一种快速检测血液中附红细胞体、钩端螺旋体、弓形虫的试剂盒及应用

摘要

本发明公开一种快速检测血液中附红细胞体、钩端螺旋体、弓形虫的试剂盒及应用。该试剂盒由可拆分的96孔PCR管、PCR反应液、TaqDNA聚合酶、标准品、对照品组成。PCR反应液含有PCR缓冲液、dNTPs、MgCl

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术，尤其涉及一种快速检测血液中附红细胞体、钩端螺旋体、弓形虫的试剂盒，可以同时对单个或多个混合感染红细胞体、钩端螺旋体、弓形虫的血液标本进行鉴别检测。 

背景技术

附红细胞体（Eperythrozoon）、钩端螺旋体（Leptospira）、弓形虫（Toxoplasma gondii）是在世界各地都广泛流行的三种人畜共患病原体，三者共同的特点是都存在于动物血液中，能引起患病动物体温升高，是曾经报道过的猪“高温高热综合症”其中重要的三种病原体，人群可通过接触患病动物以及动物性产品猪血等而发生感染。附红细胞体也称血虫体，是寄生于人、畜红细胞表面、血浆和骨髓中的一种单细胞原生物，能引起各种动物热性、溶血性疾病，人、猪、牛、羊等多种动物均可感染，各阶段猪的感染率达80～90﹪，人的感染阳性率可达86﹪。钩端螺旋体可引起人及动物的钩端螺旋体病，简称钩体病，是在世界各地都广泛流行的一种人畜共患病，中国绝大多数地区都有不同程度的流行，患病仔猪的主要症状是黄疸、高烧，病猪往往是长期带菌者和排菌者，给畜牧业造成巨大损失，并且对人民健康危害很大，是我国重点防治的传染病之一。弓形虫寄生于细胞内，随血液流动，到达全身各部位，破坏大脑、心脏、眼底，致使机体的免疫力下降，增加其它疾病感染几率，人可通过接触患病动物及污染食品而感染，尤其对孕妇危害极大，可出现流产、死胎或新生儿疾病，或者出生后有眼、脑或肝脏的病变或畸形。这三类疾病早期不容易辨别，诊断难度大，且传播范围广，容易随畜体及污染的动物性产品传染给人。因此，要控制这类疾病的流行必须从源头抓起，控制人畜共患病在畜禽中流行，保障食品安全。 

目前，针对附红细胞体、钩端螺旋体、弓形虫主要依靠血清学、病原形态鉴定等传统方法，然而这些检测方法具有检测时间长，工作量大，程序繁琐，很难适应现代化规模养殖场检疫、动物进出口疾病检疫工作的需 要，严格的病原体检测是保障动物、人体安全的重要环节，因此亟需建立一种操作简便、灵敏度和特异性高、快速准确、一管检测检测多种病原体方法。 

多重PCR(multiplex PCR)，又称复合PCR，其不同于传统PCR技术只能检测单一靶基因，它是在同一PCR反应体系里加入多对特异性引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR反应，因此可用于多种微生物的同时快速检测或鉴定，具有高效性、高特异性、简便、快速、易检测等特点。目前该技术主要用于多种细菌、病毒病的快速检测中，而对血液中同时检测附红细胞体、钩端螺旋体、弓形虫的多重PCR快速检测方法未有报道和公开。 

发明内容

本发明的一个目的是针对现有技术的不足，提供了一种快速检测血液中附红细胞体、钩端螺旋体、弓形虫的试剂盒。 

为实现上述目的，本发明首先根据附红细胞体、钩端螺旋体、弓形虫的特征靶基因分别设计3对特异性引物：F1/R1、F2/R2、F3/R3。附红细胞体特异性引物F1/R1扩增后的长度为186bp，钩端螺旋体特异性引物F2/R2扩增后的长度为293bp，弓形虫特异性引物F3/R3扩增后的长度为407bp。各特异性引物具有高度中内保守、种间特异性等优点。扩增后片段长度大小各异，可通过电泳进行分开辨别。 

本发明试剂盒由可拆分的96孔PCR管、PCR反应液、Taq DNA聚合酶、标准品、对照品组成。 

所述的标准品为分别含有附红细胞体、钩端螺旋体、弓形虫DNA片段的三种DNA样品； 

所述的对照品分为阳性对照品和阴性对照品；其中阳性对照品为附红细胞体、钩端螺旋体、弓形虫DNA样品混合液；阴性对照品为无菌去离子水； 

所述的PCR反应液含有10mmol/L PCR缓冲液、0.5mmol/L dNTPs、1.5mmol/L MgCl₂、50mmol/L KCl、100μg/ml明胶、0.5μmol/L各检测用引物，其中PCR缓冲液为pH值8.3的Tris-Cl缓冲液，各检测用引物分别为检测3种病原体的上游引物和下游引物共6条，如表1所示： 

表1附红细胞体、钩端螺旋体、弓形虫三种病原体的特异性引物 

本发明试剂盒保存于-20℃，尽量减少反复冻融。 

本发明的另一个目的是提供上述试剂盒在检测血液中是否感染附红细胞体、钩端螺旋体、弓形虫中单个或多个病原体的应用。 

本发明试剂盒的使用方法是： 

1.PCR反应体系制备：反应总体积为25μl，包括PCR反应液22.38μl，Taq DNA聚合酶0.12μl，待检的DNA样品2.5μl。 

2.设立阳性对照品与阴性对照品；阳性对照品为附红细胞体、钩端螺旋体、弓形虫DNA样品混合液；阴性对照品为无菌去离子水。 

2.PCR扩增检测：将混合好的PCR反应液置于96孔PCR管中，然后放入PCR仪中进行PCR反应。反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，56.3℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸7min。 

3.检测结果判定：PCR扩增反应结束后，将2.5μl扩增产物与0.2μl6×上样缓冲液（Loading Buffer）混合，用1.5﹪琼脂糖凝胶电泳检测，根据凝胶成像系统成像得到相应的电泳条带判断结果。阳性对照孔均有目的条带而阴性对照孔无任何条带说明PCR反应检测成功。被检样本孔出现的电泳条带与阳性对照孔相应条带大小一致则判定为阳性，反之则为阴性。 

本发明与现有技术相比具有的有益势效果： 

1）检测速度快：本发明的最大优点是只需一个反应即可快速、准确检测出被检样品中附红细胞体、钩端螺旋体、弓形虫三种病原体DNA，也可用于附红细胞体、钩端螺旋体、弓形虫感染的分子流行病学调查及疗效监测。本方法仅仅在一个96孔PCR管中即可同时检测三种寄生虫的DNA，尤其是用于大量样品的大规模检测时，操作简单，所需样本剂量可大大减少，不仅省时省力而且节省了大量的试剂和耗材，提高了工作效率。 

2）检测灵敏度高、特异性好：通过分子生物学软件及pubmed数据库比对分析，分别选出特异性强的三种病原体基因，利用oligo软件对引物进行分析比对，对PCR反应体系进行调整，从而制备了灵敏性高、特异性好的检测试 剂盒。该试剂盒可以检测出0.1ng的DNA含量，并且对其它常见病原体无交叉反应。 

3）操作简便：传统PCR在操作时要一步步加入PCR Buffer、dNTP、引物、Taq酶、DNA，费时、耗力、出错率高、易污染，不适合大批量的样品检测。本检测试剂盒已根据反应条件将PCR反应液配置好，在使用时只需加入PCR反应液、Taq酶、DNA，在不影响结果的前提下大大算短了操作时间及所用耗材数量，也一定程度上减少了污染的概率。 

本发明是建立在分子生物学基础上的一种敏感性高、特异性强、简便、快捷的检测方法，可同时对单个或多个混合感染红细胞体、钩端螺旋体、弓形虫的标本进行鉴别检测，大大提高了检测准确率，降低了假阳性率。

附图说明 

图1为已知红细胞体、钩端螺旋体、弓形虫的标准多重PCR图谱，其中M：Marker;泳道1：红细胞体PCR扩增条带（186bp）；泳道2：钩端螺旋体PCR扩增条带(293bp)；泳道3：弓形虫PCR扩增条带（407bp）；泳道4：红细胞体、钩端螺旋体、弓形虫多重PCR扩增条带；泳道5：阴性对照； 

图2为实施例1～9的多重PCR图谱，其中M：Marker；泳道1～9：实施例1～9的PCR扩增条带；泳道10：阳性对照；11：阴性对照。 

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的分析。 

下面实施例所用的阳性对照品为附红细胞体、钩端螺旋体、弓形虫DNA样品混合液；阴性对照品为无菌去离子水。 

实施例1. 

步骤(1).样品DNA提取 

取可疑病猪猪血0.5ml，按通用基因组DNA提取试剂盒说明书提取DNA，得到待检的DNA样品。 

步骤(2).PCR反应体系制备：反应总体积为25μl，将PCR反应液置于冰上融化，依次取PCR反应液22.38μl，Taq DNA聚合酶0.12μl，待检的DNA样品2.5μl于96孔PCR管中混合，用移液器吹打混匀后,置入离心机5000r/min离心2s。同时设立阳性对照品与阴性对照品。 

步骤(3).PCR扩增检测：将混合好的反应管置于PCR仪中，设置反应条 件，进行PCR反应。设置反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，56.3℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸7min。 

步骤(4).检测结果判定：PCR扩增反应结束后，将2.5μl扩增产物与0.2μl6×Loading Buffer混合，用1.5﹪琼脂糖凝胶电泳检测，根据凝胶成像系统成像得到相应的电泳条带判断结果。如图2所示，泳道1的186bp处出现电泳条带，则说明该DNA样品中含有红细胞体；泳道1的293bp处出现电泳条带，则说明该DNA样品中含有钩端螺旋体；泳道1的407bp处未出现电泳条带，则说明该DNA样品中不含有弓形虫。因此该可疑病猪感染了红细胞体、钩端螺旋体两种病原体。 

实施例2. 

步骤(1).样品DNA提取 

取健康猪猪血0.5ml，按通用基因组DNA提取试剂盒说明书提取DNA，得到待检的DNA样品。 

步骤(2).PCR反应体系制备：反应总体积为25μl，将PCR反应液置于冰上融化，依次取PCR反应液22.38μl，Taq DNA聚合酶0.12μl，待检的DNA样品2.5μl于96孔PCR管中混合，用移液器吹打混匀后,置入离心机5000r/min离心2s。同时设立阳性对照品与阴性对照品。 

步骤(3).PCR扩增检测：将混合好的反应管置于PCR仪中，设置反应条件，进行PCR反应。设置反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，56.3℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸7min。 

步骤(4).检测结果判定：PCR扩增反应结束后，将2.5μl扩增产物与0.2μl6×Loading Buffer混合，用1.5﹪琼脂糖凝胶电泳检测，根据凝胶成像系统成像得到相应的电泳条带判断结果。如图2所示，泳道2的186bp处未出现电泳条带，则说明该DNA样品中不含有红细胞体；泳道2的293bp处未出现电泳条带，则说明该DNA样品中不含有钩端螺旋体；泳道2的407bp处未出现电泳条带，则说明该DNA样品中不含有弓形虫。因此该健康猪没有感染了红细胞体、钩端螺旋体、弓形虫三种病原体。 

实施例3. 

步骤(1).样品DNA提取 

取可疑病牛牛血0.5ml，按通用基因组DNA提取试剂盒说明书提取DNA，得到待检的DNA样品。 

步骤(2).PCR反应体系制备：反应总体积为25μl，将PCR反应液置于冰上融化，依次取PCR反应液22.38μl，Taq DNA聚合酶0.12μl，待检的DNA样品2.5μl于96孔PCR管中混合，用移液器吹打混匀后,置入离心机5000r/min离心2s。同时设立阳性对照品与阴性对照品。 

步骤(3).PCR扩增检测：将混合好的反应管置于PCR仪中，设置反应条件，进行PCR反应。设置反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，56.3℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸7min。 

步骤(4).检测结果判定：PCR扩增反应结束后，将2.5μl扩增产物与0.2μl6×Loading Buffer混合，用1.5﹪琼脂糖凝胶电泳检测，根据凝胶成像系统成像得到相应的电泳条带判断结果。如图2所示，泳道3的186bp处出现电泳条带，则说明该DNA样品中含有红细胞体；泳道3的293bp处出现电泳条带，则说明该DNA样品中含有钩端螺旋体；泳道3的407bp处出现电泳条带，则说明该DNA样品中含有弓形虫。因此该可疑病牛感染了红细胞体、钩端螺旋体、弓形虫三种病原体。 

实施例4. 

步骤(1).样品DNA提取 

取健康牛牛血0.5ml，按通用基因组DNA提取试剂盒说明书提取DNA，得到待检的DNA样品。 

步骤(2).PCR反应体系制备：反应总体积为25μl，将PCR反应液置于冰上融化，依次取PCR反应液22.38μl，Taq DNA聚合酶0.12μl，待检的DNA样品2.5μl于96孔PCR管中混合，用移液器吹打混匀后,置入离心机5000r/min离心2s。同时设立阳性对照品与阴性对照品。 

步骤(3).PCR扩增检测：将混合好的反应管置于PCR仪中，设置反应条件，进行PCR反应。设置反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，56.3℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸7min。 

步骤(4).检测结果判定：PCR扩增反应结束后，将2.5μl扩增产物与0.2μl6×Loading Buffer混合，用1.5﹪琼脂糖凝胶电泳检测，根据凝胶成像系统成像得到相应的电泳条带判断结果。如图2所示，泳道4的186bp处未出现电泳条带，则说明该DNA样品中不含有红细胞体；泳道4的293bp处未出现电泳条带，则说明该DNA样品中不含有钩端螺旋体；泳道4的407bp处未出现电泳条带，则说明该DNA样品中不含有弓形虫。因此该健康牛没有感 染了红细胞体、钩端螺旋体、弓形虫三种病原体。 

实施例5. 

步骤(1).样品DNA提取 

取可疑病鸡鸡血0.5ml，按通用基因组DNA提取试剂盒说明书提取DNA，得到待检的DNA样品。 

步骤(2).PCR反应体系制备：反应总体积为25μl，将PCR反应液置于冰上融化，依次取PCR反应液22.38μl，Taq DNA聚合酶0.12μl，待检的DNA样品2.5μl于96孔PCR管中混合，用移液器吹打混匀后,置入离心机5000r/min离心2s。同时设立阳性对照品与阴性对照品。 

步骤(3).PCR扩增检测：将混合好的反应管置于PCR仪中，设置反应条件，进行PCR反应。设置反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，56.3℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸7min。 

步骤(4).检测结果判定：PCR扩增反应结束后，将2.5μl扩增产物与0.2μl6×Loading Buffer混合，用1.5﹪琼脂糖凝胶电泳检测，根据凝胶成像系统成像得到相应的电泳条带判断结果。如图2所示，泳道5的186bp处出现电泳条带，则说明该DNA样品中含有红细胞体；泳道5的293bp处未出现电泳条带，则说明该DNA样品中不含有钩端螺旋体；泳道5的407bp处出现电泳条带，则说明该DNA样品中含有弓形虫。因此该可疑病鸡感染了红细胞体、弓形虫两种病原体。 

实施例6. 

步骤(1).样品DNA提取 

取健康鸡鸡血0.5ml，按通用基因组DNA提取试剂盒说明书提取DNA，得到待检的DNA样品。 

步骤(2).PCR反应体系制备：反应总体积为25μl，将PCR反应液置于冰上融化，依次取PCR反应液22.38μl，Taq DNA聚合酶0.12μl，待检的DNA样品2.5μl于96孔PCR管中混合，用移液器吹打混匀后,置入离心机5000r/min离心2s。同时设立阳性对照品与阴性对照品。 

步骤(3).PCR扩增检测：将混合好的反应管置于PCR仪中，设置反应条件，进行PCR反应。设置反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，56.3℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸7min。 

步骤(4).检测结果判定：PCR扩增反应结束后，将2.5μl扩增产物与0.2 μl6×Loading Buffer混合，用1.5﹪琼脂糖凝胶电泳检测，根据凝胶成像系统成像得到相应的电泳条带判断结果。如图2所示，泳道6的186bp处未出现电泳条带，则说明该DNA样品中不含有红细胞体；泳道6的293bp处未出现电泳条带，则说明该DNA样品中不含有钩端螺旋体；泳道6的407bp处未出现电泳条带，则说明该DNA样品中不含有弓形虫。因此该健康鸡没有感染了红细胞体、钩端螺旋体、弓形虫三种病原体。 

实施例7. 

步骤(1).样品DNA提取 

从医院获取患病病人血样0.5ml，按通用基因组DNA提取试剂盒说明书提取DNA，得到待检的DNA样品。 

步骤(2).PCR反应体系制备：反应总体积为25μl，将PCR反应液置于冰上融化，依次取PCR反应液22.38μl，Taq DNA聚合酶0.12μl，待检的DNA样品2.5μl于96孔PCR管中混合，用移液器吹打混匀后,置入离心机5000r/min离心2s。同时设立阳性对照品与阴性对照品。 

步骤(3).PCR扩增检测：将混合好的反应管置于PCR仪中，设置反应条件，进行PCR反应。设置反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，56.3℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸7min。 

步骤(4).检测结果判定：PCR扩增反应结束后，将2.5μl扩增产物与0.2μl6×Loading Buffer混合，用1.5﹪琼脂糖凝胶电泳检测，根据凝胶成像系统成像得到相应的电泳条带判断结果。如图2所示，泳道7的186bp处未出现电泳条带，则说明该DNA样品中不含有红细胞体；泳道7的293bp处未出现电泳条带，则说明该DNA样品中不含有钩端螺旋体；泳道7的407bp处出现电泳条带，则说明该DNA样品中含有弓形虫。因此该患病病人感染了弓形虫病原体。 

实施例8. 

步骤(1).样品DNA提取 

从医院获取健康人血样0.5ml，，按通用基因组DNA提取试剂盒说明书提取DNA，得到待检的DNA样品。 

步骤(2).PCR反应体系制备：反应总体积为25μl，将PCR反应液置于冰上融化，依次取PCR反应液22.38μl，Taq DNA聚合酶0.12μl，待检的DNA样品2.5μl于96孔PCR管中混合，用移液器吹打混匀后,置入离心机5000 r/min离心2s。同时设立阳性对照品与阴性对照品。 

步骤(3).PCR扩增检测：将混合好的反应管置于PCR仪中，设置反应条件，进行PCR反应。设置反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，56.3℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸7min。 

步骤(4).检测结果判定：PCR扩增反应结束后，将2.5μl扩增产物与0.2μl6×Loading Buffer混合，用1.5﹪琼脂糖凝胶电泳检测，根据凝胶成像系统成像得到相应的电泳条带判断结果。如图2所示，泳道8的186bp处未出现电泳条带，则说明该DNA样品中不含有红细胞体；泳道8的293bp处未出现电泳条带，则说明该DNA样品中不含有钩端螺旋体；泳道8的407bp处未出现电泳条带，则说明该DNA样品中不含有弓形虫。因此该健康人没有感染了红细胞体、钩端螺旋体、弓形虫三种病原体。 

实施例9. 

步骤(1).样品DNA制备 

按通用基因组DNA提取试剂盒说明书分别提取附红细胞体、钩端螺旋体、弓形虫DNA，用无菌去离子水分别调整到0.12ng/μl,各取20μl混合，最后得到的含有附红细胞体、钩端螺旋体、弓形虫DNA浓度均为0.04ng/μl。 

步骤(2).PCR反应体系制备：反应总体积为25μl，将PCR反应液置于冰上融化，依次取PCR反应液22.38μl，Taq DNA聚合酶0.12μl，待检的DNA样品2.5μl于96孔PCR管中混合，用移液器吹打混匀后,置入离心机5000r/min离心2s。同时设立阳性对照品与阴性对照品。 

步骤(3).PCR扩增检测：将混合好的反应管置于PCR仪中，设置反应条件，进行PCR反应。设置反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，56.3℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸7min。 

步骤(4).检测结果判定：PCR扩增反应结束后，将2.5μl扩增产物与0.2μl6×Loading Buffer混合，用1.5﹪琼脂糖凝胶电泳检测，根据凝胶成像系统成像得到相应的电泳条带判断结果。如图2所示，泳道9的186bp处出现电泳条带，则说明该DNA样品中含有红细胞体；泳道9的293bp处出现电泳条带，则说明该DNA样品中含有钩端螺旋体；泳道9的407bp处出现电泳条带，则说明该DNA样品中含有弓形虫。因此验证了该检测试剂盒可以同时检测出含有0.1ng的红细胞体、钩端螺旋体、弓形虫三种病原体DNA。 

上述实施例并非是对于本发明的限制，本发明并非仅限于上述实施例， 只要符合本发明要求，均属于本发明的保护范围。 

SEQUENCE LISTING

 

<110>  浙江大学

 

<120>  一种快速检测血液中附红细胞体、钩端螺旋体、弓形虫的试剂盒及应用

 

<130>  1

 

<160>  6    

 

<170>  PatentIn version 3.3

 

<210>  1

<211>  18

<212>  DNA

<213>  人工合成

 

<400>  1

ctccgctcct ccttttat                                                   18

 

 

<210>  2

<211>  19

<212>  DNA

<213>  人工合成

 

<400>  2

caggacttaa cacatcggc                                                  19

 

 

<210>  3

<211>  19

<212>  DNA

<213>  人工合成

 

<400>  3

acctaggaca attaggagg                                                  19

 

 

<210>  4

<211>  19

<212>  DNA

<213>  人工合成

 

<400>  4

gtcggactca taacctacc                                                  19

 

 

<210>  5

<211>  19

<212>  DNA

<213>  人工合成

 

<400>  5

cgaatgaaga gttggctgt                                                  19

 

 

<210>  6

<211>  18

<212>  DNA

<213>  人工合成

 

<400>  6

atccgtatgc acaattcc                                                   18