一种基于滤膜的法医学硅藻检验方法

摘要

本发明涉及藻类检验领域，具体公开了一种基于滤膜的法医学硅藻检验方法。本发明将经过真空抽滤后的滤膜进行透明化处理后，可以将透明化后的滤膜直接放在光学显微镜下观察。本发明所述的检测方法操作简便、检验效率高、而且不需要依赖复杂的仪器，在基层法医学实验室就能进行检测，更具有广泛应用性。

说明书

技术领域

本发明涉及藻类检验领域，具体涉及一种基于滤膜的法医学硅藻检验方法。

背景技术

硅藻是一种单细胞藻类，全世界约有16000多种，体长一般在1μm至200μm之间，其最明显的特征是细胞壁除个别种类外，均高度硅质化，形成上、下两个透明的壳，以壳环带套合形成一个硅质细胞壁。硅藻的生活环境非常广泛，自然界中的水域，几乎都能见到硅藻的踪迹。

水中尸体是法医学尸体检验中常见的类型。20世纪40年代以来，许多法医学者在溺死者尸体上证实，硅藻可由循环系统进入多个脏器。硅藻细胞壁因抵抗力强而不易被破坏，硅质含量高者，使用浓硫酸、浓硝酸煮沸甚至高温烧灼也不被破坏。因此，硅藻检验是解决水中尸体的死因问题的一种可靠手段。

法医学实践中，1～30g组织器官消解后通常会留下10～50ml的消解液，离心是富集水样或组织器官消解液中硅藻的常用方法。如GA/T 813—2008标准（《人体组织器官中硅藻硝酸破机法检验》）中，将消化后的消解液倒入离心管经反复离心后制片；最后采用光镜观察法，以10倍或40倍物镜检查硅藻。根据胡孙林等研究报道表明，离心一次导致大约10%的硅藻损失，增加离心速度不能显著提高硅藻的回收率，因此导致脏器组织中硅藻回收率低。

由于真空抽滤的方法也可富集硅藻，但是滤膜本身是不透明的，无法直接置于光学显微镜下观察，因此胡孙林等尝试使用真空抽滤-自动化扫描电镜的方法观察硅藻。虽然电子显微镜的分辨率高、观察清晰，但是，鉴于其操作复杂、成本较高、维护费用高的特点，使得电子显微镜只能在一些大中型实验室和科研机构使用，无法广泛应用于基层法医学实验室。

发明内容

本发明要解决的技术问题是为了克服现有技术的上述缺陷，提供一种检验灵敏度高、检验效率高、又不会显著增加设备成本的基于滤膜的法医学硅藻检验方法。

本发明的目的通过以下技术方案予以实现。

   一种基于滤膜的法医学硅藻检验方法，包括如下步骤：

    S1.滤膜富集：采用真空抽滤装置将检验样品进行真空抽滤；样品抽滤完成后加超纯水继续抽滤，使滤膜表面接近中性；

    S2.膜透明化：将滤膜干燥后置于载玻片上，滴加乙酸-丁香酚试剂于滤膜上，盖上盖玻片；

S3.定性定量分析：将透明后的滤膜置于光学显微镜下观察；采用人工识别方式或计算机自动化识别方式对滤膜上的硅藻或所拍摄的图片进行检查、分类和统计处理。

现有技术中，采用滤膜富集法将待测样品进行抽滤后，由于滤膜本身是不透明的，无法直接置于光学显微镜下观察，所以必须借助复杂的观察设备如自动化扫描电镜，对滤膜上的硅藻进行检测，本发明通过合适的透明化处理方式，可以使滤膜透明，可直接放在光学显微镜下观察硅藻。

本发明所述方法适于所有类型的检测样品，如水样、气管内溺液或组织器官的消解液。

滤膜透明化处理时要先将滤膜进行核实的干燥处理，作为优选实施方案，所述滤膜干燥的方法为：将抽滤完成后的滤膜置于50～80℃的电炉上或烘箱中加热1～10min使其完全干燥。在滤膜透明化处理过程中使用的乙酸-丁香酚试剂的作用为将滤膜进行透明化处理。发明人在前期研究工作中也试着采用乙酸或丁香酚试剂对滤膜进行透明化处理，但是效果都不如用乙酸-丁香酚试剂对滤膜进行透明化处理的效果好。作为优选的实施方案，所述乙酸-丁香酚试剂是将浓度80～100%的乙酸溶液和浓度60～100%的丁香酚溶液按1:9～9:1的比例均匀混合所得到的混合溶液。

在滤膜富集过程中，可以采用单联或多联真空抽滤装置进行真空抽滤，单联真空抽滤装置，每次只对一个样品进行抽滤；多联真空抽滤装置，每次可同时对多个样品进行抽滤处理。优选地，真空抽滤时，抽滤真空度为：100～800mmHg，所述滤膜为聚醚砜材质的滤膜，滤膜直径为10～50mm、孔径为0.1～1.0μm。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1、回收率高。本发明的滤膜富集步骤，避免了传统离心富集法中多次离心处理过程所导致硅藻的损失。所采用的透明化试剂可以将滤膜完全透明化，光线可大量透过滤膜以保证光镜观察。光学显微镜观察结果表明，透明化后的滤膜并不影响其定量。因此，与传统的离心富集法相比，使用滤膜富集法从水样和组织消解液中富集硅藻，操作更为简便，回收率更高。

2、效率高、性价比高、易于推广。滤膜富集步骤操作简便、花费时间短，每种检材只需富集一次，制片一张，避免了传统离心富集法的多次反复离心，多次涂片、制片，既费时费力，又使回收率降低。膜透明化步骤简单，时间短，透明后的样品可直接置于光学显微镜下观察，既能保证检验结果的准确性，又无需额外购置设备；操作人员仅需简单培训即可操作。其非常适用于经费少、规模小但又广泛分布的基层实验室。

3、定性定量分析准确、劳动强度低。使用滤膜富集法制片提高了硅藻回收率，膜透明化后使用光学显微镜观察，硅藻纹理和细节清晰，并且不影响其定量，保证了定性定量分析的准确性。制片量减少，无需过多的培训和操作，并能结合计算机自动化识别方式对所拍摄的图片进行检查、分类和统计处理，这些都能显著降低分析人员的劳动强度。

4、适用性广泛。本发明不仅适用于硅藻检验，更能延伸至其他检验领域。如滤膜富集时的样品可选用植物消解仪、土壤消解液、气体等；透明化时可加入适当的染色剂、固定剂、标志物等以观察特定样品；检验指标可选择多种藻类、小型昆虫、寄生虫等。因此，本发明的适用性广泛、可跨学科使用。

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步详细说明本发明。除非特别说明，本发明采用的试剂、设备为本技术领域常规试剂和设备。

实施例1

一种基于滤膜的法医学硅藻检验方法：分为三步：

S1.滤膜富集：

将50～100ml的样品（稀释后的组织器官消解液）置于单联或多联真空抽滤装置的抽滤杯内开始抽滤；真空度100～800mmHg，聚醚砜（PES）滤膜直径10～50mm，孔径为0.1～1.0μm。样品抽滤完成时加入50～200ml的超纯水继续抽滤，使滤膜表面接近中性。

S2.膜透明化：

抽滤完成后的滤膜置于50～80℃的电炉上或烘箱中加热1～10min使其完全干燥；取未用的载玻片，中心滴加1～5滴乙酸-丁香酚试剂；乙酸-丁香酚试剂为浓度80～100%乙酸溶液和浓度60～100%的丁香酚溶液按照1:9的比例均匀混合所得到的混合溶液。将干燥后的滤膜置于玻片中心，滤膜上再次滴加1～3滴乙酸-丁香酚试剂，加盖盖玻片。

S3.定性定量分析：

将透明后的玻片置于光学显微镜下，以20倍或40倍物镜观察；采用人工识别方式或计算机自动化识别方式对滤膜上的硅藻或所拍摄的图片进行检查、分类和统计处理。在人工识别方式下，如某些视场中的微型硅藻，由于放大倍数所限，不能满足鉴定的要求，则使用60倍物镜甚至100倍油镜来观察其细微结构。

实施例2

一种基于滤膜的法医学硅藻检验方法：分为三步：

S1.滤膜富集：

将50～100ml的样品（稀释后的组织器官消解液）置于单联或多联真空抽滤装置的抽滤杯内开始抽滤；真空度100～800mmHg，聚醚砜（PES）滤膜直径10～50mm，孔径为0.1～1.0μm。样品抽滤完成时加入50～200ml的超纯水继续抽滤，使滤膜表面接近中性。

S2.膜透明化：

抽滤完成后的滤膜置于50～80℃的电炉上或烘箱中加热1～10min使其完全干燥；取未用的载玻片，中心滴加1～5滴乙酸-丁香酚试剂；乙酸-丁香酚试剂为浓度80～100%乙酸溶液和浓度60～100%的丁香酚溶液按照1：1的比例均匀混合所得到的混合溶液。将干燥后的滤膜置于玻片中心，滤膜上再次滴加1～3滴乙酸-丁香酚试剂，加盖盖玻片。

S3.定性定量分析：

将透明后的玻片置于光学显微镜下，以20倍或40倍物镜观察；采用人工识别方式或计算机自动化识别方式对滤膜上的硅藻或所拍摄的图片进行检查、分类和统计处理。在人工识别方式下，如某些视场中的微型硅藻，由于放大倍数所限，不能满足鉴定的要求，则使用60倍物镜甚至100倍油镜来观察其细微结构。

实施例3

一种基于滤膜的法医学硅藻检验方法：分为三步：

S1.滤膜富集：

将50～100ml的样品（稀释后的组织器官消解液）置于单联或多联真空抽滤装置的抽滤杯内开始抽滤；真空度100～800mmHg，聚醚砜（PES）滤膜直径10～50mm，孔径为0.1～1.0μm。样品抽滤完成时加入50～200ml的超纯水继续抽滤，使滤膜表面接近中性。

S2.膜透明化：

抽滤完成后的滤膜置于50～80℃的电炉上或烘箱中加热1～10min使其完全干燥；取未用的载玻片，中心滴加1～5滴乙酸-丁香酚试剂；乙酸-丁香酚试剂为浓度80～100%乙酸溶液和浓度60～100%的丁香酚溶液按照9:1的比例均匀混合所得到的混合溶液。将干燥后的滤膜置于玻片中心，滤膜上再次滴加1～3滴乙酸-丁香酚试剂，加盖盖玻片。

S3.定性定量分析：

将透明后的玻片置于光学显微镜下，以20倍或40倍物镜观察；采用人工识别方式或计算机自动化识别方式对滤膜上的硅藻或所拍摄的图片进行检查、分类和统计处理。在人工识别方式下，如某些视场中的微型硅藻，由于放大倍数所限，不能满足鉴定的要求，则使用60倍物镜甚至100倍油镜来观察其细微结构。

对比例1

一种基于滤膜的法医学硅藻检验方法：分为三步：

S1.滤膜富集：

将50～100ml的样品（稀释后的组织器官消解液）置于单联或多联真空抽滤装置的抽滤杯内开始抽滤；真空度100～800mmHg，聚醚砜（PES）滤膜直径10～50mm，孔径为0.1～1.0μm。样品抽滤完成时加入50～200ml的超纯水继续抽滤，使滤膜表面接近中性。

S2.膜透明化：

抽滤完成后的滤膜置于50～80℃的电炉上或烘箱中加热1～10min使其完全干燥；取未用的载玻片，中心滴加1～5滴乙酸试剂；乙酸试剂为浓度80～100%乙酸溶液。将干燥后的滤膜置于玻片中心，滤膜上再次滴加1～3滴乙酸试剂，加盖盖玻片。

S3.定性定量分析：

将透明后的玻片置于光学显微镜下，以20倍或40倍物镜观察；采用人工识别方式或计算机自动化识别方式对滤膜上的硅藻或所拍摄的图片进行检查、分类和统计处理。在人工识别方式下，如某些视场中的微型硅藻，由于放大倍数所限，不能满足鉴定的要求，则使用60倍物镜甚至100倍油镜来观察其细微结构。

由于采用80～100%乙酸溶液对滤膜进行透明化处理的效果很差，一是用80～100%乙酸溶液对滤膜进行透明化处理的时间很长，另外用80～100%乙酸溶液处理后的滤膜容易变黄，不利于长期保存，所以，不适合采用普通的光学显微镜进行观察。

对比例2

一种基于滤膜的法医学硅藻检验方法：分为三步：

S1.滤膜富集：

将50～100ml的样品（稀释后的组织器官消解液）置于单联或多联真空抽滤装置的抽滤杯内开始抽滤；真空度100～800mmHg，聚醚砜（PES）滤膜直径10～50mm，孔径为0.1～1.0μm。样品抽滤完成时加入50～200ml的超纯水继续抽滤，使滤膜表面接近中性。

S2.膜透明化：

抽滤完成后的滤膜置于50～80℃的电炉上或烘箱中加热1～10min使其完全干燥；取未用的载玻片，中心滴加1～5滴丁香酚试剂；丁香酚试剂为浓度60～100%的丁香酚溶液。将干燥后的滤膜置于玻片中心，滤膜上再次滴加1～3滴丁香酚试剂，加盖盖玻片。

S3.定性定量分析：

将透明后的玻片置于光学显微镜下，以20倍或40倍物镜观察；采用人工识别方式或计算机自动化识别方式对滤膜上的硅藻或所拍摄的图片进行检查、分类和统计处理。在人工识别方式下，如某些视场中的微型硅藻，由于放大倍数所限，不能满足鉴定的要求，则使用60倍物镜甚至100倍油镜来观察其细微结构。

由于采用60～100%的丁香酚溶液对滤膜进行透明化处理的效果很差，一是用60～100%的丁香酚溶液对滤膜进行透明化处理的时间很长，另外用60～100%的丁香酚溶液处理后的滤膜容易变黄，不利于长期保存，所以，不适合采用普通的光学显微镜进行观察。

应用例

使用实施例1所述方法对死亡者进行检测分析：

案例1：

2013年9月21日，在某小学侧门口旁的池塘边发现一具女尸，年龄约20岁，身上无任何证件物品。尸表检查后难以确定死因和案件性质。

硅藻检验时采用硝酸乙醇法消解，离心富集法结合光学显微镜观察，结果从肺中检出与池塘中相同类型的硅藻，含量为1086个/10g肺组织，肝脏和肾脏组织中未检出硅藻。然后将同一份组织样本消解后使用一种滤膜富集、透明化、光镜观察技术检验硅藻，从死者肺、肝、肾中均检出与池塘水样中相同类型的硅藻，含量分别为1275个/10g肺组织、61个/10g肝组织、8个/10g肾组织，因此鉴定该女性死因为溺死。结合其它调查结果，最后证实死者为意外落水死亡。

案例2：

2013年3月6日，在某中学篮球场旁的河堤上发现一具无名女尸，尸体高度腐败，为证实死者是在生前被抛入水中溺死还是死后被抛尸入水，尸体解剖后取肺、肝和肾组织，采用硝酸乙醇法消解，离心富集法结合光学显微镜观察，结果从肺中检出与河水中相同类型的硅藻，含量为1762个/10g肺组织，肝脏和肾脏组织中未检出硅藻。然后将同一份组织样本消解后使用一种滤膜富集、透明化、光镜观察技术检验硅藻，从死者肺、肝中均检出与河水中相同类型的硅藻，含量分别为1265个/10g肺组织、11个/10g肝组织，肾组织未检出硅藻，根据该检验结果，结合尸体解剖所见，鉴定该女性死因为溺死。案件侦破后证实：死者于2013年3月1日晚行至某中学门口，躲在暗处的李某发现其一人行走且随身挎一背包。李某突然蹿出抢其包，在与死者缠斗的过程中将死者“掐死”（实际仅为短暂窒息昏迷），然后将死者拖入附近的河中，带着死者的包逃逸。