一种利用无机氮源的微藻光合兼养高密度发酵培养方法及应用

摘要

本发明公开了一种利用无机氮源的微藻光合兼养高密度发酵培养方法及应用。本发明涉及一种利用无机氮源的微藻高密度发酵培养方法，以无机氮盐为无机氮源、葡萄糖为有机碳源的培养基，进行光合兼养培养，根据培养基氮源和碳源消耗及生物量增长情况，分段补加葡萄糖、无机氮盐和其它营养盐，合理调控营养盐浓度、pH值、通气量、光强和藻液搅动速度，使微藻短期内快速增值，缩短培养时间，保证微藻的高密度生长，实现微藻细胞生物量快速增长的同时对无机氮的高效吸收同化。本发明适用于以无机氮盐为氮源的微藻高密度光合兼养发酵生产，为微藻在环境生态应用和生物能源生产的经济可行性研究奠定了基础。

说明书

技术领域

本发明属于微藻生物技术、环境生态技术和生物能源领域，涉及一种利用无机氮源的微 藻光合兼养高密度发酵培养方法及应用，可用于利用无机氮源的微藻高密度发酵培养、微藻 对工业烟气NOx的减排和微藻生物能源原料协同生产等方面。

背景技术

微藻是原核的或者真核的单细胞光合微生物，是非常高效的太阳能转换器，分布于淡水 或者咸水中，通过吸收水环境传递的光能，水和CO₂积累生物量，可以将光能转化为化学 能，以油脂或淀粉的等有机物的形式储存在细胞内。作为最古老的低等光合生物，某些微藻 可直接利用太阳光、CO₂及N、P等简单营养物质快速生长并在胞内合成大量油脂(主要是 甘油三酯)，从而可以为生物柴油生产提供新的油脂资源，而目前制约微藻生物能源广泛应 用的主要原因在于其培养成本。

大量的水资源，无机营养物（主要是氮和磷）和CO₂对于微藻培养是昂贵的，是制约 微藻大规模培养的重大问题。一个可能克服微藻培养高成本的方法是利用烟道气作为碳源和 氮源。燃烧化石燃料所产生的“CO₂温室效应”问题以及加工化石燃料所产生的废气（主要为 氮氧化物（NOx）和少量硫氧化物（SOx））问题对气候和人类的生存环境已造成严重的影 响。NOx是诱导雾霾的主要气态污染物，主要来源于工业烟气排放。微藻生物量中C元素 近占干重的50%，N元素含量也高达7-12%。因此，微藻的规模化培养需要大量的CO₂和 NO₃^-作为碳源和氮源，据计算，每生成1g的微藻生物量，需要1.83g的CO₂和0.45g的 NO₃^-。而工业烟道气中含有高浓度的CO₂和NOx，因此利用工业烟道气进行能源微藻培养， 不仅可以大量固定烟道气CO₂和NOx，减少温室气体排放，降低环境污染，而且可以解决 微藻培养所需的碳源和氮源供应问题，在生成生物量——微藻生物能源和其他高价值附加物 的同时，达到CO₂和NOx生物转化的目的。从而在获得显著环境效益的同时，大幅度降低 了微藻生物能源的生产成本。

微藻对无机氮吸收和同化过程中，NO₃^-先被还原为NO₂^-，由硝酸盐还原酶催化，在细 胞质中进行；NO₂^-再被还原为NH₃，由亚硝酸盐还原酶催化，在叶绿体中进行；最后NH₃被谷氨酰胺合成酶和谷氨酸盐合成酶同化形成有机氮。在这一过程中，硝酸还原酶和亚硝酸 还原酶是两种关键酶。其中亚硝酸还原酶的合成及活力依赖于NO₂^-的供应，照光的叶绿体 产生的还原铁氧还蛋白（Fd）是NO₂^-还原的电子供体，因此微藻无机氮的同化过程需要光 能的供给。

由于光照自养培养中光透射度减弱的问题，当藻细胞密度增加到一定数量后，必然阻挡 光线进入培养物内，使培养出的细胞密度通常很低。目前，自养培养条件下还没有高效增加 细胞密度的方法。微藻自养培养模式下过低的生物量和较慢的细胞生长速度成为限制微藻在 烟道气减排和生物能源生产应用中的“瓶颈”。而常规的无光照条件下利用有机碳源的微藻异 养培养模式又显著影响微藻无机氮的同化过程，影响对工业烟道气特别是NOx的减排效果。

为了解决上述技术问题，本发明提出了一种利用无机氮源的微藻光合兼养高密度发酵培 养方法及应用，以无机氮盐为无机氮源、葡萄糖为有机碳源进行微藻的光合兼氧的高密度发 酵培养，同时在微藻培养过程中，根据培养基氮源和碳源消耗及生物量增长情况，分段补加 葡萄糖、硝酸盐和其它营养盐，合理调控C/N比例、营养盐浓度、pH值、通气量、光强和 藻液搅动速度，使微藻短期内快速增值，缩短培养时间，保证微藻的高密度生长，实现微藻 细胞生物量快速增长的同时对无机氮的高效吸收同化，进行微藻在工业烟气NOx生物脱硝 和生物能源原料制备的联合生产应用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用无机氮源的微藻光合兼养高密度发酵培养方法，方法 简单，易行。本发明以无机氮盐为氮源、葡萄糖为有机碳源进行微藻的光合兼氧的高密度发 酵培养，同时在微藻培养过程中，根据培养基氮源和碳源消耗及生物量增长情况，分段补加 葡萄糖、硝酸盐和其它营养盐，合理调控C/N比例、营养盐浓度、pH值、通气量、光强和 藻液搅动速度，使微藻短期内快速增值，缩短培养时间，保证微藻的高密度生长

本发明还有一个目的在于提供了一种利用无机氮源的微藻光合兼养高密度发酵培养方 法的应用，本发明提供的方法可应用于利用无机氮源的微藻高密度发酵培养、微藻对工业烟 道气特别是NOx的高效减排和经济可行的微藻生物能源原料协同生产等方面。

为了达到上述目的，本发明采用了以下技术步骤：

一种利用无机氮源的微藻光合兼养高密度发酵培养方法，其步骤如下

1.配制微藻培养基，包括基础培养基和补料液两部分：

基础培养基为1L BG11培养基中添加10-60g葡萄糖，无机氮盐终浓度为1.5-9.0g/L；

补料液1为1L去离子水中含葡萄糖600-800g；

补料液2为1L去离子水中含无机氮盐50-150g；

补料液3为1L去离子水中含K₂HPO₄·3H₂O40g，柠檬酸铁铵6g，Na₂CO₃20g；

补料液4为1L去离子水中含MgSO₄·7H₂O75g，CaCl₂·2H₂O36g，柠檬酸6g， EDTA·2Na1g；

补料液5为A₅溶液。

所述的无机氮盐优选NaNO₃或NaNO₂，或其混合物。

2.光照生物反应器中添加基础培养基，培养体积为反应器体积的50%-80%，将微藻细胞 接种于光照生物反应器中，接种密度为1.0×10⁷-2.0×10⁷cells/mL，加入0.1%-0.5%（v/v） 有机硅消泡剂和0.01-0.05g/L氯霉素阻止泡沫产生和杂菌污染，平均光强为200-400μmol m^-2s^-1，培养温度为20-30℃，pH6.0-8.5，通入气体为压缩空气（0.08MPa），每L培养基 通气量为0.5-2.0L/min，初始转速200rpm，当培养规模≤10L，微藻生物量≥15.0×10⁷cells/mL或培养规模＞10L，微藻生物量≥20.0×10⁷cells/mL时，生物量每增长1倍搅拌 速度提高50-100rpm，最高维持在400-500rpm。

3.在微藻光合兼养高密度发酵培养过程中，每24小时根据葡萄糖与无机氮盐消耗情况 进行补料液1和补料液2的补料，使培养液中葡萄糖浓度为10-30g/L，C/N维持在5-10； 每24小时根据微藻生物量增长情况进行营养盐补料，生物量的增长量为3.0×10⁷-4.5×10⁷cells/mL时，补充补料液33mL/L，补料液44mL/L，补料液51mL/L各一次，每24小时 只补料一次，生物量增长进入稳定期后停止发酵，收集藻液，提取藻油。

所述的营养盐补料为补料液3、补料液4和补料液5。

本发明中所述微藻为球藻，优选可以利用无机氮源光合生长并合成积累油脂的球藻。

一种利用无机氮源的微藻光合兼养高密度发酵培养方法在工业烟气NOx生物脱硝和生 物能源原料制备的联合生产中的应用，其应用过程如下：

1.配制微藻培养基，包括基础培养基和补料液两部分：

基础培养基为1L BG11培养基中添加10-60g葡萄糖，无机氮盐（优选NaNO₃或NaNO₂， 或其混合物），终浓度为1.5-9.0g/L；

补料液1为1L去离子水中含葡萄糖600-800g；

补料液2为1L去离子水中含无机氮盐50-150g；

补料液3为1L去离子水中含K₂HPO₄·3H₂O40g，柠檬酸铁铵6g，Na₂CO₃20g；

补料液4为1L去离子水中含MgSO₄·7H₂O75g，CaCl₂·2H₂O36g，柠檬酸6g， EDTA·2Na1g；

补料液5为A₅溶液。

2.光照生物反应器中添加基础培养基，培养体积为反应器体积的50%-80%，将微藻细胞 接种于光照生物反应器中，接种密度为1.0×10⁷-2.0×10⁷cells/mL，加入0.1%-0.5%（v/v） 有机硅消泡剂和0.01-0.05g/L氯霉素阻止泡沫产生和杂菌污染，平均光强为200-400μmol m^-2s^-1，培养温度为20-30℃，pH6.0-8.5，通入气体为压缩空气（0.08MPa），每L培养基 通气量为0.5-2.0L/min，初始转速200rpm，当培养规模≤10L，微藻生物量≥15.0×10⁷cells/mL或培养规模＞10L，微藻生物量≥20.0×10⁷cells/mL时，生物量每增长1倍搅拌 速度提高50-100rpm，最高维持在400-500rpm。

3.在微藻光合兼养高密度发酵培养过程中，每24小时根据葡萄糖与无机氮盐消耗情况 进行补料液1和补料液2的补料，使培养液中葡萄糖浓度为10-30g/L，C/N维持在5-10； 每24小时根据微藻生物量增长情况进行营养盐补料，生物量的增长量为为3.0×10⁷-4.5×10⁷cells/mL时，补充补料液33mL/L，补料液44mL/L，补料液51mL/L各一次，每24小时 只补料一次。

4.生物量增长至60.0×10⁷-80.0×10⁷cells/mL时，停止进行补料液2的补料，替换为补 加工业烟气NOx固定盐溶液，使培养液NaNO₂含量至15-30g/L，每24小时根据消耗情况 进行补料使NaNO₂维持在15-30g/L。随后每24小时根据葡萄糖消耗情况进行补料液1的 补料，使培养液中葡萄糖浓度为10-30g/L；根据微藻生物量增长情况进行营养盐补料，生 物量的增长量为3.0×10⁷-4.5×10⁷cells/mL时，补充补料液33mL/L，补料液44mL/L，补 料液51mL/L各一次，每24小时只补料一次。生物量增长进入稳定期后停止发酵，收集藻 液，提取藻油。

工业烟气NOx固定盐溶液为1L去离子水中含工业烟气NOx固定盐（NaNO₂:NaNO₃质 量比为19:1）300-450g。所述的工业烟气NOx固定盐溶液为本发明实施例中所使用的盐溶 液，其他的工业烟气NOx固定盐溶液也可完成本发明。

本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：

1.本发明是在常规的自养BG11培养基中添加葡萄糖，并通入压缩空气，促使微藻在利 用光能兼养生长的情况下实现细胞的快速增殖，在培养过程中通过分段补料和培养条件的全 自动调控，使整个培养过程稳定可控，保证微藻细胞始终处于快速生长的状态，方法易行， 操作方便。

2.本发明能够在细胞快速增殖的情况下利用光能对培养液中的无机氮源进行高效吸收， 与传统的光合自养培养和无光照异养培养方法相比，本方法能够在促进微藻细胞生物量快速 增长的同时实现利用光能对无机氮的高效吸收同化，具有适于烟道气生物脱硝应用的优点。

3.本发明优先适用于产油微藻利用无机氮源的光合兼养高密度发酵培养，培养过程中可 应用于工业烟道气生物脱硝和生物能源原料—藻油的协同生产，与现有的单独使用微藻进行 烟道气减排或生物能源生产技术相比，本方法易于进行微藻工业烟道气生物脱硝与微藻生物 能源原料制备的协同生产的应用研究，为一种环境平衡、经济可行的工业化生产技术的建立 奠定了基础。

附图说明

图1为实施例2中小球藻生物量积累随时间变化曲线图。

图2为实施例2中小球藻对培养液中NO₃^-的吸收同化随时间变化曲线图。

图3为实施例3中小球藻生物量积累随时间变化曲线图。

图4为实施例3中小球藻对培养液中NO₃^-的吸收同化随时间变化曲线图。

图5为实施例4中小球藻生物量积累随时间变化曲线图。

箭头表示在这个时间开始替换为工业烟气盐溶液。

图6为实施例4中小球藻对培养液中工业烟气NOx固定盐（以NO₂^-计）的吸收同化随 时间变化曲线图。

具体实施方式

该方法适合所有微藻中球藻的光合兼养高密度发酵培养，优选可以利用无机氮源光合 生长并合成积累油脂的球藻，进行微藻在工业烟道气生物脱硝和生物能源原料制备的联合生 产应用。以产油绿藻小球藻为例，说明该方法的具体实施步骤，但不构成对本发明的限制， 本发明所述技术方案，如无特别说明，均为本领域的常规方案，所用原料均为市场流通的商 品。

实施例1：

配制培养基

基础培养基的配制过程如下：

向BG11培养基中添加葡萄糖和NaNO₃配制基础培养基，使培养基中葡萄糖浓度为30 g/L，NaNO₃含量为4.5g/L；

BG11培养基组成为：NaNO₃1.5g/L，K₂HPO₄·3H₂O0.04g/L，MgSO₄·7H₂O0.075g/L， CaCl₂·2H₂O0.036g/L，柠檬酸,0.006g/L，柠檬酸铁铵0.006g/L，EDTA·2Na,0.001g/L，Na₂CO₃0.02g/L，A₅溶液1mL/L；其中微量元素溶液A₅的组成为：H₃BO₃2.86g/L，MnCl₂·4H₂O1.81 g/L，ZnSO₄·7H₂O0.222g/L，Na₂MoO₄·2H₂O0.390g/L，CuSO₄·5H₂O0.079g/L，CoCl₂·6H₂O 0.010g/L。

补料液的配制过程如下：

向去离子水中加入葡萄糖使其浓度为800g/L配制补料液1；

向去离子水中加入NaNO₃使其浓度为150g/L配制补料液2；

向1L去离子水中加入K₂HPO₄·3H₂O40g，柠檬酸铁铵6g，Na₂CO₃20g配制补料液3；

向1L去离子水中加入MgSO₄·7H₂O75g，CaCl₂·2H₂O36g，柠檬酸6g，EDTA·2Na1 g配制补料液4；

补料液5为A₅溶液。

配制的溶液用于以下实施例。

实施例2：

一种利用无机氮源的微藻光合兼养高密度发酵培养方法，以3L培养规模为例，具体如下：

1.使用5L自控光照生物反应器（上海保兴生物设备工程有限公司，BIOTECH-5BGG） 进行小球藻的光合兼养高密度发酵培养，培养体积为3L基础培养基。开启光生物反应器， 设置培养条件为平均光强200μmol m^-2s^-1，温度为28℃，使用压缩空气（0.08MPa）进行 通气，通气量为3.0L/min（即每升培养基的通气量为1L/min），搅拌转速为200rpm，使用 2M KOH溶液和70%乙酸溶液自动调节培养液pH值使pH为7.0。

2.微藻接种与培养。待光生物反应器中培养条件稳定后，将实验室保存，进行液体活化 的纯化小球藻Chlorella vulgaris（来源于中国科学院淡水藻种库，编号FACHB-1068）接种 于光照生物反应器中进行光合兼养高密度发酵培养，接种密度为1.5×10⁷cells/mL，并同时 加入0.1%（v/v）有机硅消泡剂和0.01g/L氯霉素阻止泡沫产生和杂菌污染。

3.培养过程中培养条件的控制。本发明中，以700nm为扫描波长，建立了OD值与生 物量之间的标准曲线，通过对藻液OD值测量，从而计算培养液中生物量的浓度，在实际培 养过程中可以利用分光光度计实时测量培养液的OD值，确定微藻生物量的积累情况。在小 球藻光合兼养高密度发酵培养过程中，每24小时取样，测定小球藻生物量积累情况，当生 物量的增长量为3.0×10⁷-4.5×10⁷cells/mL时，补充补料液33mL/L，补料液44mL/L，补 料液51mL/L各一次，每24小时只补料一次；使用二硝基水杨酸法测定培养液中残留葡萄 糖浓度，使用碱性过硫酸钾消解紫外分光光度法测定培养液中残留NO₃^-含量，根据葡萄糖 与NaNO₃消耗情况使用补料液1和补料液2进行补料，使培养液中维持葡萄糖浓度为30g/L， 维持C/N为6。生物量达到15.0×10⁷cells/mL后生物量每增长1倍搅拌速度提高50rpm， 最终维持在400rpm。

4.小球藻光合兼养高密度发酵培养结果：按照实施步骤1-3的培养方法，培养过程中生 物量的积累情况见图1，培养开始1天内细胞即进入对数生长期，生物量快速积累，通过6 天的培养，小球藻生物量达到最大为1.3×10⁹cells/mL，随后进入稳定期，生物量积累显著 放缓，几乎不再增长。7天后收集藻液，12000g离心收集沉淀，冷冻干燥，最终获得细胞 干重为39.41g/L，索氏抽提法提取藻油，称重法测油脂含量，经检测细胞油脂含量为细胞 干重的32.6%；培养过程中小球藻对NO₃^-的吸收同化情况见图2，结果显示小球藻对NO₃^-的吸收同化与细胞生物量积累趋势相一致，随生物量增长NO₃^-被吸收同化的含量也不断增 长，积累单位生物量（以1.0×10⁷cells为1个单位）吸收同化NO₃^-0.15mg。6天后随生物 量积累显著放缓，NO₃^-被吸收同化的含量也几乎不再增长，7天时培养液中NO₃^-的残留量为 8.51g/L，24小时内仅被吸收同化0.34g/L。可以看出，在自养培养基中添加葡萄糖进行光 合兼养培养，能够促使小球藻生物量快速大量积累，光能的供给促进小球藻对培养液中无机 氮源的高效吸收，同时有高附加值产品—藻油积累。

实施例3：

一种利用无机氮源的微藻光合兼养高密度发酵培养方法，以30L培养规模为例，具体 如下：

1.使用50L自控光照生物反应器（上海保兴生物设备工程有限公司，BIOTECH-50BSG） 进行小球藻的光合兼养高密度发酵培养，培养体积为30L基础培养基。开启光生物反应器， 设置培养条件为平均光强300μmol m^-2s^-1，温度为28℃，使用压缩空气（0.08MPa）进行 通气，通气量为45.0L/min（即每升培养基的通气量为1.5L/min），搅拌转速为200rpm，使 用2M KOH溶液和70%乙酸溶液自动调节培养液pH值使pH为7.0。

2.微藻接种与培养。待光生物反应器中培养条件稳定后，将小球藻Chlorella vulgaris （FACHB-1068）接种于光照生物反应器中进行光合兼养高密度发酵培养，接种密度为1.3× 10⁷cells/mL，并同时加入0.3%（v/v）有机硅消泡剂和0.03g/L氯霉素阻止泡沫产生和杂菌 污染。

3.培养过程中培养条件的控制。在小球藻光合兼养高密度发酵培养过程中，每24小时 取样，测定小球藻生物量积累情况，当生物量的增长量为3.0×10⁷-4.5×10⁷cells/mL时，补 充补料液33mL/L，补料液44mL/L，补料液51mL/L各一次，每24小时只补料一次；根 据葡萄糖与NaNO₃消耗情况使用补料液1和补料液2进行补料，使培养液中维持葡萄糖浓 度为30g/L，维持C/N为7。生物量达到20.0×10⁷cells/mL后生物量每增长1倍搅拌速度 提高100rpm，最终维持在400rpm。

4.小球藻光合兼养高密度发酵培养结果：按照实施步骤1-3的培养方法，培养过程中 生物量的积累情况见图3，培养开始1天内细胞即进入对数生长期，生物量快速积累，8天 时生物量达到1.1×10⁹cells/mL，8天后进入稳定期，生物量积累显著放缓，几乎不再增长。 9天时收集藻液，12000g离心收集沉淀，冷冻干燥，最终获得细胞干重为33.64g/L，索氏 抽提法提取藻油，称重法测油脂含量，经检测细胞油脂含量为细胞干重的29.3%；培养过程 中小球藻对NO₃^-的吸收同化情况见图4，结果显示小球藻对NO₃^-的吸收同化与细胞生物量 积累趋势相一致，随生物量增长NO₃^-被吸收同化的含量也不断增长，积累单位生物量（以 1.0×10⁷cells为1个单位）吸收同化NO₃^-0.16mg。8天后随生物量积累显著放缓，NO₃^-被 吸收同化的含量也几乎不再增长，9天时培养液中NO₃^-的残留量为7.52g/L，24小时内仅 被吸收同化0.07g/L。对比实施例2，本实施例同样可以看出，在自养培养基中添加葡萄糖 进行光合兼养培养，能够促使小球藻生物量快速大量积累，光能的供给促进小球藻对培养液 中无机氮源的的高效吸收，同时有高附加值产品—藻油积累。

实施例4：

一种利用无机氮源的微藻光合兼养高密度发酵培养方法在工业烟气NOx生物脱硝和生 物能源原料制备的联合生产中的应用，以实验室3L培养规模为例，具体如下：

1.使用5L自控光照生物反应器（上海保兴生物设备工程有限公司，BIOTECH-5BGG） 进行小球藻的光合兼养高密度发酵培养，培养体积为3L基础培养基。开启光生物反应器， 设置培养条件为平均光强200μmol m^-2s^-1，温度为28℃，使用压缩空气（0.08MPa）进行 通气，通气量为3.0L/min（即每升培养基的通气量为1L/min），搅拌转速为200rpm，使用 2M KOH溶液和70%乙酸溶液自动调节培养液pH值使pH为7.0。

2.微藻接种与培养。待光生物反应器中培养条件稳定后，将小球藻Chlorella vulgaris （FACHB-1068）接种于光照生物反应器中进行光合兼养高密度发酵培养，接种密度为1.0 ×10⁷cells/mL，并同时加入0.1%（v/v）有机硅消泡剂和0.01g/L氯霉素阻止泡沫产生和杂 菌污染。

3.培养过程中培养条件的控制。在小球藻光合兼养高密度发酵培养过程中，每24小时 取样，测定小球藻生物量积累情况，当生物量的增长量为3.0×10⁷-4.5×10⁷cells/mL时，， 补充补料液33mL/L，补料液44mL/L，补料液51mL/L各一次，每24小时只补料一次； 根据葡萄糖与NaNO₃消耗情况使用补料液1和补料液2进行补料，使培养液中维持葡萄糖 浓度为30g/L，维持C/N为6。生物量达到15.0×10⁷cells/mL后生物量每增长1倍搅拌速 度提高50rpm，最终维持在400rpm。

4.NOx生物脱硝与微藻生物能源原料制备协同生产：生物量增长至61.3×10⁷cells/mL 后，停止进行补料液2的补料，补加工业烟气NOx固定盐溶液，使培养液中NaNO₂含量至 20g/L，每24小时根据消耗情况进行补料使NaNO₂维持在20g/L。随后每24小时根据葡萄 糖消耗情况进行补料液1的补料，使培养液中葡萄糖浓度为30g/L；根据微藻生物量增长情 况进行营养盐补料，当生物量的增长量为3.0×10⁷-4.5×10⁷cells/mL时，补充补料液33 mL/L，补料液44mL/L，补料液51mL/L各一次，每24小时只补料一次。生物量增长达 到稳定期（1.6×10⁹cells/mL）后停止发酵，收集藻液，12000g离心收集沉淀，冷冻干燥， 索氏抽提法提取藻油，称重法测油脂含量。

工业烟气NOx固定盐溶液为1L去离子水中含工业烟气NOx固定盐（中国石油化工股 份有限公司石家庄炼化分公司己内酰胺生产车间提供，NaNO₂:NaNO₃质量比为19:1）400g。

5.应用于NOx生物脱硝与微藻生物能源原料制备协同生产实验室3L规模实验结果： 按照实施步骤1-4的培养方法及应用操作，培养过程中生物量的积累情况见图5，培养开始 1天内细胞即进入对数生长期，生物量快速积累，4天时生物量达到61.3×10⁷cells/mL，开 始补加工业烟气NOx固定盐溶液（图5箭头示意处），并保证此后培养过程中培养液中稳定 的工业烟气NOx固定盐溶液浓度，10天时生物量达到1.6×10⁹cells/mL进入稳定期，生物 量积累显著放缓，几乎不再增长，11天时收集藻液，最终获得细胞干重为58.73g/L，细胞 油脂含量为细胞干重的39.1%；培养过程中小球藻对工业烟气NOx固定盐（以NO₂^-计）的 去除情况见图6，4天时开始补加工业烟气NOx固定盐溶液，结果显示小球藻对工业烟气 NOx固定盐的去除与细胞生物量积累趋势相一致，随生物量增长固定盐（以NO₂^-计）被吸 收同化的含量也不断增长，积累单位生物量（以1.0×10⁷cells为1个单位）吸收同化NO₂^-0.54 mg。10天后随生物量积累显著放缓，NO₂^-被吸收同化的含量也几乎不再增长，11天时培养 液中NO₂^-的残留量为12.59g/L，24小时内仅被吸收同化0.74g/L。对比实施例2和3可以 看出，本实施例在光合兼养高密度发酵过程中添加高浓度工业烟气NOx固定盐替代NaNO₃进行光合兼养培养，对小球藻生物量的快速大量积累不造成显著影响，根据积累单位生物量 （以1.0×10⁷cells为1个单位）吸收同化的无机氮盐的含量可以看出小球藻对培养液中工 业烟气NOx固定盐的吸收同化要显著优于单一的NaNO₃，同时有更高含量藻油积累，表明 本发明中一种利用无机氮源的微藻光合兼养高密度发酵培养方法适合应用于工业烟气NOx 生物脱硝与微藻生物能源原料制备协同生产。