欧美杂交种葡萄巨峰抗旱基因VvMBF1

摘要

本发明公开了一个欧美杂交种葡萄巨峰抗旱基因VvMBF1，序列全长767bp，包含完整开放阅读框序列全长429bp，编码142个氨基酸，通过花序浸染法导入模式植物拟南芥中进行功能研究结果表明，该欧美杂交种葡萄巨峰抗旱基因VvMBF1能明显提高拟南芥对于渗透胁迫，干旱胁迫和失水处理的耐受力。在干旱胁迫下，转基因株系中的电解质渗漏率（EL），丙二醛（MDA）和活性氧（ROS）的积累明显低于野生对照，而脯氨酸（Proline）含量明显高于野生对照。气孔研究表明，转基因株系对ABA处理比野生对照更敏感。抗旱基因定量分析结果表明，转基因株系中依赖于ABA途径的抗旱基因AtRD22和AtRD29B的表达量明显高于野生对照。表明在转基因拟南芥中的过量表达通过依赖于ABA的途径提高了植株的抗旱能力。

说明书

技术领域

本发明涉及植物抗逆基因鉴定及基因工程技术领域，特别涉及一个欧美 杂交种葡萄巨峰抗旱基因VvMBF1。

背景技术

多蛋白桥梁因子MBF1（Multiprotein bridging factor1）是一类存在于古 生菌和真核生物中高度保守的转录辅激活蛋白，首次被提纯于蚕的后部丝腺 抽提物中。之后的研究表明，MBF1与内皮细胞分化、激素调节、脂类代谢、 中枢神经系统发育和组氨酸新陈代谢等不同过程的调控相关。转录辅激活蛋 白在真核生物的基因表达中扮演决定性的角色，不同有机体的MBF1蛋白 是通过TATA盒与C-Jun，GCN4，ATF1或其它核受体相互作用的。它的基 本表达导致了许多编码逆境反应的转录因子和信号转导基因的转录产物的 积累，如WRKY转录因子、类CBF转录因子、MAPK3/11和钙结合蛋白等。 在酵母、人和果蝇中的MBF1增强转录激活主要是通过一个基本的区域（如 bZIP类转录激活因子）和TATA盒连接蛋白之间的桥连作用。

目前的研究表明，植物中的MBF1具有多重生物学功能，主要表现在 参与各种抗逆过程，其次是植物的发育过程。拟南芥有三个亚型AtMBF1a， AtMBF1b和AtMBF1c。AtMBF1c参与应答高温、H2O2、干旱、高盐、病原 菌侵染以及植物激素等逆境条件，并在叶细胞周期和扩展过程中起着重要作 用。之后，不同植物中的MBF1的生物学功能陆续被发现。土豆、番茄、 烟草和小麦等植物中的MBF1与各种激素处理、生物和非生物胁迫相关。 事实上，就目前的研究看来，几乎所有的植物MBF1s都参与了生物和非生 物胁迫应答过程。

干旱是影响植物生长发育和产量的一个重要的环境因素。在我国尤其是 干旱和半干旱地区，缺水问题一直是限制农业生产的最主要因素之一。因此， 发掘植物抗旱相关基因对抗旱作物新品种的培育有重要意义。

植物在逆境胁迫过程中，细胞内产生过量的自由基会引发或加剧膜脂过 氧化作用而造成细胞膜系统的损伤，严重时会导致细胞死亡。细胞内电解质 渗漏率（EL）能反映细胞膜的完整性，从而判定细胞膜的损伤程度，进一 步说明植株的抗逆性的强弱。在植物体正常的代谢过程中，细胞内活性氧 （ROS）的产生和清除处于动态平衡。当处于逆境时，植物体内活性氧的平 衡受到破坏，植物细胞产生过量的ROS而无法被及时清除，造成了严重氧 化伤害，进而影响到了植物正常的生理代谢。因此可以通过测量ROS的含 量来判定植物细胞清除ROS的能力。根据生物自由基伤害学说，干旱胁迫 下造成植物伤害就是细胞内自由基的产生与清除的不平衡所致，从而发生膜 脂过氧化作用，形成丙二醛（MDA），使植物受到伤害。丙二醛（MDA） 是植物细胞膜脂过氧化作用的最终产物，是膜系统伤害的重要标志之一，可 以通过测定其含量来反映植株的抗逆性强弱。

脯氨酸是氨基酸中最为有效的渗透调节物质，正常情况下，植物体内的 脯氨酸含量较低，干旱胁迫时含量便会大大增高，对维持细胞与环境的渗透 平衡、稳定大分子的结构具有重要作用。在干旱胁迫下植物体内源脯氨酸可 能具有清除活性氧的作用。尽管对于许多植物来说，脯氨酸积累在逆境中的 生理作用的机理还不完全清楚，但有报道认为在干旱作用下脯氨酸含量的升 高有利于植物对干旱胁迫的抵抗，耐旱品种通常比不耐旱品种具有较强的积 累脯氨酸的能力。因此，通过测定脯氨酸的含量可以判定植株抗旱能力的强 弱。

大量研究结果表明，当植物受到干旱胁迫时，细胞迅速积累ABA。ABA 被普遍认为是一种干旱传递信号。在干旱信号ABA转导过程中，从ABA 的被感知到保卫细胞发生变化引起的气孔关闭，以及ABA诱导的基因表达 都经历了复杂的变化。气孔关闭被认为是植物应答干旱胁迫最快速最直接的 响应之一，气孔闭合的程度直接与植物在干旱胁迫下的失水能力相关。因此， 可以通过研究干旱胁迫下气孔关闭情况来判定植株的抗旱能力。一般干旱应 答基因能够快速而短暂地被ABA诱导，例如AtRD22和AtRD29B，但并不 是所有基因的表达都依赖于ABA，例如AtRD29A和AtERD1。这暗示了存 在着依赖于ABA和不依赖于ABA的抗旱调节途径。因此，可以通过检测 干旱胁迫下植物体内的这些标记基因的表达量来判定植物的抗旱调节途径。

发明内容

本发明的目的在于，提供一个欧美杂交种葡萄巨峰抗旱基因VvMBF1， 并证明了该基因在抗旱方面的功能，且初步探究了该基因的抗旱机制。

为了实现上述任务，本发明采用如下的技术解决方案：

一个欧美杂交种葡萄巨峰抗旱基因VvMBF1，其特征在于，其基因序列 如下：

1     ACGCGGGGACCCTAACCCTAAAGAGCAACAGCTCCAAGGAAGAACAACAAAGCGATATCT

61    ATGGCAGGAGTCGGACCGTTGACGCAGGACTGGGAACCGGTGGTGATCCGGAAGAAGCCT

121   CTGAACGCTGCCGCCAGGAAGGACGAGAAAGCTGTCAACGCTGCTCGTCGCAGCGGCGCC

181   GAGATCGAAACCCTTAGAAAATCTCATGCTGGGACAAACAAAGCTGCTTCTAGCAGCACC

241   TCTTTAAACACAAGGAAGCTTGATGAAGAAACGGAGAATCTTGCTCATGATCGAGTACCA

301   ACTGAGCTGAAGAAAAGTATCATGCAAGCTCGAATGGACAAGAAACTTACCCAGTCTCAA

361   CTTGCTCAGATGATCAATGAGAAACCTCAAATAATTCAAGAGTATGAATCTGGTAAAGCT

421   ATTCCAAATCAACAGATAATTGTCAAGTTGGAGAGGGCTCTTGGAGTGAAACTTCGAGGA

481   AAGAAATAATGAAACCATGGTGGACACAACAGAGGACAAAAATTGTTTGGAAGTCATCAT

541   GTTTGGAAGTCTTGTTATATAGTCTGTGTTGTGAAGGGTTGAAGAGGAGTTTGTCGTATG

601   GAACAACTTAGGTGTGTCTTGTTGCCCTGAAAAAATGAAACCTGTGTGCATTTCTAGTCA

661   TTTACTGTCTCATGAGTCCGTCTGCTTTATGAATTAACCCTATACTATTCAATAATGATG

721   TGGGGGTTGCTTCACAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA。

本发明首次构建了pCAMBIA2300-35S-VvMBF1过量表达载体，并通过 花序浸染法将其导入模式植物拟南芥。研究了该欧美杂交种葡萄巨峰抗旱基 因VvMBF1过量表达的转基因株系和野生对照在渗透胁迫，干旱胁迫和失 水处理条件下的生长情况。

通过申请人的研究表明，本发明的欧美杂交种葡萄巨峰抗旱基因 VvMBF1能明显提高拟南芥对于渗透胁迫，干旱胁迫和失水处理的耐受力。 此外，在干旱胁迫下，转基因株系中的电解质渗漏率（EL），丙二醛（MDA） 和活性氧（ROS）的积累明显低于野生对照，而脯氨酸（Proline）含量明显 高于野生对照。气孔研究表明，转基因株系对ABA处理比野生对照更敏感。 抗旱基因定量分析结果表明，转基因株系中依赖于ABA途径的抗旱基因 AtRD22和AtRD29B的表达量明显高于野生对照。以上结果表明欧美杂交种 葡萄巨峰抗旱基因VvMBF1在转基因拟南芥中的过量表达通过依赖于ABA 的抗旱途径提高了植株的抗旱能力。

附图说明

图1是甘露醇引起的渗透胁迫对野生对照（WT）和转基因株系 VvMBF1-7，VvMBF1-20和VvMBF1-21萌发的影响。其中，A图是拟南芥种 子在对照MS培养基和处理MS+300mM甘露醇（Mannitol）培养基上的萌 发情况。B图是对应A图的拟南芥种子萌发率的统计情况。

图2是野生对照和转基因株系VvMBF1-7，VvMBF1-20和VvMBF1-21 盆栽苗对干旱胁迫的反应。其中，A图是拟南芥植株在干旱前，干旱7天后 以及复水24小时后的生长情况。B图是对应A图的拟南芥植株复水后的存 活率的统计。

图3是野生对照和转基因株系VvMBF1-7，VvMBF1-20和VvMBF1-21 盆栽苗在失水处理后各生理指标的变化。其中，A图是拟南芥植株离体叶片 在50min内的失水情况。50min内，每隔10min称取一次鲜重，失水率由两 次时间的鲜重差与最初鲜重的比值计算。B图是甘露醇引起的渗透胁迫对拟 南芥体内ABA含量的测定。C图是失水处理50min时，拟南芥离体叶片的 电导率(EL)的测定。D图是失水处理50min时，拟南芥离体叶片的脯氨酸 （Proline）含量的测定。E图是失水处理50min时，拟南芥离体叶片的丙二 醛（MDA）含量的测定。F图是失水处理50min时，拟南芥离体叶片的活 性氧（ROS）积累的染色图。

图4是野生对照和转基因株系VvMBF1-7，VvMBF1-20和VvMBF1-21 在ABA处理后气孔关闭的情况。其中，A图是不同浓度下拟南芥植株气孔 的关闭情况。B图是对应A图的气孔开度（宽/长）的统计。

图5是干旱相关基因在野生对照和转基因株系VvMBF1-7，VvMBF1-20 和VvMBF1-21中的表达。在MS培养基上生长7天的幼苗转移至MS+300mM 甘露醇（Mannitol）培养基，采取培养7天后的幼苗，提RNA并反转录后 利用实时定量PCR技术测定胁迫基因表达量。

以下结合附图和实施例对本发明作进一步详细描述。

具体实施方式

基于已有的植物中MBF1功能的研究，申请人首次对葡萄MBF1基因 进行克隆并对其进行功能分析。在研究中，申请人发现在对巨峰葡萄进行干 旱胁迫以及外源ABA处理时，VvMBF1基因上调表达。由于ABA是植物响 应干旱途径中一种重要的信号物质，初步推测VvMBF1基因可能与ABA调 节的抗旱信号途径有关。

申请人利用RACE克隆技术，根据VvMBF1差异cDNA片段（登录号 FG.269343）的部分序列设计5’和3’基因特异性引物，采用反转录PCR （Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR），以巨峰葡萄叶 片总RNA反转录合成cDNA第一链为模板，首次扩增得到了欧美杂交种葡 萄巨峰抗旱基因VvMBF1，该基因序列全长767bp，包含完整开放阅读框序 列429bp，编码142个氨基酸。与其它植物中MBF1s的氨基酸序列比对和 进化树分析表明，VvMBF1属于植物组中的第Ⅰ组。

为了进一步研究欧美杂交种葡萄巨峰抗旱基因VvMBF1在植物中的抗 旱机制，申请人构建了pCAMBIA2300-35S-VvMBF1过量表达载体，将其在 野生拟南芥中过量表达。发现该欧美杂交种葡萄巨峰抗旱基因VvMBF1的 转基因拟南芥株系在渗透胁迫培养基上的种子萌发率显著高于野生对照。干 旱处理拟南芥盆栽苗复水后发现，欧美杂交种葡萄巨峰抗旱基因VvMBF1 的转基因拟南芥株系存活率显著高于野生对照。进一步研究发现，欧美杂交 种葡萄巨峰抗旱基因VvMBF1的转基因拟南芥株系离体叶片失水率明显低 于野生对照，且转基因株系离体叶片失水处理后的电解质渗漏率（EL）、丙 二醛（MDA）和活性氧（ROS）的积累都明显低于野生对照，而脯氨酸含 量则明显高于与野生对照。以上结果表明，欧美杂交种葡萄巨峰抗旱基因 VvMBF1的过量表达可能通过参与ROS的清除和渗透物质的合成过程来增 强植株的抗旱能力。但是，作为响应干旱途径主要的信号物质的ABA，干 旱处理后虽然其含量均增加，但转基因株系和野生对照间并没有明显差异， 表明欧美杂交种葡萄巨峰抗旱基因VvMBF1可能不参与干旱胁迫下植株体 内ABA的合成过程。

以下是欧美杂交种葡萄巨峰抗旱基因VvMBF1的全长序列以及验证其 抗旱功能的具体步骤。

A、利用RACE克隆技术，根据VvMBF1差异cDNA片段（登录号FG. 269343）的部分序列设计5’和3’基因特异性引物，采用反转录PCR（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR），以巨峰葡萄叶片总RNA 反转录合成cDNA第一链为模板，扩增得到了巨峰葡萄抗旱基因VvMBF1 序列，该基因序列如下：

 1    ACGCGGGGACCCTAACCCTAAAGAGCAACAGCTCCAAGGAAGAACAACAAAGCGATATCT

61    ATGGCAGGAGTCGGACCGTTGACGCAGGACTGGGAACCGGTGGTGATCCGGAAGAAGCCT

121   CTGAACGCTGCCGCCAGGAAGGACGAGAAAGCTGTCAACGCTGCTCGTCGCAGCGGCGCC

181   GAGATCGAAACCCTTAGAAAATCTCATGCTGGGACAAACAAAGCTGCTTCTAGCAGCACC

241   TCTTTAAACACAAGGAAGCTTGATGAAGAAACGGAGAATCTTGCTCATGATCGAGTACCA

301   ACTGAGCTGAAGAAAAGTATCATGCAAGCTCGAATGGACAAGAAACTTACCCAGTCTCAA

361   CTTGCTCAGATGATCAATGAGAAACCTCAAATAATTCAAGAGTATGAATCTGGTAAAGCT

421   ATTCCAAATCAACAGATAATTGTCAAGTTGGAGAGGGCTCTTGGAGTGAAACTTCGAGGA

481   AAGAAATAA TGAAACCATGGTGGACACAACAGAGGACAAAAATTGTTTGGAAGTCATCAT

541   GTTTGGAAGTCTTGTTATATAGTCTGTGTTGTGAAGGGTTGAAGAGGAGTTTGTCGTATG

601   GAACAACTTAGGTGTGTCTTGTTGCCCTGAAAAAATGAAACCTGTGTGCATTTCTAGTCA

661   TTTACTGTCTCATGAGTCCGTCTGCTTTATGAATTAACCCTATACTATTCAATAATGATG

721   TGGGGGTTGCTTCACAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA

B、将上述欧美杂交种葡萄巨峰抗旱基因VvMBF1序列的完整开放阅读 框插入CaMV35S启动子下游，构建了植株过量表达载体并将其通过农杆菌 介导的花序浸染法将其导入野生型拟南芥哥伦比亚Col。筛选获得了表现型 良好的三个VvMBF1转基因株系（VvMBF1-7、VvMBF1-20、VvMBF1-21）。

C、鉴定了欧美杂交种葡萄巨峰抗旱基因VvMBF1的转基因株系能明显 提高拟南芥对渗透胁迫、干旱胁迫和失水处理的耐受力。此外，在失水处理 条件下，转基因株系叶片的电解质渗漏率（EL）、丙二醛（MDA）和活性氧 （ROS）的积累都明显低于野生对照，而脯氨酸含量则明显高于与野生对照。 干旱处理后的转基因株系和野生对照植株体内的ABA含量均增加，但转基 因株系和野生对照间并没有明显差异。

D、观察了VvMBF1转基因株系和野生对照在不同浓度的ABA处理的条 件下，叶片气孔关闭的情况。发现相同浓度ABA处理下，转基因株系的闭 合程度明显大于野生对照。

E、为进一步在基因水平探究转基因株系抗旱的机制，申请人利用实时 定量PCR技术检测了干旱应答途径中几个关键基因的表达量。发现转基因株 系中依赖于ABA途径的抗旱基因AtRD22和AtRD29B的表达量明显高于野生 对照。

以上结果表明，欧美杂交种葡萄巨峰抗旱基因VvMBF1在拟南芥中的过 量表达提高了植株的抗旱能力，可能是通过依赖于ABA的途径。

以下是申请人给出的具体实施例。

实施例1：过量表达的转基因株系和野生对照在渗透胁迫下的萌发情况

三个转基因株系（VvMBF1-7、VvMBF1-20、VvMBF1-21）和野生对照 （WT）在MS培养基和含有300mM甘露醇的培养基上生长2周后，统计种子 的萌发率。结果发现，在MS培养基上，转基因株系和野生对照的萌芽率均 能达到100%，而在含有300mM甘露醇的培养基上，三个转基因株系的萌发 率均可以达到90%左右，而野生对照（WT）的萌发率只有37.45%（图1）， 明显低于转基因株系。

实施例2：欧美杂交种葡萄巨峰抗旱基因VvMBF1转基因拟南芥T3代幼苗 对干旱胁迫的抗性

为了进一步鉴定欧美杂交种葡萄巨峰抗旱基因VvMBF1的转基因株系 （VvMBF1-7、VvMBF1-20、VvMBF1-21）的抗旱能力，将生长10天的盆栽 转基因株系和野生对照的幼苗进行干旱胁迫处理。干旱第7天发现转基因株 系和野生对照出现明显的形态上的区别，具体表现在野生对照表现出了明显 的萎蔫枯死，而三个转基因株系虽然也表现出了失水症状，但比野生对照要 轻。复水24小时后，大部分转基因株系复活（三个转基因株系的存活率分 别达到77.25%、47.72%和84.14%），而野生对照几乎全部死亡（存活率仅 有8.47%）（图2）。

实施例3：欧美杂交种葡萄巨峰抗旱基因VvMBF1的转基因拟南芥在干旱 胁迫下各生理指标的变化

为了探究VvMBF1转基因株系（VvMBF1-7、VvMBF1-20、VvMBF1-21） 的抗旱机制，申请人测定了干旱胁迫下转基因株系和野生对照的各种生理指 标的变化。首先，测定了拟南芥植株离体叶片在50min内的失水情况。50min 内，转基因株系在每个时间点的失水率均低于野生对照。在50min时，转基 因株系（VvMBF1-7、VvMBF1-20、VvMBF1-21）的失水率分别为46.78%、 48.45%和45.83%，而野生对照失水率达到了53.43%（图3A），明显高于转 基因株系。此外，对失水50min的离体叶片进行了电解质渗漏率（EL）、脯 氨酸（Proline）、丙二醛（MDA）和活性氧（ROS）的含量测定。结果发现， 转基因株系（VvMBF1-7、VvMBF1-20、VvMBF1-21）的电解质渗漏率（EL） 分别为36.85%、32.15%和29.07%，野生对照达到了47.98%（图3C），显著 高于转基因株系。丙二醛含量测定结果发现，转基因株系（VvMBF1-7、 VvMBF1-20、VvMBF1-21）的MDA含量分别为13.38、13.18和14.79n mol /g，而野生对照达到了20.44n mol/g（图3E），显著高于转基因株系。活性 氧的可视性分析结果显示，氯化硝基四氮唑蓝液（NBT）和二氨基联苯胺 （DAB）（分别指示O2–和H2O2的含量）染色后的三个转基因株系都呈现较 浅的颜色，而野生对照染色较重（图3F），表明转基因株系活性氧的积累较 少。脯氨酸含量测定结果发现，转基因株系（VvMBF1-7、VvMBF1-20、 VvMBF1-21）的含量分别为4.54ug/g、4.79ug/g和5.21ug/g，而野生对照和 含量仅为2.53ug/g（图3D），显著低于转基因株系。这些结果说明，巨峰 葡萄抗旱基因VvMBF1的过量表达通过减少细胞膜的损害、清楚活性氧的 积累以及提高渗透物质这些过程增强了植株的抗旱能力。而甘露醇引起的渗 透胁迫对拟南芥体内ABA含量的测定结果显示，转基因和野生对照的含量 虽然均比对照处理的高，但转基因和野生对照之间无显著差异（图3B），表 明巨峰葡萄抗旱基因VvMBF1的过量表达不参与干旱条件下植株体内ABA 的合成过程。

实施例4：欧美杂交种葡萄巨峰抗旱基因VvMBF1的转基因株系拟南芥在 ABA处理下气孔开度的变化

信号物质ABA诱导的气孔关闭被认为是植物应答干旱胁迫最快速最直 接的响应之一。本研究也发现由甘露醇引起的渗透胁迫（模拟干旱胁迫）均 提高了转基因株系和野生对照植株体内ABA的含量，因此申请人进一步用 外源ABA处理转基因株系和野生对照，研究欧美杂交种葡萄巨峰抗旱基因 VvMBF1在ABA诱导的气孔反应中的作用。分别用1μM和5μM的外源ABA 处理转基因株系和野生对照的叶片下表皮，然后在显微镜下观察气孔的关闭 情况。结果显示，在相同浓度的外源ABA处理后的三个转基因株系的气孔 开度（宽/长）均比野生对照小（图4）。表明欧美杂交种葡萄巨峰抗旱基因 VvMBF1的过量表达可能通过参与气孔关闭来增强了植株的抗旱能力。

实施例5：干旱相关基因在野生对照和欧美杂交种葡萄巨峰抗旱基因 VvMBF1的转基因株系拟南芥中的表达

植物经历干旱胁迫时，ABA被普遍认为是一种干旱传递信号。一般干旱应 答基因能够快速而短暂地被ABA诱导，例如AtRD22和AtRD29B，但并不 是所有基因的表达都依赖于ABA，例如AtRD29A和AtERD1。这暗示了存 在着依赖于ABA和不依赖于ABA的抗旱调节途径。为进一步探究欧美杂 交种葡萄巨峰抗旱基因VvMBF1在分子水平的作用机制，通过实时定量PCR 检测了四个功能明确的干旱响应基因AtRD22、AtRD29B、AtRD29A和 AtERD1在转基因株系和野生对照中的表达量。其中AtRD22和AtRD29B是 依赖于ABA的干旱途径中的标记基因，而AtRD29A和AtERD1则是不依赖 于ABA的干旱途径中的标记基因。实时定量PCR结果表明，在转基因株系 中AtRD22和AtRD29B的表达量明显高于野生对照，而AtRD29A和AtERD1 的表达量在转基因株系和野生对照中则没有明显的变化（图5）。实时定量 PCR的结果表明，欧美杂交种葡萄巨峰抗旱基因VvMBF1的过量表达提高 了AtRD22和AtRD29B的表达量，可能通过参与依赖于ABA的干旱途径来 增强了植株的抗旱能力。