一种指导硝酸甘油用药及健康饮酒的引物组合物、多重基因检测试剂盒及其使用方法

摘要

本发明公开了一种指导硝酸甘油用药及健康饮酒的引物组合物、多重基因检测试剂盒及其使用方法，包括超纯水，X溶液，10×PCR缓冲液，PCR引物，25mM氯化镁溶液，DNA聚合酶和阳性对照品，特点是PCR引物包括2个与硝酸甘油用药及健康饮酒相关基因上的2个SNP位点上的不同基因型的正反向扩增引物及反应内参的正反向扩增引物，其基因序列如SEQ ID NO.1～NO.8所示；其使用方法包括采集样本并提取核酸的步骤；以提取的核酸为模板进行PCR反应的步骤；最后毛细电泳分离样品的步骤，优点是特异性强、准确性高、通量高、可靠性强、成本低、无假阴性结果。

说明书

技术领域

本发明涉及一种多重基因检测试剂盒及其检测方法，尤其是涉及一种指导硝酸甘油用药及健康饮酒的引物组合物、多重基因检测试剂盒及其使用方法。 

背景技术

硝酸甘油为硝基血管扩张药，是防治冠心病心绞痛的特效常用药品之一。硝酸甘油及其它含硝基药物（如硝普钠）在体内都可产生活性NO自由基，从而激活平滑肌和其他组织的鸟苷酸环化酶，增加cGMP的合成。cGMP激活cGMP依赖的蛋白激酶，改变平滑肌中不同蛋白的磷酸化，使肌球蛋白（myosin）轻链去磷酸化。已知肌球蛋白轻链的磷酸化与维持平滑肌的收缩状态有关，实验证据表明硝基血管扩张剂的药理和生化作用与血压内皮衍生舒张因子（EDRF）（已证明为NO或含NO的物质）相同。研究发现ALDH2基因与硝酸甘油转化为NO密切相关。但如果病人ALDH2基因中发生Glu504Lys突变，就会影响ALDH2的酯酶活性，使硝酸甘油在体内的生物转化过程受阻，从而不能有效代谢硝酸甘油，导致一氧化氮减少甚至无法产生一氧化氮，药物也就难以有效发挥作用，长时间不能解除的心绞痛可能发展为急性心肌梗塞，引起生命危险。大约三分之一的东亚人具有ALDH2基因Glu504Lys突变，对ALDH2基因多态性的诊断能够科学地指导心绞痛患者选择药物。 

同时，ALDH2也是酒精代谢途径中关键酶基因之一。酒精进入体内后，首先经乙醇脱氢酶1B（ADH1B）催化，代谢为乙醛。乙醛会进一步 在乙醛脱氢酶2（ALDH2）的作用下转化为乙酸，乙酸最终代谢生成CO2和水，排出体外。乙醛不稳定且容易产生自由基。乙醛蓄积将会造成许多组织和器官如肝、肾、心、脑严重伤害并可能致癌，如肝癌、胃癌等。世界卫生组织癌症研究机构在2009年把酒精代谢物乙醛归为一级致癌原（与黄曲霉素同级）。ALDH2基因发生Glu504Lys突变后，编码得到的是没有活性的蛋白，乙醛转化为乙酸受阻，会造成乙醛堆积。ADH1B基因发生Arg48His突变后，乙醇转化成乙醛的速度是野生型的40到100倍，会导致乙醛迅速产生。对ALDH2和ADH1B基因多态性的诊断能够科学地指导人们健康饮酒。 

现有的用于单核苷酸多态性（SNP）检测方法主要为基因芯片、荧光定量PCR及Sanger测序法。 

(1)qPCR检测方法：采用荧光淬灭及双末端标记技术，针对SNP位点变异设计特异性的探针。其优点是灵敏度高、准确性强。其缺点是（1）通量低：不适宜多SNP位点的检测；难以设置内控基因。(2)成本较高：探针标记成本高；若需获得所有相关SNP信息，需进行多个检测试验，叠加成本更加昂贵。 

(2)基因芯片法：基因芯片是通过微加工技术，将数以万计、乃至百万计的特定序列的DNA片段（基因探针），有规律地排列固定于硅片、玻片等支持物上，构成的一个二维DNA探针阵列，利用这类芯片与标记的生物样品进行杂交，可对样品的基因表达谱生物信息进行快速定性和定量分析。DNA芯片：由于高通量等优点在SNP检测中得到大量应用，依靠野生型与突变型基因杂交动力学的差异对突变位点进行检测。其优点是：（1）高通量并行检测；（2）操作简便快速：整个检测只需4-8小时基本可以出结果。缺点：1）不同SNP位点之间的杂交动力学差异不同，在进行多位点同时检测时条件难以控制；2）技术成本昂贵、复杂：每个样品需要一个芯片，成本大于￥1000/样品，不利于大规模推广；探针的合成与固定比较复杂，特别是制作高密度的探针阵列，是主要的限速步骤；3）重复性差，准确性低，易出现假阳性假阴性结果；4）灵敏度较低：芯片法需核酸量较大，一般须先做多重PCR扩增，由于引物较多，容易自身产生二聚体，发夹结构，或由于Tm值不同，而导致扩增目的片段效率不 同，进而影响检测的灵敏度；5）由于芯片的种类较多，难以制定一个统一的质量控制标准。 

（3）Sanger（双脱氧链终止法）测序法：Sanger法是根据核苷酸在某一固定的点开始，随机在某一个特定的碱基处终止，并且在每个碱基后面进行荧光标记，产生以A、T、C、G结束的四组不同长度的一系列核苷酸，然后在尿素变性的PAGE胶上电泳进行检测，从而获得可见的DNA碱基序列。其优点是SNP分析金标准，能发现已知SNP，也能发现未知SNP。缺点是每个样本的每个位点均需要经PCR扩增，跑胶，然后切胶纯化，再测序。步骤多而分散，成本较高，工作量大，周期长，多个SNP位点检测累计价格相对昂贵。 

多重SNP位点检测方法基于多重PCR和毛细管电泳（CE）分离技术。采用多重PCR方法，在同一个反应管中同时加入≥1对特异性基因扩增引物及反应内参引物，根据基因扩增片段的大小用毛细管电泳分离分析多个SNP位点及基因型，能快速有效地检测多个SNP位点，克服了传统方法存在的缺陷，具有以下优势： 

1、高通量：本系统实现单个反应检测30-40个位点。 

2、准确性强：采用CE对PCR产物进行分离，可将非特异性扩增产物、引物二聚体和特异性扩增产物分离，最大程度降低假阳性； 

3、敏感性高，结果重复性好：本系统克服了传统PCR扩增方法的不均等扩增造成的偏差，提高了对一套目的基因进行定性的速度和敏感性，采用激光诱导荧光-PMT，具有超高灵敏度； 

4、方法简便，使用经济：本发明提供从试剂、多重PCR引物设计、结果分析等全套实验方案；每个样品的检测成本少于￥50，利于大规模推广； 

5、灵活性强：可随时根据需求调整检测的靶基因。 

6、易于实现自动化。 

目前，国内外还没有关于基于多重PCR和CE分离的多重SNP检测指导噻嗪类利尿药用药的试剂盒及其使用方法的相关报道。 

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种特异性强、准确度高、通量高、可靠性强、成本低、无假阴性结果的基于多重SNP检测系统的指导硝酸甘油用药及健康饮酒的引物组合物。 

本发明所要解决的技术问题还在于提供包含上述引物组合物的试剂盒及其使用方法。 

本发明解决上述技术问题所采用的技术手段是：一种指导硝酸甘油用药及健康饮酒的引物组合物，包括以下2个与硝酸甘油用药及健康饮酒相关基因上的2个SNP位点上的不同基因型的正反向扩增引物的正反向扩增引物及反应内参的正反向扩增引物，其核酸序列如下表1所示： 

表1 

上述ALDH2基因上rs671片段的G型基因的反向扩增引物与A型基因的反向扩增引物均为核酸序列SEQ ID NO.3：CGGCAGGTCCTGAACCTCTG；ADH1B基因上rs1229984片段的G型基因的反向扩增引物与A型基因的反向扩增引物均为核酸序列SEQ ID NO.6：ATATTTAGGAATAGTAGGGATTAGTA。 

一种指导硝酸甘油用药及健康饮酒的多重基因检测试剂盒，包括如上表1所述的引物组合物、PCR反应液和阳性对照品；所述PCR反应液包括以下组分：超纯水，X溶液，10×PCR缓冲液，25mM氯化镁溶液，DNA聚合酶。 

所述的X溶液为包括三磷酸脱氧核苷酸（dNTPs）和通用引物，所述的通用引物正向扩增引物序列为AGGTGACACTATAGAATA，如SEQ ID NO.9所示；反向扩增引物序列为GTACGACTCACTATAGGGA,如SEQ ID NO.10所示;所述的通用引物正向扩增引物带荧光标记。 

所述的阳性对照品为上述2个与硝酸甘油用药及健康饮酒相关基因上的2个SNP位点上的不同基因型的引物克隆所得DNA片段。 

上述一种指导硝酸甘油用药及健康饮酒的多重基因检测试剂盒的使用方法，具体包括以下步骤： 

（1）采集样本并提取核酸 

采集患者口腔拭子或血液样品的分离培养物，从分离培养物中提取核酸； 

（2）以提取的核酸为模板进行PCR反应 

取DNA样品2μL，10×PCR缓冲液2μL，25mM的氯化镁3.4μL，PCR引物溶液2μL，DNA聚合酶0.6μL，X溶液2μL，超纯水10μL混匀后加入到96孔样品板上进行PCR反应，反应条件：95℃2分钟；94℃30秒钟，55℃30秒钟，70℃1分钟，循环35次；70℃1分钟；4℃直至收取PCR产物；其中所述的X溶液为包括三磷酸脱氧核苷酸（dNTPs）和通用引物，所述的通用引物正向扩增引物序列为AGGTGACACTATAGAATA，如SEQ ID NO.9所示；反向扩增引物序列为GTACGACTCACTATAGGGA，如SEQ ID NO.10所示；所述的通用引物正向扩增引物带荧光标记；PCR引物溶液中各PCR引物浓度均为200nM，所述的PCR引物包括以下2个与硝酸甘油用药及健康饮酒相关基因上的2个SNP位点上的不同基因型的正反向扩增引物及反应内参的正反向扩增引物，基因序列如序列表中SEQ ID NO.1～NO.8所示； 

（3）毛细电泳分离样品 

取PCR产物0.1-1μL，上样缓冲液38.75μL，DNA Marker0.5μL，矿物油一滴混合均匀后加入到96孔分离液板上进行毛细电泳分离样品，将遗传分析仪软件获得的图谱与标准图谱对比，获得指导硝酸甘油用药及健康饮酒相关基因的SNP位点的等位基因型。 

本发明与现有技术相比，其具有以下有益效果：本发明是指导硝酸 甘油用药及健康饮酒的引物组合物、多重基因检测试剂盒及其使用方法，本发明引物组合物、多重基因检测试剂盒及使用方法基于多重PCR和毛细电泳技术，利用不同长度的PCR特异性扩增片段来鉴定区分不同的基因，创立了一种同步检测ALDH2和ADH1B两个基因的两个SNP位点上的不同基因型的检测方案，以指导硝酸甘油用药及健康饮酒，本方法优化多重PCR反应体系，对待测DNA样品进行特异性扩增，再用毛细电泳方法分离PCR扩增产物以鉴别不同的基因和基因型，其一天之内可完成192个患者样品的检测，既节约了生产成本和检测成本，又提高了检测效率及缩短了时间；反应内参的使用可用于监测整个反应系统、PCR反应的效率，避免假阴性。 

上述试剂盒可同步对2个与硝酸甘油用药及健康饮酒相关基因上的2个SNP位点（2个SNP位点分别为rs671和rs1229984）上的不同基因型进行检测，利用不同长度的PCR特异性扩增片段来鉴定区分SNP位点的等位基因型，以指导硝酸甘油用药及健康饮酒，具体如表2所示： 

表2硝酸甘油用药及健康饮酒多重基因检测检测靶标位点 

综上所述，本发明基于多重PCR-CE的指导硝酸甘油用药及健康饮酒 的引物组合物、多重基因检测试剂盒及其使用方法，同步对2个与硝酸甘油用药及健康饮酒相关基因上的2个SNP位点上的不同基因型进行检测，检测敏感性高，特异性好，降低了常规PCR扩增的假阳性率，还能够有效解决常规PCR的易污染问题；具有非竞争性内对照体系，可靠性强，无假阴性结果，本发明应用多重PCR和毛细电泳的方法，具有通量大、准确度高、灵敏度好等技术优势，以单个反应即可快速准确地检测出样品中所有相关基因的多态性，为临床提供一种优越的低成本的分子诊断方法，有助于指导硝酸甘油用药及健康饮酒。 

附图说明

图1、为一个人类DNA样品使用硝酸甘油用药及健康饮酒的多重基因检测试剂盒毛细电泳分离样品结果。 

具体实施方式

为了更好地理解本发明的内容，下面结合具体实施例和附图作进一步说明。应理解，这些实施例仅用于对本发明进一步说明，而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明所述的内容后，该领域的技术人员对本发明作出一些非本质的改动或调整，仍属于本发明的保护范围。 

实施例1 

本发明一种指导硝酸甘油用药及健康饮酒的多重基因检测试剂盒，使用时采集患者血液或口腔拭子样品提取核酸，以患者核酸为模板进PCR反应，最终用毛细电泳方法分离样品，具体步骤如下： 

1、生产指导硝酸甘油用药及健康饮酒的多重基因检测试剂盒，试剂盒中包括的组分： 

1)PCR引物（PCR Primer Mix）: 

2)25mM氯化镁（MgCl₂） 

3)DNA聚合酶（Taq DNA Polymerase） 

4)X溶液（Solution X） 

5)PCR缓冲液（PCR Buffer） 

6)阳性对照（Positive Control） 

7)超纯水（ddH₂O） 

上述PCR引物包括以下2个与指导硝酸甘油用药及健康饮酒相关基因上的2个SNP位点上的不同基因型的正反向扩增引物及反应内参的正反向扩增引物，其核酸序列如表1（或者参见序列表SEQ ID NO.1～8）所示。 

其中，所述的X溶液为包括三磷酸脱氧核苷酸（dNTPs）和通用引物，所述的通用引物正向扩增引物序列为AGGTGACACTATAGAATA，如SEQ ID NO.9所示；反向扩增引物序列为GTACGACTCACTATAGGGA,如SEQ ID NO.10所示;所述的通用引物正向扩增引物带荧光标记。 

2、采集样本并提取核酸 

采集人口腔拭子或血液样品并提取核酸。 

3、以提取的患者核酸为模板进行PCR反应 

1）按以下比例在96孔样品板/八连管上加入试剂和样品（PCR板见表3），并设置一个阳性对照反应： 

表3PCR反应试剂和样品混合比例 

PCR反应试剂>量/孔>ddH₂O>8>25mM MgCl₂3.4>10×PCR缓冲液>2>PCR引物溶液>2>X溶液>2>DNA样品>2>DNA聚合酶>0.6>Total>20μL>

 注：阳性对照品为上述实施例1中2个与硝酸甘油用药及健康饮酒相关基因上的2个SNP位点上的不同基因型的引物克隆所得DNA片段。 

2）混匀后按以下温度进行热循环反应（见表4）： 

表4PCR反应条件 

步骤>温度>时间>1>95℃>2分钟>2>94℃>30秒钟>3>55℃>30秒钟>4>70℃>1分钟>5>N/A>重复2-4步骤34次（共35次）>6>70℃>1分钟>7>4℃>持续:直至收取PCR产物>

4、毛细电泳分离样品 

1）制备CE样品（见表5）： 

表5CE样品混合比例 

名称>量/孔>上样缓冲液>38.75μL>DNA大小标准400>0.5μL>PCR产物>0.1-1μL>矿物油>1滴>

2）毛细电泳分离样品 

将PCR产物加入96孔毛细管电泳分离板上适当数目的孔中；毛细管电泳分离是一类以毛细管为分离通道、以高压直流电场为驱动力的新型液相分离技术，具体程序为90℃变性120秒，进样电压2kv，30秒，分离电压6kv，35分钟。 

5、结果分析 

分析本试剂盒的CE检测数据，根据各特征峰出现的位置和数量，确定基因型。以ALDH2基因为例：只出现ALDH2_G（CE片段长度199nt）时，结果为ALDH2G纯合子；只出现ALDH2_A（CE片段长度204nt）时，结果为ALDH2A纯合子；ALDH2_G峰和ALDH2_A峰同时出现，结果为ALDH2杂合子。ADH1B基因的结果判定方法与ALDH2基因相同。 

表6.本试剂盒检测的基因位点、反应内参的CE片段长度 

注：表6、图1中的ALDH2和ADH1B为检测的基因位点，pcDNA为反应内参。 

图1为一个人类DNA样品使用硝酸甘油用药及健康饮酒的多重基因检测试剂盒毛细电泳分离样品结果。共出现5个特征峰：ALDH2G（199nt）、ALDH2A（204nt）、ADH1B G（220nt）、ADH1B A（225nt）、pcDNA（166nt）。分析结果：ALDH2G（199nt）、ALDH2A（204nt）同时出现，说明ALDH2为杂合子；ADH1B G（220nt）、ADH1B A（225nt）同时出现，说明ADH1B为杂合子；pcDNA为反应内参，说明PCR反应成功。该图1也可以作为标准图谱，测定其它样品基因型时，将遗传分析仪软件获得的图谱与该标准图谱对比，获得指导硝酸甘油用药及健康饮酒相关基因的SNP位点的等位基因型。 

实施例2 

检测试剂特异性分析：单重PCR扩增经毛细管电泳检测为目标片段大小的单峰。 

上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内，做出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。