一种利用冰点前临界低温长期保存香港牡蛎眼点幼虫的方法

摘要

本发明公开了一种利用冰点前临界低温长期保存香港牡蛎眼点幼虫的方法。它包括a、幼虫冷藏：采集浓缩香港牡蛎眼点幼虫，将其用海水润湿的筛绢网装好扎成包，再用海水润湿的海绵包裹封好，置于0-1℃下冷藏；b、对步骤a冷藏的眼点幼虫喷洒海水于其海绵上，使其保持湿润；c、幼虫解冻：将步骤b冷藏的眼点幼虫从低温环境中取出，利用常温海水润湿，之后放入容器中，将其搅匀，待完全恢复常温后，即获得眼点幼虫。本发明保存的眼点幼虫，几乎尚未出现冻伤现象，可有效的提高采苗效率，90%以上可以完成变态。本发明为研究香港牡蛎幼虫低温生物学、干法幼虫运输、规模化苗种同步生产等提供了理论与实践基础。本发明具有操作简便、实用性强等优点。

说明书

技术领域：

本发明属于现代海洋农业中贝类苗种繁育技术领域，具体涉及一种利用冰点前临界低 温长期保存香港牡蛎眼点幼虫的方法。

背景技术：

低温生物学是20世纪50年代发展起来的一门新兴的学科，目前这门学科已经在人、畜 等的配子和胚胎的保存方面获得了广泛的应用（常万存等，1998）。虽然超低温冷冻技术在 海洋生物中已得到了广泛应用，但是由于某些海洋生物的卵子比较大，且含有大量的卵黄、 油滴等，增加了冷冻保存的难度，故这方面的研究集中在海洋生物精子的低温保存研究上 （李永仁等，2005）。

目前，低温保存精子技术已经在多种经济鱼、虾、贝类上获得了成功，并得到实际应 用。在贝类配子、胚胎的保存上也已经取得了突破性的进展，特别是对于牡蛎早期担轮幼 虫的超低温保存技术，已达到商业化的规模（张岩等，2004）。虽然，有个别报道牡蛎幼虫 低温短期保存研究（于瑞海等，2006），但尚未见低温长期保存香港牡蛎眼点幼虫的相关报 道。

发明内容：

针对于当前香港牡蛎眼点幼虫尚无有效长期保存措施的现状，结合香港牡蛎眼点幼虫 耐低温的生物学特性，本发明通过幼虫采集、幼虫冷藏、幼虫管理等技术手段提供了一种 利用冰点前临界低温长期保存香港牡蛎眼点幼虫的方法。

本发明的利用冰点前临界低温长期保存香港牡蛎眼点幼虫的方法，其特征在于，包括 以下步骤：

a、幼虫冷藏：采集浓缩香港牡蛎眼点幼虫，将其用海水润湿的筛绢网装好扎成包， 再用海水润湿的海绵包裹封好，置于0-1℃下冷藏；

b、对步骤a冷藏的眼点幼虫喷洒海水于其海绵上，使其保持湿润；冷藏时间一般可 以达到≤90d。

c、幼虫解冻：将步骤b冷藏的眼点幼虫从低温环境中取出，利用常温海水润湿，之 后放入容器中，将其搅匀，大约15-20min后，待完全恢复常温后，即获得眼点幼虫。幼 虫解冻过程中，90%以上眼点幼虫可以在海水中浮游，处于存活状态。可将解冻后存活的 眼点幼虫投入盛有新鲜海水的下好附着基水泥池中采苗。

所述的步骤a的采集浓缩香港牡蛎眼点幼虫是利用80目筛绢网（网孔最大孔径 250μm）浓缩香港牡蛎眼点幼虫。

所述的步骤a的海水润湿的筛绢网为500目筛绢网（网孔最大孔径20μm）。

所述的步骤a中采集浓缩的香港牡蛎眼点幼虫，壳高在320-360μm，壳长在270-300μm。

所述的步骤a中将香港牡蛎眼点幼虫用海水润湿的筛绢网装好扎成包，每包眼点幼虫 装限制在≤1kg，防止大量幼虫推挤对幼虫自身造成损伤。

所述的步骤b的对步骤a冷藏的眼点幼虫喷洒海水于其海绵上，使其保持湿润，是为 了防止眼点幼虫体内脱水，使其处于湿润氛围下的干燥状态，空气湿度维持在100%以上。

所述的步骤b的喷洒海水，其频率为5-7天一次。

在贝类幼虫低温保存技术研究中，李一峰等（2012）公开了《厚壳贻贝早期幼虫低温 保存的影响研究》的对比文件1。对比文件1与本发明相比，具有以下不同点，①保存对象 不同：对比文件保存的是厚壳贻贝，而本发明保存的是香港牡蛎。②保存阶段不同：对比 文件1保存的D形幼虫，即前期面盘幼虫；而本发明保存是眼点幼虫，为面盘后期幼虫。③保 存方式不同：对比文件保存时采用的在海水中低密度保存，保存幼虫数量及其有限（≤25个 幼虫/mL海水）；而本发明采用的干法保存，可以保存大量幼虫（≥10万个/g）。④保存管理 流程不同：对比文件1保存过程中需要投喂饵料，步骤繁琐；而本发明勿需投喂任何饵料。

于瑞海等（2006）公开了《不同发育期的太平洋牡蛎在不同干露状态下的成活率研究》 对比文件2。对比文件2与本发明相比，具有以下不同点，①保存对象不同：对比文件2 保存的是长牡蛎，而本发明保存的是香港牡蛎。长牡蛎主要分布在我国北方温带区域，喜 好高盐低温纯海水环境，年产量在80万吨左右；而香港牡蛎主要分布在华南沿海亚热带及 热带区域，喜好低盐高温的半咸水环境，年产量在130万吨左右。②保存方式不同：对比 文件2使用的低温是8-10℃，而本发明使用的是0-1℃。8-10℃为结冰前低温中的中低温环 境，相比较而言比较安全，但是无法达到长期保存的目的；而0-1℃为冰点前临界超低温度， 本领域技术人员认为，在0-1℃环境下，可能会将幼虫冻死，但是本发明人发现0-1℃冰点 前临界超低温度可以使眼点幼虫处于休克状态，从而可以长期保存。③保存时间不同：对 比文件2为短期保存，仅仅保存了24h；而本发明为长期保存，保存时间为2-3个月。④幼 虫状态不同：对比文件2中的长牡蛎幼虫处于低温代谢状态，仅仅是降低了代谢速率；而 本发明使其眼点幼虫处于冷休克式的冬眠状态，几乎不再进行代谢，但仍维持幼虫处于活 体状态。⑤保存效果不同：对比文件2保存的眼点幼虫，24h后其存活率不足90%，而本 发明长期保存3个月以内的存活率均在90%以上。⑥保存用途不同：对比文件2为主要适 用于短时间内长途运输，而本发明主要目的是为了研究香港牡蛎低温生物学及其对冰点前 临界低温的耐受力，从而提高香港牡蛎幼虫变态率，进行大规模生产香港牡蛎健康苗种。

本发明结合牡蛎幼虫耐低温的生物学特性，采用冷休克方式，通过幼虫采集、幼虫冷 藏、幼虫管理、幼虫解冻等技术手段，创造了一种利用冰点前临界低温长期保存香港牡蛎 眼点幼虫的方法。本发明不同于以往利用抗冻剂等开展的低温冷藏技术，首次采用0-1℃低 温条件下进行幼虫冷藏，可大量保存眼点幼虫（≥1000亿个）。本发明保存的眼点幼虫，几 乎尚未出现冻伤现象，可有效的提高采苗效率，90%以上可以完成变态（≤90d）。本发明为 研究香港牡蛎幼虫低温生物学、干法幼虫运输、规模化苗种同步生产等提供了理论与实践 基础。本发明具有操作简便、实用性强等优点。

具体实施方式

以下实施例是对本发明的进一步说明，但不构成对本发明的限制。

实施例1

a、幼虫采集：2010年5月30日，在大连庄河海洋贝类育苗场内，利用80筛绢网（网 孔最大孔径250μm）浓缩60m³水泥池中的香港牡蛎眼点幼虫，共获得6000万个眼点幼虫， 其壳高在320-360μm。

b、幼虫冷藏：将步骤a中眼点幼虫用海水润湿后的500目筛绢网（网孔最大孔径20μm） 装好扎成包，每包≤1kg，之后外面利用海水湿润过的海绵包裹一层，放入2L容积的保温 箱中封好，之后放置于0-1℃冰箱中冷藏。

c、幼虫管理：对步骤b中包装好的眼点幼虫每隔7天利用小型喷雾器喷洒海水于其外 层的海绵上，使其一直处于湿润状态。

d、幼虫解冻：冷藏60d后，先将其从冰箱中拿出来，打开后利用常温海水润湿眼点幼 虫，之后放入20L红盘中，利用水舀子搅匀，大约15-20min后，完全恢复常温后，将眼点 幼虫投入60m³水泥池中，发现幼虫近乎100%存活，正常摄食、游动。15d后，获得了5500 万牡蛎稚贝，变态率在90%以上。

实施例2

a、幼虫采集：2011年6月10日，在深圳旭联海洋生物有限公司育苗场内，利用80筛 绢网（网孔最大孔径250μm）浓缩30m³水泥池中的香港牡蛎眼点幼虫，共获得1500万个 眼点幼虫，其壳高在320-360μm。

b、幼虫冷藏：将步骤a中眼点幼虫用海水润湿后的500目筛绢网（网孔最大孔径20μm） 装好扎成包，每包≤1kg，之后外面利用海水湿润过的海绵包裹一层，放入2L容积的保温 箱中封好，之后放置于0-1℃冰箱中冷藏。

c、幼虫管理：对步骤b中包装好的眼点幼虫每隔7天利用小型喷雾器喷洒海水于其外 层的海绵上，使其一直处于湿润状态。

d、幼虫解冻：冷藏36d后，先将其从冰箱中拿出来，打开后利用常温海水润湿眼点幼 虫，之后放入20L红盘中，利用水舀子搅匀，大约15-20min后，完全恢复常温后，将其投 入30m³水泥池中，发现幼虫近乎100%存活，正常摄食、游动。15d后，获得了1400万牡 蛎稚贝，变态率在90%以上。

实施例3

a、幼虫采集：2012年6月15日，在中国科学院南海海洋研究所湛江海洋经济动物实 验育苗场内，利用80筛绢网（网孔最大孔径250μm）浓缩20m³水泥池中的香港牡蛎眼点 幼虫，共获得1000万个眼点幼虫，其壳高在320-360μm。

b、幼虫冷藏：将步骤a中眼点幼虫用海水润湿后的500目筛绢网（网孔最大孔径20μm） 装好扎成包，每包≤1kg，之后外面利用海水湿润过的海绵包裹一层，放入2L容积的保温 箱中封好，之后放置于0-1℃冰箱中冷藏。

c、幼虫管理：对步骤b中包装好的眼点幼虫每隔7天利用小型喷雾器喷洒海水于其外 层的海绵上，使其一直处于湿润状态。

d、幼虫解冻：冷藏90d后，先将其从冰箱中拿出来，打开后利用常温海水润湿眼点幼 虫，之后放入10L红桶中，利用水舀子搅匀，大约15-20min后，完全恢复常温后，将其投 入20m³水泥池中，发现幼虫近乎100%存活，正常摄食、游动。15d后，获得了910万牡蛎 稚贝，变态率在90%以上。