一种用于检测I型和IV型马疱疹病毒的双重Eva Green实时荧光定量PCR检测试剂盒及其应用

摘要

本发明公开了一种用于检测I型和IV型马疱疹病毒的双重Eva Green实时荧光定量PCR检测试剂盒及其应用。本发明的试剂盒以Eva Green作为荧光染料，同时还含有用于检测I型和IV型马疱疹病毒的双重反应液。利用获得的阳性克隆质粒和提取的病毒基因组DNA作为模板，对使用本发明的试剂盒的双重Eva Green荧光定量PCR的敏感性，特异性等进行了评价。结果表明使用本发明的试剂盒对I型马疱疹病毒（EHV-1）和IV型马疱疹病毒（EHV-4）进行双重Eva Green荧光定量PCR检测，具有快速、可靠、敏感性高等特点，并且可在单一反应中同时检测EHV-1和EHV-4，对隐性感染马具有较高的阳性检出率，可实现对马鼻肺炎的早期诊断与防治。

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于检测I型和IV型马疱疹病毒的PCR检测试剂盒及其应用，尤 其涉及一种用于检测I型和IV型马疱疹病毒的双重Eva Green实时荧光定量PCR检 测试剂盒及其应用，属于病毒的诊断及检测领域。

背景技术

马鼻肺炎（Equine rhinopneumonitis，ER）是由马鼻肺炎病毒（ERV）引起的马 属动物的一种以发热和出现呼吸道卡他为特征的高度接触性传染病。国际兽疫局 (OIE)把马鼻肺炎列为B类疾病，被《国际动物卫生法典》（1999）列入法定报告 疾病名录。我国农业部把它列为三类动物疫病，国家质量监督检验检疫局与其他国 家签订的检疫条款中也将其列为出入境马属动物检验检疫的疫病之一。马鼻肺炎于 20世纪30年代初发现与美国，后在亚洲和欧洲一些国家均有报道，目前本病在世界 各地广泛发生，马鼻肺炎已发现于40多个国家或地区，给世界养马业带来很大危害。

根据致病性的不同将马鼻肺炎病毒分为马疱疹病毒I型（Equine herpesvirus-1， EHV-1）和IV型（Equine herpesvirus-4，EHV-4）。EHV-1又称马流产病毒(Equine  abortion virus),主要引起母马流产，EHV-4又称呼吸道感染病毒(Respiratory infection  virus)，引起幼驹鼻肺炎，很少发生流产。从致病性上看，区分EHV-1、EHV-4型是 十分必要的。

病毒中和试验为国际贸易替代诊断方法，补体结合试验为常用的血清抗体调查 和回顾性诊断方法，由于二者之间存在严重的血清交叉反应，目前我国还没有从血 清学角度区分EHV-1、EHV-4型马疱疹病毒的标准方法。聚合酶联反应(PCR)以其敏 感、特异、快速、操作简便、高通量等特点成为了备受关注的检测技术。国内外的 研究学者建立了各种普通PCR、SYBR Green荧光定量PCR、TaqMan荧光定量PCR方 法检测EHV-1和EHV-4，但都无法达到即快速检测，同时又能够保证结果准确可靠 的目的。

本发明使用了一种最新型的荧光染料Eva Green，该荧光染料具有对PCR的抑制 性远小于SYBR Green I、扩增信号更强、可消除“染料重分布”的缺陷、可用于高分 辨率溶解曲线分析、稳定性极强等特性，可以大大提高扩增反应的稳定性、可靠性 和敏感性。EvaGreen的试剂成本也低于SYBR Green I，具有广泛普遍应用的价值。 本文所建立的EHV-1/4双重Eva Green real-timePCR具有良好的特异性，敏感性也高 于以往国内外发表文章中的最低检出限，利用溶解曲线峰的Tm值鉴定EHV-1/4混合 感染重复性良好。

发明内容

本发明所要解决的技术问题之一是建立一种用于检测I型马疱疹病毒（EHV-1） 和IV型马疱疹病毒（EHV-4）的双重Eva Green实时荧光定量PCR（Eva Green  real-time PCR）检测方法。

本发明所要解决的技术问题之二是提供一种用于检测I型和IV型马疱疹病毒的 双重Eva Green实时荧光定量PCR（Eva Green real-time PCR）检测引物组及含有该 引物组的试剂盒。

为了达到上述目的，本发明采用了以及技术手段：

本发明发明人根据GenBank上发表的所有EHV-1和EHV-4毒株的序列，应用序列 分析软件设计血清型特异性引物，在此基础上根据多年研究经验的积累，并结合实 际的实验验证，对设计得到的引物序列进行进一步的优化，最终得到了分别用于I 型和IV型马疱疹病毒检测的引物组，同时通过对Eva Green荧光定量PCR的扩增条件 和引物浓度进行优化，获得较好的特异性和扩增效率。

本发明的一种用于同时检测I型和IV型马疱疹病毒的引物组，其特征在于含有用 于检测马疱疹病毒I型的引物对以及用于检测马疱疹病毒IV型的引物对，其中，用于 检测马疱疹病毒I型的引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.1及SEQ ID NO.2所示，用 于检测马疱疹病毒IV型的引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.3及SEQ ID NO.4所示。

利用获得的阳性克隆质粒和提取的病毒基因组DNA作为模板，对本发明所建立 的单重或双重Eva Green荧光定量PCR的敏感性进行了评价。通过分析检测结果的溶 解峰，评价了双重Eva Green荧光定量PCR方法的重复性。并应用所建立的单重和双 重定量分析方法检测了11份无特征性临床表现的马的鼻拭子和2份无临床表现的驴 的鼻拭子样本。结果表明：单重和双重荧光定量分析方法对EHV-1或/和EHV-4的检 测均具有较好的特异性，敏感性均为50个拷贝/ul的EHV-1和5个拷贝/ul的EHV-4阳 性克隆质粒，0.15pg/ul的EHV-1和0.0025pg/ul的EHV-4基因组DNA。EHV-1和EHV-4 两个血清型之间没有交叉反应，NCBI BLAST分析特异性引物均有良好的特异性。 该方法利用溶解曲线鉴定EHV-1/4的重复性良好，组内和组间实验Tm值的标准偏差 均低于0.6%，实验数据稳定、可靠。

应用该方法检测临床鼻拭子样本，单重定量分析EHV-1的阳性检出率为53.8% （7/13），EHV-4的阳性检出率为76.9%(10/13)；双重定量分析EHV-1的阳性检出率为 46.2%（6/13），EHV-4的阳性检出率仍为76.9%（10/13）；单重与双重定量分析的符 合率分别为92.3%（EHV-1，12/13）和100%（EHV-4，13/13）。阳性样本的Eva Green 荧光定量PCR产物经测序分析，均与目的基因一致，进一步验证该方法具有较好的 特异性。

在上述研究的基础上，本发明还提出了一种用于检测I型和IV型马疱疹病毒的双 重Eva Green实时荧光定量PCR检测试剂盒。

本发明的一种用于检测I型和IV型马疱疹病毒的双重Eva Green实时荧光定量 PCR检测试剂盒，含有Eva Green作为荧光染料，其特征在于所述的试剂盒中还含有 用于检测I型和IV型马疱疹病毒的双重反应液，其中所述的双重反应液中含有用于检 测马疱疹病毒I型的引物对以及用于检测马疱疹病毒IV型的引物对，用于检测马疱疹 病毒I型的引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.1及SEQ ID NO.2所示，用于检测马疱 疹病毒IV型的引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.3及SEQ ID NO.4所示。

在本发明中，优选的，所述的双重反应液中各引物的浓度分别为50nM-250nM。

更优选的，所述的双重反应液中各引物的浓度分别为50nM。

在本发明中，优选的，用于检测I型和IV型马疱疹病毒的PCR反应条件为：95℃ 下变性3分钟，然后在95℃下复性25秒，58℃退火延伸30秒，共进行40个循环。

进一步的，本发明还提出了所述的试剂盒及引物组在制备用于同时检测I型和IV 型马疱疹病毒的试剂中的应用。

本发明建立了一种快速、可靠、高敏感性的双重Eva Green荧光定量PCR检测方 法及试剂盒，可在单一反应中同时检测EHV-1和EHV-4，对隐性感染马具有较高的 阳性检出率，可实现对马鼻肺炎的早期诊断与防治。

附图说明

图1为单重Eva Green real-time PCR的特异性检测结果；

图1A为使用单重Eva Green real-time PCR对EHV-1进行扩增的扩增曲线及对应 的溶解曲线；图1B为使用单重Eva Green real-time PCR对EHV-4进行扩增的扩增曲线 及对应的溶解曲线；

图2为双重Eva Green real-time PCR的特异性检测结果；

图3为双重Eva Green real-time PCR混合引物浓度的优化；

图4为EHV-1（A）和EHV-4（B）的标准曲线和对应的溶解曲线；

图5为Eva Green real-time PCR检测阳性克隆质粒的敏感性检测结果；

图5A为单重Eva Green real-time PCR检测EHV-1或EHV-4阳性克隆质粒的敏 感性；图5B为双重Eva Green real-time PCR检测EHV-1或EHV-4阳性克隆质粒的 敏感性；图5C为双重Eva Green real-time PCR检测EHV-1和EHV-4阳性克隆质粒 混合物的敏感性；

图6为Eva Green real-time PCR检测基因组DNA的敏感性检测结果；

图6A为单重Eva Green real-time PCR检测EHV-1或EHV-4基因组DNA的敏 感性；图6B为双重Eva Green real-time PCR检测EHV-1或EHV-4基因组DNA的 敏感性；图6C为双重Eva Green real-time PCR检测EHV-1和EHV-4基因组DNA 混合物的敏感性。

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随 着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限 制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明 技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范 围内。

实施例1双重Eva Green实时荧光定量PCR检测方法的建立及在检测I型和 IV型马疱疹病毒中的应用

1、材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病毒参考株  马疱疹病毒I型(EHV-1)病毒株(ATCC438/77)、马疱疹 病毒IV型(EHV-4)病毒株(ATCC405/76)。RK13细胞为中国农业科学院哈尔滨兽医研 究所兽医生物技术国家重点实验室马病研究室保存。

1.1.2 临床样本  2013年采集11匹无特征性临床表现的马的鼻拭子和2匹无临 床表现的驴的鼻拭子。

1.1.3 主要试剂和仪器  Viral DNA Kit（Omega公司）；2X SsoFastTM EvaGreen  supermix（Bio-Rad公司）；荧光定量PCR八连管（Axygen公司）。Sratagene Mx3005P 荧光定量PCR仪（Sratagene公司）。

1.1.4 引物设计与合成  从GenBank上下载所有发表的EHV-1和EHV-4核苷酸 序列。利用SeqMan、MagAlign对序列进行比对和分析；利用Primer Premier5.0(Primer  Biosoft international，palo Alto,CA,USA)软件设计EHV-1或EHV-4型特异性引物用 于Eva Green荧光定量PCR的检测。

其中用于检测马疱疹病毒I型的引物序列如SEQ ID NO.1（EHV-1.F，上游）及 SEQ ID NO.2所示（EHV-1.R，下游），用于检测马疱疹病毒IV型的引物序列如SEQ ID  NO.3（EHV-4.F，上游）及SEQ ID NO.4所示（EHV-4.R，下游）。

1.2 方法

1.2.1 病毒的繁殖和DNA的提取  在长成单层的RK13细胞融合度达到90%以 上时，接种50ul的EHV-1（ATCC438/77）、EHV-4（ATCC405/76）病毒液，置于 37℃CO₂培养箱中培养，待细胞病变（CPE）达到85%以上时收毒，分装后冻存于-80℃ 冰箱中。

取250ul收取的病毒上清液，按Viral DNA Kit说明书提取病毒DNA，DNA洗脱 于50ul的Elution buffer中。应用NanoDrop2000紫外分光光度计（Thermo Fisher公司） 测定病毒DNA的浓度。分装后冻存于-80℃冰箱中用于后续的实验。

1.2.2 单重Eva Green real-time PCR  单重Eva Green real-time PCR反应体系为： 10ul2X SsoFastTM EvaGreen supermix、250nM EHV-1或EHV-4上、下游引物的混合 物和2ul的模板DNA，然后加RNase-free水补足至20ul。扩增反应在STRATEGEN M3005p Real time PCR仪上进行。经优化、筛选的反应条件为：95℃3min，然后 95℃25sec、58℃退火30sec共进行40个循环。溶解曲线分析采用95℃15sec、60℃ 20sec和95℃15sec。每个模板至少做2个重复，并设阴性对照（NTC）。用MxPro 软件分析扩增结果，采用软件自动分析程序获得阈值（threshold）和阈值循环数（Ct）， 分析EHV-1和EHV-4的溶解曲线是否可产生特异性的溶解峰。

1.2.3 双重Eva Green real-time PCR反应  双重Eva Green real-time PCR反应体 系含有EHV-1和EHV-4特异性引物的混合物，模板为EHV-1和EHV-4基因组DNA的 混合物，其他成分和浓度均与单重反应的一致。为了提高双重荧光定量PCR检测的 特异性，首先优化反应体系，以同时获得两个特异性的熔解峰。选择不同浓度范围 的EHV-1和EHV-4上游、下游引物的等摩尔混合物，各引物浓度为250nM、200nM、 150nM、100nM或50nM，表1所示，分别对同一模板DNA进行定量分析，每个稀释 度做3个重复，并设阴性对照。用MxPro软件分析溶解曲线。反应条件为：95℃3min， 然后95℃25sec、58℃退火30sec共进行40个循环。溶解曲线分析采用95℃15sec、 60℃20sec和95℃15sec。

表1 引物浓度优化

1.2.4 标准曲线的制备  以EHV-1和EHV-4基因组DNA为模板，利用荧光定量 PCR特异性引物EHV-1.F和EHV-1.R、EHV-4.F和EHV-4.R扩增出目的条带，将该特 异性片段克隆到pMD-18T载体上，经测序分析获得阳性克隆质粒，作为标准品。 Nanodrop检测质粒浓度，利用公式：DNA(copy)=[6.02×10²³(copy/mol)×DNA]/ [DNA length(dp)×660(g/mol/dp)]计算质粒拷贝数，将质粒由10⁹至10³依次倍比稀释， 至少选取5个稀释度，每个稀释度做3个重复，并设阴性对照（NTC）。用MxPro软 件分析扩增结果。通过软件分析自动获得标准曲线的斜率（Slope）、Rsq（拷贝数 与循环阈值的相关值）与扩增效率（E）。

1.2.5 Eva Green real-time PCR反应的特异性  利用EHV-1或ENV-4的特异性引 物交叉扩增EHV-4或ENV-1的基因组DNA，观察是否有溶解峰出现，以检测相应引 物的特异性。将检测为马疱疹病毒感染阳性样品的Eva Green real-time PCR产物进行 纯化，送测序公司进行序列分析，进一步验证该方法的特异性。

1.2.6 Eva Green real-time PCR反应的敏感性  首先检测单重Eva Green  real-time PCR反应的敏感性，对阳性质粒进行10倍倍比稀释，或进一步做5倍倍比稀 释，在STRATEGEN M3005p Real time PCR仪上进行扩增，分析EHV-1或EHV-4特 异性溶解峰的出现。在获得单重反应最低检测浓度的基础上，将EHV-1和EHV-4阳 性质粒混合至各自的最低检出限拷贝数，以模拟混合感染样品，检测双重Eva Green  real-time PCR反应的敏感性。此外，用同样的方法分析单重和双重Eva Green real-time  PCR反应对EHV-1和EHV-4基因组DNA检测的敏感性。

1.2.7 双重Eva Green real-time PCR反应的重复性  分别进行组内和组间的实 验，选取10⁷、10⁵、10³拷贝/反应（copies/rx）高、中、低三个浓度。在组内实验中， 每个浓度重复3个孔，分析重复实验结果中溶解峰所对应Tm值的标准差和变异系数； 在组间实验中，分别进行3次实验，每次实验中每个浓度重复3个孔，分析每次实验 平均Tm值之间的标准差和变异系数。

1.2.8 临床样本及其检测  采集11匹马的鼻拭子和2匹驴的鼻拭子，采集鼻拭子 时，每个鼻孔用2支医用棉签深入鼻腔内部采集鼻分泌物，每匹马或驴共收集4支棉 签放入预先准备好的含有5ml运输培养液（PBS，含有100个单位/ml青霉素和 100ug/ml链霉素）的50ml无菌离心管中，并置于冰上。为防止交叉污染，每采集1 匹马后更换手套。采集的鼻拭子应在24h内提取病毒DNA或者放置于-80℃冰箱中保 存。

同时采用TaqMan(MGB)法（EHV-1检测的参考文献是Diallo IS,Hewitson G, Wright L,Rodwell BJ,Corney BG.2006.Detection of equine herpesvirus type1using a  real-time polymerase chain reaction.J Virol Methods131:92-98.EHV-4检测的参考文 献是Diallo IS,Hewitson G,Wright LL,Kelly MA,Rodwell BJ,Corney BG.2007. Multiplex real-time PCR for the detection and differentiation of equid herpesvirus1 (EHV-1)and equid herpesvirus4(EHV-4).Vet Microbiol123:93-103.）以及SYBR  Green PCR法（所用引物，体系、扩增条件等与本发明相同，区别在于加入SYBR Green 作为荧光染料）进行平行对比实验。

将采集的鼻拭子样本16,000×g离心5min，弃去医用棉签和上清液，将沉淀物溶 解于300ul灭菌的PBS中，取250ul悬液提取病毒DNA，最终将样本的DNA洗脱于50ul 的洗脱液中，应用上述建立的单重和双重Eva Green real-time PCR进行检测。并设有 阳性和阴性对照孔3个重复。

1.2.9 检测结果的验证  对于单重反应为阳性的荧光定量PCR产物全部进行琼 脂糖凝胶电泳（2%），将获得的特异性片段进行测序，以验证real time PCR鉴定的 准确性，该部分并不包含在未来检测样品的步骤中。当EvaGreen法和TaqMan(MGB) 检测结果均为阳性时，将EvaGreen法的扩增产物进行测序；当EvaGreen法检测为阴 性，而TaqMan(MGB)检测为阳性时，将TaqMan(MGB)法的扩增产物进行测序。

2 结果

2.1 单重Eva Green real-time PCR的特异性结果  利用EHV-1Eva Green  real-time PCR分别检测EHV-1或EHV-4的基因组DNA，结果显示（如图1所示）仅对 EHV-1有特异性的扩增，并在Tm值为88.11℃处出现特异性的溶解峰，对EHV-4没有 扩增；利用EHV-4Eva Green real-time PCR分别检测EHV-1或EHV-4的基因组DNA， 结果显示（如图1所示）仅对EHV-4有特异性的扩增，并在Tm值为84.81℃处出现特 异性的溶解峰，对EHV-1没有扩增。

2.2 双重Eva Green real-time PCR的特异性结果  利用双重Eva Green  real-time PCR分别检测EHV-1或EHV-4的基因组DNA，结果显示（如图2所示）均可 以在各自血清型对应的Tm值附近检测到特异性的溶解峰，没有交叉反应或非特异性 溶解峰的出现。

2.3 双重Eva Green real-time PCR反应体系的优化结果  在双重荧光定量 PCR反应体系中，分别加入不同浓度的EHV-1和EHV-4上/下游引物的等摩尔混合物， 分别进行Eva Green real-time PCR定量分析，结果显示（如图3所示）：5个浓度均在 88.0℃和84.1℃出现了特异性的溶解峰，而当混合的各引物的浓度为50nM时，溶解 曲线的特异性最好。

2.4 单重Eva Green real-time PCR的扩增效率  利用EHV-1和EHV-4阳性克隆 质粒T-1和T-4制备Eva Green real-time PCR的标准曲线，经荧光定量分析（如图4所 示），EHV-1和EHV-4获得的斜率分别为-3.313和-3.072，RSq值分别为0.992和0.999， 均大于0.99，说明对应的标准曲线可信，得出的扩增效率分别为100.4%和111.6%。

2.5 Eva Green real-time PCR检测的敏感性结果  该方法的敏感性检测包括 阳性克隆质粒最低拷贝数和病毒基因组DNA最低检出浓度2种，每种模板质粒或基 因组的检测又分为3情况，即单重反应单一模板、双重反应单一模板和双重反应双 重模板。检测阳性克隆质粒的敏感性，如图5A所示，单重Eva Green real-time PCR 对EHV-1或EHV-4的敏感性分别为100copies/rx和10copies/rx，即50copies/ul和 5copies/ul；分别对应特异性的溶解峰，Tm值分别为88.6℃和84.7℃。如图5B所示， 双重Eva Green real-time PCR对EHV-1或EHV-4的敏感性分别为100copies/rx和 10copies/rx，即50copies/ul和5copies/ul；分别对应特异性的溶解峰，Tm值分别为 88.1℃和84.3℃。如图5C所示，双重Eva Green real-time PCR对EHV-1和EHV-4混合 物的敏感性分别为100copies/rx和10copies/rx，即50copies/ul和5copies/ul。由此说明， 双重Eva Green real-time PCR反应体系不影响EHV-1和EHV-4阳性克隆质粒各自扩 增的敏感性。

检测病毒基因组DNA的敏感性，如图6A所示，单重Eva Green real-time PCR对 EHV-1或EHV-4的敏感性分别为0.3pg/rx和0.005pg/rx，即0.15pg/ul和/0.0025pg/ul； 分别对应特异性的溶解峰。如图6B所示，双重Eva Green real-time PCR对EHV-1或 EHV-4的敏感性分别为0.3pg/rx和0.005pg/rx，即0.15pg/ul和/0.0025pg/ul；如图6C所 示，双重Eva Green real-time PCR对EHV-1和EHV-4基因组DNA混合物的敏感性分别 为0.3pg/rx和0.005pg/rx，即0.15pg/ul和/0.0025pg/ul。

由此说明，双重Eva Green real-time PCR反应体系不影响模拟EHV-1和EHV-4混 合感染基因组样本各自扩增的敏感性。

2.6 双重Eva Green real-time PCR检测的重复性  双重Eva Green real-time  PCR在一个反应中同时检测EHV-1和EHV-4两个血清型的病毒，以溶解曲线出现特 异性的溶解峰作为阳性结果的检测标准，因此该方法的重复性实验是分析组内和组 间检测样本溶解峰所对应的的Tm值。由表2所示，双重Eva Green real-time PCR检测 的重复性良好，标准偏差（CV）均小于0.6%。

表2 双重Eva Green real-time PCR检测的组内和组间重复性

2.7 临床鼻拭子样本的检测  初步应用本发明建立的双重（duplex）Eva  Green real-time PCR方法检测临床马和驴鼻拭子样本，并与单重反应（singleplex） 结果相对照，鉴定结果如表3所示。为了比较3种检测方法的敏感性，我们对11匹马 （13hs1-11）和2匹驴（13dk1以及13dk3）的鼻拭子分别提取病毒DNA，进行荧光定 量PCR分析。在EvaGreen单重PCR检测中，分别检测到7个EHV-1阳性样本和10个 EHV-4阳性样本，而在EvaGreen双重PCR检测中，分别检测到6个EHV-1阳性样本和 10个EHV-4阳性样本；单重SYBR Green PCR检测中能检测到2个EHV-1阳性样本和4 个EHV-4阳性样本，而在双重SYBR Green PCR检测中只能检测到2个EHV-1阳性样 本0个EHV-4阳性样本；在单重和双重TaqMan(MGB)检测中都可以检测到10个 EHV-1阳性样本和10个EHV-4阳性样本；上述结果表明，有9匹马同时感染EHV-1和 EHV-4病毒。

表3 应用3种检测方法对临床鼻拭子样本的检测结果

从上表中可以看出，SYBR Green的敏感性是最差的，TaqMan（MGB）的检测 敏感性最高，但是本发明的双重Eva Green real-time PCR方法的检出率与TaqMan (MGB)的差不多：单重反应EvaGreen EHV-1的检出率为53.8%（7/13），EHV-4的检 出率为76.9%（10/13）；双重反应EvaGreen对EHV-1和EHV-4的检出率分别为46.1% （6/10）和76.9%（10/13）。而无论是单重还是双重TaqMan(MGB)对EHV-1和EHV-4 的检出率均为76.9%（10/13）。这说明EvaGreen法的检测敏感性可以与TaqMan(MGB) 法相媲美，而且该方法无需合成费用昂贵的探针，也避免了由于特异性探针检测序 列发生突变而引起漏检的现象，因此EvaGreen法检测EHV-1和EHV-4具有敏感性高、 成本低的优势和特点。

2.8 检测结果的验证  经测序分析，将获得的序列与已知EHV-1和EHV-4的 特异性序列分别进行比对，结果显示序列的同源率为100%（data not shown），说明 real time PCR的检测结果正确。

实施例2用于检测I型和IV型马疱疹病毒的双重Eva Green实时荧光定量PCR 检测试剂盒的制备

1、引物设计与合成

从GenBank上下载所有发表的EHV-1和EHV-4核苷酸序列。利用SeqMan、 MagAlign对序列进行比对和分析；利用Primer Premier5.0(Primer Biosoft  international，palo Alto,CA,USA)软件设计EHV-1或EHV-4型特异性引物用于Eva  Green荧光定量PCR的检测。

其中用于检测马疱疹病毒I型的引物序列如SEQ ID NO.1（上游）及SEQ ID NO.2 所示（下游），用于检测马疱疹病毒IV型的引物序列如SEQ ID NO.3（上游）及SEQ  ID NO.4所示（下游）。

2、用于检测I型和IV型马疱疹病毒的双重反应液的制备：

用于检测I型和IV型马疱疹病毒的双重反应液中含有用于检测马疱疹病毒I型及 IV型的引物对，各条引物的浓度为50nM，用TE缓冲液溶解。

3、试剂盒的组装

将制备得到的双重反应液、2X SsoFastTM EvaGreen supermix以及RNase-free水 组装成试剂盒。

对比例1 三种荧光定量PCR法敏感性的比较

为了对比TaqMan(MGB)法（EHV-1检测的参考文献是Diallo IS,Hewitson G, Wright L,Rodwell BJ,Corney BG.2006.Detection of equine herpesvirus type1using a  real-time polymerase chain reaction.J Virol Methods131:92-98.EHV-4检测的参考文 献是Diallo IS,Hewitson G,Wright LL,Kelly MA,Rodwell BJ,Corney BG.2007. Multiplex real-time PCR for the detection and differentiation of equid herpesvirus1 (EHV-1)and equid herpesvirus4(EHV-4).Vet Microbiol123:93-103.）以及SYBR  Green PCR法（所用引物（50nM），体系、扩增条件等与本发明方法相同，区别在 于加入SYBR Green作为荧光染料）与本发明方法的敏感性，本发明分别以阳性克隆 质粒以及病毒基因组DNA为模板，按照实施例1的方法分别对这三种方法的检测最 低拷贝数进行测定，结果如表4所示。

表4 三种荧光定量PCR法敏感性的比较

^*带有有非特异性的扩增；

a.S代表单重反应体系；

b.D代表双重反应体系；

c.N/A代表未应用试验。