66.18％，平均芽 点数也较多，达到57.83。

当苗长至2～3cm时，将幼苗接入生根培养基中，所述生根培养基仅有1/2MS培养基组成， 所述1/2MS培养基包括KNO₃、NH₄NO₃、MgSO4·7H₂O、KH₂PO₄、CaCl₂·2H₂O、MnSO₄·4H₂O、 ZnSO₄·7H₂O、H₃BO₃、KI、NaMoO₄·2H₂O、CuSO₄·5H₂O、CoCl₂·6H₂O、Na₂-EDTA、FeSO₄·4H₂O、 甘氨酸、盐酸硫胺素、盐酸吡哆醇、烟酸、肌醇、蔗糖、琼脂，各组分的含量如下所述：KNO₃为950mg/L，NH₄NO₃为825mg/L，MgSO4·7H₂O为185mg/L，KH₂PO₄为85mg/L，CaCl₂·2H₂O 为220mg/L，MnSO₄·4H₂O为11.15mg/L，ZnSO₄·7H₂O为4.3mg/L，H₃BO₃为3.1mg/L，KI 为0.415mg/L，NaMoO₄·2H₂O为0.125mg/L，CuSO₄·5H₂O为0.0125mg/L，CoCl₂·6H₂O为 0.0125mg/L，Na₂-EDTA为37.3mg/L，FeSO₄·4H₂O为27.8mg/L，甘氨酸为2.0mg/L，盐酸硫 胺素为0.1mg/L，盐酸吡哆醇为0.5mg/L，烟酸为0.5mg/L，肌醇为100mg/L，蔗糖30g/L、琼 脂8g/L，pH值为6.0，将幼苗接入上述生根培养基中后，在培养温度为23±2℃、光照强度为 800～1000lx、光照时间为每天16小时条件下培养20～30d，然后观察生根率，经过试验研究表 明，在仅有1/2MS培养基组成的生根培养基中，根系一般呈乳白色，生根率高达为93.33％。