马铃薯X病毒弱毒株系的筛选及在交叉保护中的应用

摘要

本发明涉及植物病毒基因工程领域，提供了马铃薯X病毒（Potato virus X，PVX）弱毒株系的筛选以及在交叉保护中的应用。以PVX强毒株系的侵染性克隆为基础，通过定点突变技术在PVX的基因组中定点引入突变，获得了致病力显著降低的PVX弱毒株系E46A、N863A、N968A和E1001A。弱毒株系E1001A可有效保护植株免受PVX强毒株系的侵染。

说明书

技术领域

本发明涉及植物病毒基因工程领域，具体地，本发明涉及马铃薯X 病毒（Potato virus X,PVX）弱毒株系的筛选及其在交叉保护中的应用。

背景技术

病毒病是作物上的重要病害，给农业生产造成巨大损失。由于作物 病毒病种类多，传播途径复杂，生产上没有免疫或高抗病毒病的品种， 市场上又没有对病毒病特效的药剂，因而病毒病的防治非常困难。

交叉保护是指植株受弱毒株系侵染后，免受后继的病毒强毒株系侵 染的现象，已经在许多作物病毒病的防治中取得了成功。限制交叉保护 广泛应用的关键因素是可用的弱毒株系太少。

马铃薯X病毒（PVX）属于马铃薯X病毒属（Potexvirus），主要侵 染烟草、番茄、马铃薯等茄科作物，是这些作物上的主要病毒之一。PVX 与马铃薯Y病毒属病毒间有协生作用，一旦复合侵染会引起严重症状， 造成更大损失。

目前，关于PVX株系划分的研究较多，但是关于PVX弱毒株系中的研 究很少。本发明通过定点突变技术，获得了4个新的致病力显著降低的PVX 弱毒株系，攻毒实验证明，弱毒株系E1001A可以有效控制PVX强毒株系的 侵染。

发明内容

本发明提供了一种PVX弱毒株系的筛选及应用，以PVX的侵染性克 隆为基础，通过定点突变技术在PVX的基因中定点引入突变，明确了调 控PVX致病力的氨基酸位点，获得了致病力显著下降的PVX弱毒突变体。 通过测定弱毒株系对强毒株系的交叉保护效果，获得了能有效保护植株 免受PVX强毒株系侵染的弱毒株系。

本发明实施的具体技术方案是：

a.突变体的获得：以自主构建的马铃薯X病毒的侵染性克隆为基础， 针对其聚合酶第46位、863位、968位和1001位氨基酸设计突变引物， 利用QuickChange^TM定点突变试剂盒在这些位点引入突变。

b.弱毒株系的筛选：通过农杆菌浸润法将a中获得的突变体接种到寄 主植物本氏烟，观察这些突变体所致症状的变化，筛选致病力明显降低 的突变体。

c.交叉保护效果测定：在接种弱毒株系后10天和15天接种PVX强毒 株系，观察弱毒株系对强毒株系的交叉保护效果。

采用本发明所述的技术方案，可以获得如下的技术效果：

1）获得了4个致病力明显降低的PVX弱毒株系。

2）弱毒株系E1001A可有效保护植株免受PVX强毒株系的侵染。

附图说明

图1为PVX强毒株系和弱毒突变体接种后第6天的症状；

图2显示PVX强毒株系和弱毒突变体接种后10天在烟草中的积累水 平；

图3显示间隔期为10天时，不同弱毒株系在挑战接种后15天对烟 草植株的保护效果；

图4为不同处理的烟草植株内病毒的积累水平。

具体实施方式

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容做进一 步的详细说明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的 实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

本发明所提供的实施例，均按照常规实验条件，其中所采用的引物 序列如下表：

编号 序列（5'-3'） Seq ID Number 46F TCAAACGGTTGCCGCGGCTAATGATCTAGAGGGGTTCGGCATAGC Seq ID No.1 46R ATTAGCCGCGGCAACCGTTTGAGCGTACGGGTTAGATAGTTTGTGTTTTTC Seq ID No.2 863F CGATACTATCTCGCCGCCACACACCGCAACAAGAAAGACCTTGC Seq ID No.3 863R TGTGTGGCGGCGAGATAGTATCGGCAGTATTTTGAGAAGTACTCTGTCGC Seq ID No.4 968F CACAAGTGCAGCGTCTTCGGCCTTCTGGGAAAAGTTAGACAGCACCC Seq ID No.5 968R GCCGAAGACGCTGCACTTGTGTTCACGAAGTGAATCCTGTCGGT Seq ID No.6 1001F AGCCGGCAGCCGTAGAGCCAATTCGAGAGCCTGAGCCC Seq ID No.7 1001R GCTCTACGGCTGCCGGCTCGTACTCCTTGAGTGCTTGTTCTCTC Seq ID No.8

F代表正向引物，R代表反向引物。利用表中引物可以分别将RdRp第46位的E、 第863位的N、第968位的N和第1001位的E突变为A。加粗的字母代表突变的核苷酸。

实施例1：定点突变

以马铃薯X病毒侵染性克隆pCaPVX100为模板，利用PCR对四个 位点分别进行突变，所用聚合酶为Phusion高保真聚合酶(Finnzymes)。

PCR反应体系如下：

反应结束，在PCR产物中加入0.5μL DpnI（20U/μL），37℃处理2h， 加入125μL无水乙醇和5μL3mol/L的醋酸钠(pH=5.2)混匀，-20℃沉淀 过夜。13000r/min离心10min，弃上清，沉淀用1mL75%乙醇洗涤后 置于室温自然干燥，加入10μL ddH₂O水回溶，转化大肠杆菌DH5α，突 变质粒经测序验证。

实施例2：病毒接种

将pCaPVX100或突变质粒转化农杆菌GV3101。经菌落PCR验证 后，挑单斑接种于含有卡那霉素（50μg/mL）、利福霉素（50μg/mL）、 四环素（50μg/mL）的液体LB培养基中。取500μL菌液加至5mL含 10mmol/L2-（N-吗啉）-乙基磺酸（MES）和20μmol/L乙酰丁香酮（AS） 及上述三种抗生素的LB培养基中，28℃振荡培养至对数生长期。离心 收集菌体并重新悬浮于10mmol/L MgCl₂，10mmol/L MES，150μmol/L AS中，调整浓度使其OD₆₀₀为0.5左右，室温静置3小时。取5mL一 次性注射器，去掉针头吸取农杆菌菌液，从本氏烟（5－6周龄或4－6 片真叶）叶片背面浸润。每株浸润2片叶。浸润的植株置于23℃光照培 养箱中培养（16小时光照/8小时黑暗交替）。

实施例3：症状观察及病毒浓度检测

观察接种植物的症状，用Western blot检测病毒积累情况。在接种后 第6天，pCaPVX100在本氏烟（Nicotiana benthamiana）系统叶上引起 明显的花叶和皱缩等症状，而复制酶RdRp第46位的E、第863位的N、 第968位的N和第1001位的E分别突变为A的四个突变体在本氏烟上 几乎不表现症状（图1）。接种后15天，pCaPVX100在本氏烟上引起严 重花叶，四个突变体仍不表现症状。发明人将这些弱毒突变体分别命名 为E46A、N863A、N968A、E1001A(其中，E1001A RdRp的核苷酸序列 见Seq ID No.9，氨基酸序列见Seq ID No.10)。Western blot检测表明， 野生型病毒（WT）pCaPVX100在接种10天时就在本氏烟中积累到很高 的浓度，突变体E1001A的积累量明显低于野生型病毒，E46A和N968A 的积累量更低，N863A的积累量最低（图2）。

实施例4：交叉保护效果测定

选取5周左右的本氏烟，接种弱毒突变体E46A、N863A、N968A、 E1001A（保护接种）。保护接种后10天和15天接种强毒株系。每个处 理接种3棵本氏烟，重复3次。

在接种强毒株系后的第15天调查发病情况，发现只接种强毒株系的 本氏烟植株表现严重的花叶症状，发病率为100％；间隔期为10天时， E46A、N863A和N968A三个弱毒株系没有保护效果，E1001A的保护效 果为100％（图3）；间隔期为15天时，E46A对强毒株系的保护效果为 44.4％，E1001A的保护效果为100％。

Western blot检测结果表明，间隔期为10天的处理中，先接种E1001A 再接种强毒株系的本氏烟植株内病毒粒子的浓度明显低于只接种强毒株 系的植株，而先接种E46A、N863A、N968A三个弱毒株系的植株内病 毒粒子的浓度与只接种强毒株系的植株差异不显著（图4）。

以上结果表明，弱毒株系E1001A对强毒株系的交叉保护效果最好， 可有效保护植物免受PVX强毒株系的侵染。