一种尖孢镰刀菌及其在降解连作障碍自毒物质中的应用

摘要

本发明公开了一种尖孢镰刀菌及其在降解连作障碍自毒物质中的应用。所述尖孢镰刀菌的保藏编号为CCTCC No.M2013432。本发明的尖孢镰刀菌能利用自毒物质作为唯一碳源和能源生长，属矿化作用，对去除栽培水体或土壤中的自毒物质、克服连作障碍具有积极的意义。在以自毒物质为唯一碳源和能源生长72h时，对肉桂酸的降解率最高达99.53%，对苯甲酸的降解率最高达97.9%，对香兰素的降解率最高达92.5%，对对羟基苯甲酸的降解率最高达95.6%，而且在降解自毒物质的同时不会对作物产生任何副作用；使用方法简单、方便，成本低廉，具有广阔的应用前景。

说明书

技术领域

本发明属于微生物种质资源的开发与利用领域，尤其涉及一种尖孢镰刀菌及其在降解连作障碍自毒物质中的应用。 

背景技术

自毒物质是指植物通过地上部淋溶、根系分泌和植株残茬腐解等途径释放并对同茬或下茬同种或同科植物生长产生抑制作用的化学物质。黄瓜土壤中积累的自毒物质主要由肉桂酸、苯甲酸和水杨酸在内的十余种酚酸类化合物构成。这些物质一方面通过影响离子吸收、水分吸收、光合作用、蛋白质和DNA合成等多种途径来影响植物生长，而更为重要的是自毒物质在根际土壤中的累积为根际病原菌提供了丰富的营养，加速其繁殖，从而导致连作障碍的发生。 

目前发现，较易发生连作障碍的黄瓜、西瓜、甜瓜、番茄和茄子等作物均具有分泌自毒物质的能力。近年来，由于设施农业的产业化、专业化、规模化等经营模式的出现，也使得我国各地相继涌现出具有特色的专业产地及从事某一特定蔬菜生产的农民。长期连作导致土壤自毒物质的大量累积，许多连作土壤需要5年以上的轮作才能缓解连作障碍。对于专业生产的经营者而言，自毒物质的累积成为导致连作障碍、制约产业发展、限制增收的重要因素。 

最直接的去除自毒物质的方法包括活性炭吸附和施加土壤消毒物质（例如石灰氮）等理化方法。但活性炭吸附只适用于水培、基质培等无土栽培，通过肥水循环系统中活性炭的过滤达到对自毒物质净化，无法应用于土壤中。而土壤消毒又因成本过高，会对环境造成污染以及过量施用会对作物生长发育不利等原因而在实际应用中受到局限。寻求低成本、高效率、无副作用的去除自毒物质的方法是科研工作者的当务之急。 

众所周知，土壤具有自我修复能力，这是因为土壤中生存的微生物能够分泌过氧化物酶、漆酶、水解酶等物质，而这些物质均能对环境中的化 学物质进行分解。因此筛选、分离能够高效降解连作障碍自毒物质的微生物是去除自毒物质的优选途径。 

公布号为CN103045506A的中国专利文献公开了一种连作障碍自毒物质降解菌及其制备的复合微生物肥料，该连作障碍自毒物质降解菌为枯草芽孢杆菌，保藏编号为CGMCC No.6896。该菌株对苯甲酸有一定的降解能力，但未记载该菌株对苯甲酸的降解效率，且该菌株对苯甲酸以外的自毒物质是否有降解作用也未可知，无法有效消除自毒物质引起的连作障碍。 

发明内容

本发明公开了一种尖孢镰刀菌，该菌株能对栽培基质中存在的自毒物质进行有效降解，消除连作障碍。 

一种尖孢镰刀菌，分类命名为尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum），株号为YY186-1，已于2013年9月17日保藏于位于武汉市珞珈山武汉大学的中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏编号为CCTCC No.M2013432。 

该尖孢镰刀菌的18SrRNA序列如SEQ ID No.1所示，其主要生物学特征为：菌落突起絮状，粉白色、质密；孢子粉质、镰刀形，少许弯曲，多数为3隔；最适生长条件为pH值7.0，温度28℃，并能以肉桂酸、苯甲酸、香兰素或对羟基苯甲酸作为唯一碳源和能源生长。 

基于该菌株的生长特性，本发明还提供了一种所述尖孢镰刀菌的生长培养基，包括碳源和无机盐，所述碳源为肉桂酸、苯甲酸、香兰素或对羟基苯甲酸中的至少一种。 

作为优选，所述碳源为肉桂酸，浓度为75～150mg/L。在肉桂酸、苯甲酸、香兰素或对羟基苯甲酸中，该尖孢镰刀菌对肉桂酸的利用率最高。 

作为进一步优选，所述生长培养基的配方为：肉桂酸150mg/L，NaCl0.5g，MgSO₄.7H₂O0.2g，NH₄NO₃1.0g，KHPO₄1.0g，K₂HPO₄1.0g，GaCl₂·2H₂O0.02g，FeCl₃·6H₂O0.05g，蒸馏水补足至1000mL，搅拌均匀，调节pH值至7.0，121℃下高压蒸汽灭菌20min。 

本发明的尖孢镰刀菌分离自连作土壤，是经含肉桂酸的选择培养基筛 选获得的。肉桂酸是连作土壤中较具代表性的自毒物质，因此本发明还提供了所述尖孢镰刀菌在降解连作障碍自毒物质中的应用，所述应用包括：将尖孢镰刀菌菌悬液投加到栽种作物的培养液或土壤中。 

由于本发明的尖孢镰刀菌能利用自毒物质作为唯一碳源和能源生长，属矿化作用，对去除栽培水体或土壤中的自毒物质、克服连作障碍具有积极的意义。 

所述连作障碍连作障碍自毒物质为苯甲酸、香兰素、对羟基苯甲酸或肉桂酸。 

经测试，当将尖孢镰刀菌菌悬液投加到以各自毒物质为唯一碳源和能源的生长培养基中（添加菌液后培养基OD₄₁₅约为0.2）时，尖孢镰刀菌对肉桂酸的降解率最高达99.53%，对苯甲酸的降解率最高达97.9%，对香兰素的降解率最高达92.5%，对对羟基苯甲酸的降解率最高达95.6%。 

本发明还提供了一种包含有所述尖孢镰刀菌的菌剂，该菌剂的OD₄₁₅为2.0～3.0。该菌悬液可以是将所述尖孢镰刀菌与常规的附加剂混合后制成的水剂，所述附加剂可选用0.2～0.3mol/L的磷酸缓冲液（pH7.0）。 

在需要对自毒物质进行降解处理时，将所述菌剂直接投加（或经适当倍数稀释后投加）到栽种作物的培养液或土壤中即可，作为优选，将所述菌剂稀释十倍后，以5～15mL/10L的比例投加到培养液中，或以0.5-2L/m²的比例投加到土壤中。 

作为优选，菌剂的添加时机为：对于长期使用、更换频率较低的培养液，优选在作物生长期的中间时段添加菌剂；对于流动培养液则无需添加菌剂；对于土培，如果前茬作物是连作障碍比较严重的作物，优选在下茬作物定植前1-15天将菌剂投加到土壤中即可，在下茬作物的生长期中则无需添加菌剂。 

本发明的尖孢镰刀菌可用于栽种有黄瓜、西瓜、甜瓜、番茄、茄子等多种作物的水体或土壤中，只要这些作物能够分泌苯甲酸、香兰素、对羟基苯甲酸或肉桂酸中的至少一种自毒物质。 

与现有技术相比，本发明的有益效果体现在： 

本发明的尖孢镰刀菌可快速、高效、安全地降解水体和土壤中作物分泌的自毒物质，在以自毒物质为唯一碳源和能源生长72h时，对肉桂酸的 降解率最高达99.53%，对苯甲酸的降解率最高达97.9%，对香兰素的降解率最高达92.5%，对对羟基苯甲酸的降解率最高达95.6%，而且在降解自毒物质的同时不会对作物产生任何副作用；使用方法简单、方便，成本低廉，具有广阔的应用前景。 

附图说明

图1为本发明尖孢镰刀菌的平板菌落生长图； 

图2为本发明尖孢镰刀菌的分生孢子显微形态观察图； 

图3为本发明尖孢镰刀菌在纯培养条件下对苯甲酸的降解曲线； 

图4为本发明尖孢镰刀菌在纯培养条件下对香兰素的降解曲线； 

图5为本发明尖孢镰刀菌在纯培养条件下对对羟基苯甲酸的降解曲线； 

图6为施加本发明尖孢镰刀菌对黄瓜植株干重的影响。 

具体实施方式

1培养基和溶液配制 

（1）无机盐培养液：NaCl0.5g，MgSO₄·7H₂O0.2g，NH₄NO₃1.0g，KHPO₄1.0g，K₂HPO₄1.0g，GaCl₂·2H₂O0.02g，FeCl₃·6H₂O0.05g，蒸馏水补足1000mL，搅拌均匀，调节pH值至7.0，121℃下高压蒸汽灭菌20min。 

（2）牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏10g、蛋白胨5.0g、氯化钠5.0g、蒸馏水补足至1000mL，混合后搅拌均匀，调节pH值至7.0，121℃下高压蒸汽灭菌20min。 

（3）孟加拉红培养基：KH₂PO₄1.0g、MgSO₄·7H₂O0.5g、蛋白胨5g、葡萄糖5g、琼脂16g、孟加拉红0.053g，蒸馏水1000mL，调节pH值至7.0，121℃下高压蒸汽灭菌20min；使用前加30μg/mL的氯霉素。 

（4）PDA培养基：将马铃薯洗净去皮，再称取200g马铃薯切成小块，加水煮烂（煮沸20～30分钟，能被玻璃棒戳破即可），用八层纱布过滤，加热，加琼脂15g/L，继续加热搅拌混匀，待琼脂溶解完后，加入葡萄糖 20g，搅拌均匀，稍冷却后再补足水分至1000毫升，121℃下高压蒸汽灭菌20分钟后取出，冷却后贮存备用。 

（5）0.2mol/L磷酸缓冲液（pH7.0）：磷酸氢二钠（2mol/L）61mL，磷酸二氢钠（2mol/L）39mL，加蒸馏水定容至1000mL，121℃下高压蒸汽灭菌20min。 

2菌株分离纯化 

（1）连作土壤样品采自浙江大学华家池校区农场，取1g连作土壤置于100mL三角瓶中，加入20mL无机盐培养液，黑暗振荡培养（28℃、180r/min）1周； 

（2）取上层浊液1mL接种于含75mg/L肉桂酸的无机盐培养液中，黑暗振荡培养（28℃、180r/min）1周； 

（3）重复步骤（2）4次，其中第1～3次培养时无机盐培养液中肉桂酸浓度为75mg/L，第4次培养时无机盐培养液中肉桂酸浓度为100mg/L，每次培养的接种物均取自上次培养所得的培养液； 

（4）蘸取少量第4次培养获得的培养液，分别在含100mg/L肉桂酸的牛肉膏蛋白胨和孟加拉红培养基平板上进行划线分离，于生化培养箱（28℃）中培养； 

（5）待平板上出现单菌落后，挑取特征不同的单菌落分别转接至含有100mg/L肉桂酸的无机盐培养液中进行摇床培养（28℃、180r/min）1周； 

（6）再分别从步骤（5）的每份培养液中蘸取少量培养液转接到新的100mg/L肉桂酸无机盐培养液中进行摇床培养（28℃、180r/min）1周； 

（7）重复步骤（6）5次，选取仍能在含有100mg/L肉桂酸的无机盐培养液中快速生长的菌株，接种于孟加拉红斜面培养基上，保存。 

3菌株鉴定 

（1）形态鉴定 

将孟加拉红斜面培养基上的菌株挑取单斑在PDA培养基上划线，于28℃下培养3天，菌落突起絮状，粉白色、质密（图1）；挑取菌丝制作水 玻片进行显微观察，观察结果如图2所示，孢子粉质、镰刀形，少许弯曲，多数为3隔。 

（2）分子鉴定 

采用普通PCR方法提取该菌株核糖体DNA上的的ITS序列，并委托南京金斯瑞生物科技有限公司进行测序，测序结果如SEQ ID No.1所示。在NCBI上进行序列比对和分析，将该菌株鉴定为尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）。 

4菌剂制备 

（1）将保藏在试管斜面上的菌种接种于20mL含有100mg/L肉桂酸的无机盐培养液中，于28℃下活化培养7天； 

（2）取活化好的菌种100μL接种于200mL含100mg/L肉桂酸的牛肉膏蛋白胨培养基中，28℃、180r/min振荡培养至对数生长期； 

（3）将对数生长期的菌种离心（8000×g）10min，倒掉上清，菌体用30mL0.2mol/L的磷酸缓冲液（pH7.0）洗涤3次； 

（4）将步骤（3）得到的菌体悬浮于0.2mol/L的磷酸缓冲液（pH7.0）中，制成OD₄₁₅为2.0～3.0的菌悬液，即为菌剂。 

5无机盐培养基中肉桂酸的检测 

将20mL含肉桂酸的无机盐培养液转入烧杯中，用1mol/L氢氧化钠调节pH至8.0，然后加入适量的无水乙醚，置于分液漏斗中剧烈振荡，待静置分层后收集下层液体（水相）。 

用1mol/L HCl调节水相的pH至2.0，再加入适量的无水乙醚，振荡摇匀，收集上层（有机相）；加入适量CaCl₂或CaSO₄除水，并置于40℃水浴使乙醚挥发；待浓缩至1-2mL后转移至离心管中高速离心（10000×g，10min），去乙醚后再加甲醇溶解，用高效液相色谱进行肉桂酸含量分析；分析参数为： 

高效液相色谱仪：SHIMADZU LC-10AD； 

检测器：紫外检测器； 

液相色谱柱：ODS120柱（4.6×250nm）； 

流动相：2％的醋酸溶液:甲醇（色谱纯）＝1:1； 

总流速：1mL/min； 

进样量：5μL； 

柱温：40℃； 

测定时间:20min； 

测定波长：280nm。 

肉桂酸残留量的计算公式如下： 

X=（A_x×V_o）/（A_o×V_x）×C_s； 

其中：X为待测样品中肉桂酸的浓度（mg/L）；A_x为样品中肉桂酸的峰面积；A_o为肉桂酸标准样品峰面积；V_x为样品体积（mL）；V_o为最后定容体积（mL）；C_s为肉桂酸标准样品的浓度（mg/L）。 

肉桂酸降解率的计算公式如下： 

P（%）=（1-C_x/C_o）×100% 

其中：P为待测样品中肉桂酸的降解率（%）；C_x为样品中肉桂酸残留浓度（mg/L）；C_o为样品中肉桂酸初始浓度（mg/L）。 

6肉桂酸回收率试验 

分别制备含0.1、1、10和100mg/L肉桂酸的无机盐培养液，然后根据第5部分的方法对无机培养液中的肉桂酸进行回收，并利用高效液相色谱仪对肉桂酸含量进行检测，每个浓度重复3次，同时做空白试验。无机盐培养液中肉桂酸的平均回收率和变异系数见表1。 

表1无机盐培养液中肉桂酸的平均回收率和变异系数 

添加浓度（mg/L） 样品量（mL） 平均回收率（%） 变异系数（%） 0.1 20 98.0 3.2 1 20 99.3 2.5 10 20 96.8 1.1 100 20 97.2 4.7

由表1可知，肉桂酸在无机盐培养液中的平均回收率是96.8%～99.3%，变异系数是1.1%～4.7%。表明上述无机盐培养液中肉桂酸的检测方法符合自毒物质分析的要求。 

7纯培养尖孢镰刀菌对各自毒物质的降解 

（1）对肉桂酸的降解 

在装有20mL无机盐培养液的100mL三角瓶中添加肉桂酸至终浓度分别为75mg/L、150mg/L；将第4部分制备的菌剂接种到含肉桂酸的无机盐培养液中至培养液OD₄₁₅为0.2，此为实验组；同时设置对照组，对照组中不接种菌剂，实验组和对照组各设三个重复；然后将三角瓶置于摇床（28℃、180r/min）中黑暗振荡培养。 

黑暗振荡培养24h、48h、72h时定时取样，根据第5部分的方法检测培养液中肉桂酸的残留量，计算尖孢镰刀菌对肉桂酸的降解率，计算结果见表2。 

表2尖孢镰刀菌对肉桂酸的降解率（％） 

由表2可知，培养72小时后尖孢镰刀菌将75mg/L和150mg/L肉桂酸几乎彻底降解，其降解率分别为98.99%和99.53%，而未接种尖孢镰刀菌的对照组中，72小时后肉桂酸的降解率为14.77%～34.04%，表明尖孢镰刀菌对肉桂酸具有很强的降解能力。 

（2）对苯甲酸、香兰素以及对羟基苯甲酸的降解 

在装有20mL无机盐培养液的100mL三角瓶中分别添加苯甲酸、香兰素以及对羟基苯甲酸至终浓度为75mg/L（图3中注释为0.5mmol/L，不一致，请统一），将第4部分制备的菌剂接种到含肉桂酸的无机盐培养液中至培养液OD₄₁₅为0.2，此为实验组；同时设置对照组，对照组中不接种菌剂，实验组和对照组各设三个重复；然后将三角瓶置于摇床（28℃、180r/min）中黑暗振荡培养。 

黑暗振荡培养24h、48h、72h时定时取样，根据第5部分的方法分别检测培养液中苯甲酸、香兰素以及对羟基苯甲酸的残留量，计算尖孢镰刀菌对苯甲酸、香兰素以及对羟基苯甲酸的降解率，计算结果见图3、图4、图5。 

由图3、图4、图5可见，尖孢镰刀菌对苯甲酸、香兰素以及对羟基苯甲酸均具有较强的降解能力。其中对苯甲酸的的降解率最高，达97.9%（72h）；对香兰素的降解率次之，为92.5%（72h）；对对羟基苯甲酸的降解率相对较低，但也达到95.6%（72h）。 

对照组中，这三种自毒物质的自然降解率相对于肉桂酸要高，其中香兰素的自然降解率达63.6％（72h），苯甲酸的自然降解率为14.3%（72h），对羟基苯甲酸的被降解率为52.7%（72h）。 

其中，香兰素和对羟基苯甲酸的化学结构上含有酚羟基，容易被氧化，在光下以及湿度较大的情况下会自然降解。 

8尖孢镰刀菌缓解肉桂酸引起的生长抑制作用 

将黄瓜“研津4号”种子播种于土壤中，二周后移入装有10L培养土的瓦盆中并浇灌50mL尖孢镰刀菌菌剂的十倍稀释液（OD₄₁₅为0.2）；2天后浇灌500mL浓度为0.25mM的肉桂酸溶液，10天后采集黄瓜植株的根、茎和叶分别在烘箱中杀青后烘干并称重，称重结果见图6。 

由图6可见，与健康的黄瓜植株（根干重0.23g，茎干重0.63g，叶片干重2.14g）相比，施加肉桂酸的黄瓜植株，其根干重（0.11g）、茎干重（0.36g）以及叶片干重（1.04g）均有显著下降，表明肉桂酸对黄瓜植株的生长具有抑制作用。而与施加肉桂酸的黄瓜植株相比，同时施加肉桂酸和尖孢镰刀菌的黄瓜植株，其根干重（0.23g）、茎干重（0.51g）以及叶片干重（1.69g）均有所上升，表明尖孢镰刀菌能够明显缓解自毒物质肉桂酸对黄瓜生长的不良影响。