一种柑橘黄龙病亚洲种巢氏PCR扩增检测体系及应用

摘要

本发明涉及一种柑橘黄龙病亚洲种PCR检测，尤其涉及一种柑橘黄龙病亚洲种巢氏PCR检测体系及应用，属于分子生物领域。本发明提供的一种柑橘黄龙病亚洲种巢氏PCR扩增检测体系，包括第一轮PCR扩增体系和第二轮PCR扩增体系，所述第一轮PCR扩增体系和第二轮PCR扩增体系最终体积均为10～20μL，其中均包括DNA模板1.0μL、2×Taq PCR Master Mix5μL、引物0.5μL，余量为灭菌双蒸水；其中第二轮PCR扩增体系的DNA模板由第一轮PCR扩增产物经稀释10～20倍体积后制得。本发明第一轮及第二轮PCR扩增反应体系小，第一轮PCR产物稀释倍数小，检测所需试剂也少，相应的费用少。

说明书

技术领域

本发明涉及一种柑橘黄龙病亚洲种PCR检测，尤其涉及一种柑橘黄龙病 亚洲种巢氏PCR检测体系及应用，属于分子生物领域。

背景技术

目前，巢氏PCR（Nested-PCR）是柑橘黄龙病的比较常用的一种检测方法， 具有比常规PCR灵敏度更高、特异性更强的优点。巢式PCR反应利用两套PCR 引物进行两轮PCR扩增反应，在第一轮扩增中，外套引物用以产生扩增产物， 扩增所得产物在内嵌引物的存在下进行第二轮扩增。

巢式PCR反应虽然增加了扩增反应的复杂性但降低了扩增多个靶位点的 可能性、增加了检测的特异性，但是柑橘黄龙病亚洲种病原PCR检测反应体系 所需的各种试剂价格昂贵，需要承担的费用较大，因此尽量采用小体系。以 第一轮PCR产物作为第二轮PCR的模板时，其中又可分为两种途径：

（1）把第一轮PCR产物经琼脂糖凝胶电泳，切胶放-20℃过夜，12000rpm 离心10min，取上清液做模板回收或直接把胶片割胶直接纯化再进行第二轮 PCR。此种方法要用大量的切胶，胶切碎了再加入TE，反复冻融离心取上清， 回收率很低，过程中损失很多DNA；或者需要另行准备柱子等设备以及其他试 剂，步骤繁琐、费工费时。

（2）把第一轮PCR产物稀释后作为第二轮PCR的模板，在引物、ddH₂O、 2×Taq PCR MasterMix（不含染料）用量固定的前提下，第一轮PCR产物的稀 释倍数就成为整个巢氏PCR最终效果的决定性因素。目前，稀释体积倍数常为 50～10000倍。最常用的稀释体积倍数为50倍、100倍、1000倍、10000倍。为 防止在第二轮PCR过程中RNA干扰，以达到更佳效果，一般使用RNase-free  water或者0.1%DEPC来进行稀释，而这两种试剂价格却不菲。RNase-free water 价格为48元/100ml（北京康为世纪生物科技有限公司），0.1%DEPC工作液价格 为100元/100ml（北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司）。因此，在运用巢氏PCR 技术检测柑橘黄龙病的过程中，虽然高稀释倍数容易实现最终的检测结果， 但是稀释倍数越高，所需要的RNase-free water或者0.1%DEPC的工作液就越 多，也就意味着更多的能耗。如果能够把第一轮PCR产物稀释倍数大幅度降低 且最终能够满足巢氏PCR技术要求，那么不仅节省了试剂剂量，还能达到节约 能耗的目的，因为在制作DEPC等试剂的过程中，一般都会用到高温（120℃） 高压灭菌处理后才能使用。

发明内容

本发明的目的是提供一种柑橘黄龙病亚洲种巢氏PCR扩增检测体系及应 用。

本发明的目的通过如下技术方案实现：

一种柑橘黄龙病亚洲种巢氏PCR扩增检测体系，包括第一轮PCR扩增体 系和第二轮PCR扩增体系，所述第一轮PCR扩增体系和第二轮PCR扩增体 系最终体积均为10～20μL，其中均包括DNA模板1.0μL、2×Taq PCR  Master Mix5μL、引物0.5μL，余量为灭菌双蒸水；其中第二轮PCR扩增体 系的DNA模板由第一轮PCR扩增产物稀释10～20倍体积后制得。

优选的是：所述第一轮PCR扩增体系的DNA模板浓度为2.75ng/μl。

优选的是：所述的2×Taq PCR Master Mix不含染料，其中包括浓度均为 0.4mmol/L的dATP、dCTP、dGTP、dTTP；浓度为4mmol/L的Mgcl₂；总浓 度为0.05U/μL的Taq酶和Pfu DNA聚合酶。

优选的是：所述引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物和下游引 物浓度均为5μmol/L，体积比为1:1。

利用上述的柑橘黄龙病亚洲种巢氏PCR扩增检测体系进行PCR扩增反 应，该扩增反应包括第一轮PCR扩增和第二轮PCR扩增，第二轮PCR扩增 的DNA模板是将第一轮PCR扩增产物稀释而得，第一轮PCR扩增反应条件 为94℃预变性4min，94℃变性30sec，58℃退火45sec，72℃延伸45sec， 35个循环，72℃最后延伸7min；第二轮PCR扩增反应条件为94℃预变性4 min，94℃变性45sec，55℃退火45sec，72℃延伸45sec，35个循环，72℃ 最后延伸7min。

本发明有益效果：

(1)第一轮及第二轮PCR扩增反应体系为10～20μL，反应体系较小，检 测所需试剂量也少，相应的费用少。

(2)将第一轮PCR产物稀释10～20倍体积后作为第二轮PCR的模板，稀 释倍数较小，检测所需试剂也少，相应的费用少。

(3)本发明使用试剂量少，还能减轻实验废弃物对环境的污染。

(4)本发明使用试剂量少，使大规模检测柑橘黄龙病亚洲种大规模检测应 用成为可能，为柑橘黄龙病的综合防治提供坚实的技术支持，推动柑橘产业 健康发展，其所引发的社会效益规模是不可估量的。

附图说明

图1为7个砂糖橘叶片样品经第一轮PCR扩增反应所得产物经过10倍、 20倍、100倍体积稀释得到的三种浓度DNA模板进行三次重复第二轮PCR 扩增反应结果；

M泳道代表DNA marker DM2000；

泳道1-7分别代表样品AT5-2、AT5-4、AT5-49、AT5-55、AT5-71、AT5-84、 AT5-141；A、B、C分别代表样品10倍、20倍、100倍的稀释液；Ⅰ、Ⅱ、 Ⅲ代表三次重复试验。

具体实施方式

下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，但本发明的实施 方式并不局限于实施例表示的范围。这些实施例仅用于说明本发明，而非用 于限制本发明的范围。此外，在阅读本发明的内容后，本领域的技术人员可 以对本发明作各种修改，这些等价变化同样落于本发明所附权利要求书所限 定的范围。

实施例1

一、实验材料

1、植物材料

7个砂糖橘疑似黄龙病叶片材料，全部采自广西，分别编号为AT5-2、 AT5-4、AT5-49、AT5-55、AT5-71、AT5-84、AT5-141，其中，AT5-2、AT5-4 采自武鸣县，AT5-49、AT5-55采自岑溪县，AT5-71采自防城港市，AT5-84 采自隆安县，AT5-141采自西林县。

2、引物

根据柑橘黄龙病亚洲种（Candidantus Liberibacter asiaticus）的16S rDNA 序列，设计引物fd1/fd2（SEQ ID NO:1/SEQ ID NO:2）、OI1/OI2（SEQ ID  NO:3/SEQ ID NO:4），目的核酸片段长度是1160bp，由上海捷瑞生物工程有 限公司合成，引物序列如下:

fd₁：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3；

fd₂：5′-AAGGAGGTGATCCAGCC-3′。

OI₁：5′-GCGCGTATGCAATACGAGCGGCA-3′；

OI₂：5′-GCCTCGCGACTTCGCAACCCAT-3′。

3、基因组DNA提取试剂盒

快捷型植物基因组DNA提取套装系统，试剂盒购自天根生化科技（北京） 有限公司，套装包括FP₁和FP₂两种缓冲液。

4、2×Taq PCR MasterMix（不含染料），购自康为世纪生物科技（北京）有限 公司(版本号：01182013；目录号：CW0716)。

5、RNaseA（10mg/ml）、异丙醇、乙醇、缓冲液TE、灭菌双蒸水（ddH₂O）、 RNase-free water（购于北京康为世纪生物科技有限公司）等试剂。

二、实验方法

1、ＤＮＡ样品提取

（1）分别剪取7个砂糖橘疑似黄龙病叶片中脉，每份约100g，用液氮 研磨至粉末状，放置-20℃保存待用。

（2）取100mg步骤（1）制得的产品，加入400μL缓冲液FP1和6μL 的RNaseA（10mg/mL），涡旋振荡1min后，室温放置10min，期间轻柔地 翻转EP管2～3次。

（3）加入130μL缓冲液FP2，涡旋振荡1min使其充分混匀。

（4）12000r/min离心5min，转移上清液至新的EP管中。

（5）将上清液再次离心5min，12000r/min，转移上清液至新的EP管 中。

（6）向上清液中加入预冷的0.7倍体积的异丙醇，轻柔地翻转EP管使 其混匀，静置片刻，12000r/min离心2min，弃上清。

（7）沉淀加入700μL乙醇，涡旋振荡5s，12000r/min离心2min，弃 上清。

（8）重复第7步。

（9）开盖倒置，室温5～10min，彻底晾干残余的乙醇。

（10）加入适量的洗脱缓冲液TE，颠倒混匀，制成浓度为275ng/μl 的DNA提取液，置于-20℃保存待用。

2、PCR扩增反应体系及条件

利用柑橘黄龙病亚洲种(Candidantus Liberibacter asiaticus)的16S rDNA引 物fd₁/fd₂，OI₁/OI₂对7份DNA样品进行PCR扩增检测。第一轮PCR扩增体 系：即1.0μl DNA模板（将DNA提取液稀释100倍体积，制得浓度为2.75ng/μl 的DNA模板），5μl2×Taq PCR MasterMix，0.5μl fd₁/fd₂引物，加ddH₂O补至 10μl，所述的2×Taq PCR Master Mix不含染料，其中dATP、dCTP、dGTP、 dTTP浓度均为0.4mmol/L；Mgcl2浓度为4mmol/L；Taq酶和Pfu DNA聚合 酶总浓度为0.05U/μL，所述所述引物fd1、引物fd2浓度均为5μmol/L，体积 均为0.25μl。第一轮PCR扩增反应程序：94℃预变性4min，94℃变性30sec， 58℃退火45sec，72℃延伸45sec，35个循环，72℃最后延伸7min，4℃保存 产物。第二轮PCR扩增体系：分别取第一轮PCR产物1.0μl稀释10×、20×、 100×体积，再各自从中取1.0μl作为模板，5μl2×Taq PCR MasterMix，0.5μl OI₁/OI₂引物，加ddH₂O补至10μl，所述引物OI₁、引物OI₂浓度均为5μmol/L， 体积均为0.25μl。分别三次重复进行第二轮PCR扩增，第二轮PCR扩增反应 程序：94℃预变性4min，94℃变性45sec，55℃退火30sec，72℃延伸45sec， 35个循环，72℃最后延伸7min，4℃保存产物。

3、脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物

取3μl6×Loading buffer与第二轮PCR产物6.0μL DNA样品混合均匀后上 样，用1%的琼脂糖凝胶电泳，电泳条件为：1×TAE电泳缓冲液，电压150V， 15min，电泳结束后，在FIRE READER XS D-56-26.M凝胶成像系统下观察 拍照。

三、实验结果

图1中电泳结果显示，第一轮PCR扩增反应产物经过稀释10、20、100 倍体积后得到的ＤＮＡ模板均能扩增出目的基因。

实施例2

分别将实施例1制得的7份DNA提取液稀释100倍体积后制得浓度为 2.75ng/μl的DNA模板备用。

利用柑橘黄龙病亚洲种(Candidantus Liberibacter asiaticus)的16S rDNA引 物fd₁/fd₂，OI₁/OI₂对7份DNA样品进行PCR扩增检测。第一轮PCR扩增体 系：即1.0μl DNA模板（浓度为2.75ng/μl），5μl2×Taq PCR MasterMix，0.5μl fd₁/fd₂引物，加ddH₂O补至15μl，所述的2×Taq PCR Master Mix不含染料， 其中dATP、dCTP、dGTP、dTTP浓度均为0.4mmol/L；Mgcl₂浓度为4mmol/L； Taq酶和Pfu DNA聚合酶总浓度为0.05U/μL，所述所述引物fd₁、引物fd₂浓 度均为5μmol/L，体积均为0.25μl。第一轮PCR扩增反应程序：94℃预变性 4min，94℃变性30sec，58℃退火45sec，72℃延伸45sec，35个循环，72℃ 最后延伸7min，4℃保存产物。第二轮PCR扩增体系：分别取第一轮PCR产 物1.0μl用RNase-free water稀释15倍体积，再各自从中取1.0μl作为模板，5μl 2×Taq PCR MasterMix，0.5μl OI₁/OI₂引物，加ddH₂O补至15μl，所述引物 OI₁、引物OI₂浓度均为5μmol/L，体积均为0.25μl。分别三次重复进行第二轮 PCR扩增，第二轮PCR扩增反应程序：94℃预变性4min，94℃变性45sec， 55℃退火30sec，72℃延伸45sec，35个循环，72℃最后延伸7min，4℃保存 产物。

采用与实施例1相同的脂糖凝胶电泳条件进行PCR扩增产物检测。

实施例3

分别将实施例1制得的7份DNA提取液稀释100倍体积后制得浓度为 2.75ng/μl的DNA模板备用。

利用柑橘黄龙病亚洲种(Candidantus Liberibacter asiaticus)的16S rDNA引 物fd₁/fd₂，OI₁/OI₂对7份DNA样品进行PCR扩增检测。第一轮PCR扩增体 系：即1.0μl DNA模板（浓度为2.75ng/μl），5μl2×Taq PCR MasterMix，0.5μl fd₁/fd₂引物，加ddH₂O补至20μl，所述的2×Taq PCR Master Mix不含染料， 其中dATP、dCTP、dGTP、dTTP浓度均为0.4mmol/L；Mgcl₂浓度为4mmol/L； Taq酶和Pfu DNA聚合酶总浓度为0.05U/μL，所述所述引物fd₁、引物fd₂浓 度均为5μmol/L，体积均为0.25μl。第一轮PCR扩增反应程序：94℃预变性 4min，94℃变性30sec，58℃退火45sec，72℃延伸45sec，35个循环，72℃ 最后延伸7min，4℃保存产物。第二轮PCR扩增体系：分别取第一轮PCR产 物1.0μl稀释20体积，再各自从中取1.0μl作为模板，5μl2×Taq PCR  MasterMix，0.5μl OI₁/OI₂引物，加ddH₂O补至20μl，所述引物OI₁、引物OI₂浓度均为5μmol/L，体积均为0.25μl。分别三次重复进行第二轮PCR扩增， 第二轮PCR扩增反应程序：94℃预变性4min，94℃变性45sec，55℃退火 30sec，72℃延伸45sec，35个循环，72℃最后延伸7min，4℃保存产物。

采用与实施例1相同的脂糖凝胶电泳条件进行PCR扩增产物检测。