抗氧化及营养胁迫相关蛋白及其编码基因与应用

摘要

本发明公开了一种抗氧化及营养胁迫相关蛋白及其编码基因与应用。本发明蛋白，选自如下（a）或（b）：（a）由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；（b）将序列表中序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与抗氧化及营养胁迫相关的由（a）衍生的蛋白质。通过实验表明，在野生型衣藻中过表达本发明的蛋白时，转基因藻株对过氧化氢处理的抗氧化性增强，当干扰本发明蛋白表达的载体转入野生型得到的HOS表达量减少的突变株，对过氧化氢处理的抗氧化性减弱。并且，HOS过表达突变株在缺硫产氢体系中的放氢量比野生型也大大增多。

说明书

技术领域

本发明涉及一种来源于藻类的抗氧化及营养胁迫相关蛋白及其编码基因与应用。

背景技术

氧化胁迫和营养亏缺（如缺硫）是光合生物频繁遭遇的两大逆境，严重限制包括 藻类在内光合生物的光合生产力。有研究表明这些逆境造成伤害的主要原因可能是细 胞内包括过氧化氢在内的活性氧浓度增高，引起脂类、蛋白和核酸等生物大分子结构 改变，破坏细胞氧化还原平衡状态，导致光合生产力下降乃至细胞死亡。因此，发掘 重要的抗氧化及营养亏缺新基因，可以为光合生产力的提高提供可利用基因元件与技 术支撑。

莱茵衣藻是古老的单细胞真核绿藻，广泛用于光合作用机理研究与应用的重要模 式藻种。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种抗氧化及营养胁迫相关蛋白及其编码基因。

本发明所提供的抗氧化及营养胁迫相关蛋白，来源于莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)，名称为HOS，为如下（a）或（b）所示的蛋白：

（a）由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

（b）将序列表中序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺 失和/或添加且与抗氧化及营养胁迫相关的由（a）衍生的蛋白质。

序列表中序列2所示的氨基酸由206个氨基酸残基组成。

为了使（a）中的蛋白便于纯化，可在由序列表中序列2所示的氨基酸序列 组成的蛋白质的N端或C端连接上如表1所示的标签。

表1.标签的序列

标签 残基 序列 Poly-Arg 5-6（通常为5个） RRRRR Poly-His 2-10(通常为6个) HHHHHH FLAG 8 DYKDDDDK Strep-tag II 8 WSHPQFEK c-myc 10 EQKLISEEDL

上述（a）或（b）中的蛋白可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表 达得到。上述（b）中的蛋白的编码基因可通过将序列表中序列1的自5′端第1至621 位碱基所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个 碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

上述蛋白的氨基酸序列中一个或几个氨基酸残基的取代、替换和/或添加，有的是 由于自然发生的多态变异引起的，例如由获得蛋白质的生物的物种、个体等的差异导 致；有的是由定点诱变、随机诱变等人工诱变处理引起。

本发明所提供的编码基因为如下1）、2）或3））的基因：

1）其核苷酸序列是序列表中序列1所示的DNA分子；

2）在严格条件下与1）限定的DNA序列杂交且编码所述抗逆相关蛋白的DNA分子；

3）与1）限定的DNA序列有95%以上相似性且编码所述抗逆相关蛋白的DNA分子。

上述严格条件是，在6×SSC，0.5%SDS的溶液中，在65°C下杂交，然后用2×SSC， 0.1%SDS和1×SSC，0.1%SDS各洗膜一次。

序列表中序列1由621个脱氧核糖核苷酸组成，该基因的开放阅读框为621bp（序 列表中序列1的自5′端第1-621位核苷酸），编码206个氨基酸（序列表中序列2所 示）。

含有上述任一所述编码基因的重组表达载体、重组菌、转基因细胞系或表达盒也 属于本发明的保护范围。

可用现有的植物表达载体构建含有本发明基因的重组表达载体。

本发明的另一个目的是提供上述抗氧化及营养胁迫相关蛋白及其编码基因的应 用。所述应用是上述蛋白或其编码基因在培育抗氧化和/或抗营养胁迫的能力提高的转 基因生物中的应用。其中，抗氧化是过氧化氢的抗性；抗营养胁迫是对缺硫的营养环 境的适应能力，即抗硫素亏缺胁迫，具体是，在缺硫的营养条件下的放氢能力。所述 转基因生物为以真核生物或原核生物为材料，获得的转基因生物。真核生物中，优选 以原生生物为材料，最优选为绿藻门生物，特别优选衣藻属生物，具体可为莱茵衣藻。

本发明所提供的培育抗氧化和/或抗营养胁迫的能力提高的转基因生物的方法，是 将上述的编码基因导入目的生物中，培育得到抗氧化和/或抗营养胁迫的能力提高的转 基因生物。

可以采用常规方法将所述编码基因导入目的生物中，例如基因枪法，高压电穿孔 法，脂质体法，glass beads法转化、菌转化或转染等。本发明中的具体操作是，先 将基因导入载体中，得到重组表达载体，再将重组表达载体导入农杆菌中，得到含有 本发明基因的重组农杆菌，再通过农杆菌将基因导入目的生物中。

其中，抗氧化是过氧化氢的抗性；抗营养胁迫是对缺硫的营养环境的适应能力， 具体是，在缺硫的营养条件下的放氢能力。所述目的生物为以真核生物或者原核生物。 优选为原生生物，真核生物中最优选为绿藻门生物，特别优选衣藻属生物，具体可为 莱茵衣藻。

本发明从莱茵衣藻中克隆得到了具有抗氧化及硫素亏缺胁迫的莱茵衣藻蛋白及其 编码基因。生物信息学预测，莱茵衣藻基因HOS可能具有氧化修复酶功能。通过实验 表明，在野生型衣藻中过表达本发明的蛋白时，转基因藻株对过氧化氢处理的抗氧化 性增强，当干扰本发明蛋白表达的载体转入野生型得到的HOS表达量减少的突变株， 对过氧化氢处理的抗氧化性减弱。并且，HOS过表达突变株在缺硫产氢体系中的放氢 量比野生型也大大增多。因此，可以证明，本发明的HOS蛋白具有抗氧化及抗营养胁 迫的功能，其编码基因转入生物（特别是衣藻）中可以提高生物体的抗氧化及抗营养 胁迫的功能。

附图说明

图1为HOS过表达藻株抗氧化表型的鉴定。

图2为HOS人工干扰藻株抗氧化表型的鉴定。

图3为HOS基因过表达的藻株（OE5、OE8），在缺硫产氢体系中的放氢量检测结 果。

具体实施方式

下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。

下述实施例中的百分含量，如无特别说明，均为质量百分含量

下述实施例中所使用的材料如下所述：

1)植物材料：莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)藻种CC400（mt-），从美 国杜克大学(Chlamy center，http://www.chlamy.org/)购买。HOS过表达藻株及人工 干扰藻株藻株均由本实验室采用glass beads法转化获得。

2)菌株和质粒：pJR38、pChlamiRNA3质粒购自杜克大学莱茵衣藻中心(Chlamy center，http://www.chlamy.org/)，两质粒中均含有巴龙霉素抗性基因。

3)正常TAP培养液：NH₄Cl 0.4g/L；MgSO₄·7H₂O 0.1g/L；CaC1₂·2H₂O 0.05g/L； K₂HPO₄ 0.108g/L；KH₂PO₄ 0.056g/L；Trisbase 2.423g/L；亨特微量元素(Hunter’s trace elements)1ml/L，冰乙酸1ml/L，其余为水。

4)）固体TAP培养基：在正常TAP培养液中加1.5%的琼脂粉。

5）亨特微量元素(Hunter’s trace elements):H₃BO₄11.4g/L，ZnSO₄·7H₂O 22.0 g/L，MnCl₂·4H₂O 5.06g/L，CoCl₂·6H₂O 1.61g/L，CuSO₄·5H₂O 1.57g/L (NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O 1.10g/L，FeSO₄·7H₂O 4.99g/L，其余为水。

下述实施例中莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)藻种CC400（mt-）、HOS 过表达藻株及amiRNA藻株的培养方法：用TAP固体培养基培养莱茵衣藻 (Chlamydomonas reinhardtii)藻种CC400（mt-）、HOS过表达藻株及amiRNA藻株： 配制正常TAP培养液，121℃高压灭菌20分钟，待培养液温度降到室温后，用接种针 从固体培养基上挑取莱茵衣藻单克隆到正常TAP培养液中，置于恒温光照培养箱中的 摇床上连续光照培养（25℃，60rpm，100μEs^-1m^-2），悬浮培养细胞。固体培养时，将 单克隆转到TAP固体培养基上划线培养。

实施例1、抗氧化及营养胁迫相关蛋白及其编码基因的获得

一、来源于藻类的抗氧化及营养胁迫相关蛋白（HOS）及其编码基因的获得

1、莱茵衣藻总RNA提取：

参照天根生化科技（北京）有限公司植物总RNA提取试剂盒使用说明提取莱茵 衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)藻种CC400（mt-）总RNA。取指数生长期细胞（4-6 X10⁶细胞/毫升），5000rpm离心5min后，加入1mL裂解液RZ，振荡混匀。室温放 置5min后，4℃，12000rpm离心5min，取上清，转入新的无RNase的离心管中。加 200μL氯仿，盖好管盖，剧烈振荡15s，室温放置3min。4℃，12000rpm离心10min。 把上层水相转移到新的无RNase的离心管中，缓慢加入0.5倍体积的无水乙醇，混匀。 将得到的溶液和沉淀全部转入吸附柱中。4℃，12000rpm离心30s，弃离心管中废液， 加500μL去蛋白液，4℃，12000rpm离心30s，弃废液。加700μL漂洗液，室温静 置2min，4℃，12000rpm离心30s，弃废液。再加500μL漂洗液，室温静置2min，4℃， 12000rpm离心30s，弃废液。4℃，12000rpm离心2min，去除残余液体，开盖晾干。 将吸附柱转入一个新的无RNase的离心管中，加50μL RNase-free dd-H₂O，室温放置 2min，4℃，12000rpm离心2min。

2、cDNA第一链合成：

以总RNA为模板，使用全式金（北京）有限公司cDNA第一链合成试剂盒合成 cDNA第一链。20μL反应体系：2μL 10x TSII mix，1ul 10μmol OligodT20，1-5μg 总RNA，补灭菌双蒸水至20μL。50℃温浴30min。70℃加热15min终止反应。

3、HOS基因开放读码框序列的扩增：

以合成cDNA第一链为模板进行PCR反应，反应程序：98℃预变性2min，98℃ 变性10s，60℃退火15s，72℃延伸1min，35个循环，72℃延伸5min。反应体系：2×HS GC buffer I 12.5μL，dNTP mixture（各2.5mM）2μL，模板cDNA 1μL，PRIMERSTAR （5U/μL）0.5μL，F/R各1μL，补ddH₂O至25μL。以上引物均在生工生物工程股 份有限公司合成，引物序列见下表2。

表2.PCR扩增所用引物序列

引物名称 引物序列（5’→3’） F CATATGCGGAGCATGTTTGGAAGCCGT R GAATTCTCACGCCCCCGGCGCCGGCTCG

4、PCR产物克隆及测序：

用Tiangen（Beijing，China）琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（DP209-03）回收纯 化目的条带，与pEasy-blunt simple vector（购自北京全式金公司）连接，转化大肠杆 菌（Escherichia coli）Trans-T1感受态细胞（购自北京全式金公司），用蓝白斑方法筛 选阳性克隆。挑取单克隆培养，用M13F和M13R组成的引物对进行PCR鉴定，将阳 性克隆送至北京三博生物技术有限责任公司测序。测序得到的HOS基因包含一个长度 为621bp完整开放读码框，序列如序列表中序列1所示，将该基因命名为HOS，该基 因编码如序列表中序列2所示的蛋白质。将上述获得的测序表明正确的含有HOS基因 的重组载体命名为pEasy-HOS。用ClustalW2 (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/)进行相似性分析发现莱茵衣藻HOS 基因同其他已知的MSRB（蛋氨酸亚砜还原酶）基因有比较高的相似性，与已知的鱼腥 藻Alr3901同源性最高，相似度为44%。

莱茵衣藻HOS基因共编码206个氨基酸，序列如序列表中序列2所示，大约23kD。 氨基酸序列通过ClustalW2(http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/)进行相似性分析， 发现该酶的氨基酸序列同已知鱼腥藻（Anabaena sp.PCC 7120）的序列最为相似，序 列相似度为44%。

二、转HOS基因藻株表型分析：

1、过表达及amiRNA载体构建：

1）过表达载体构建：

提取质粒pEasy-HOS，用NdeI和EcoRI（购自Takara公司）酶切质粒及pJR38载 体，37℃酶切3小时后，用Tiangen（Beijing，China）琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒 （DP209-03）回收纯化目的条带和pJR38载体，将纯化后的目的条带与载体用T4DNA 连接酶25℃连接3小时，转化大肠杆菌（Escherichia coli）Trans-T1感受态细胞（购 自北京全式金公司），挑取单克隆，用上述引物F和R（表2）进行PCR扩增，以获 取阳性克隆，并将其送至北京三博生物技术有限责任公司测序。将测序正确的含有 HOS基因的克隆提取质粒（购自北京索莱宝公司），获得pJR38-HOSOE质粒。

2）amiRNA载体构建：

用artificial microRNA在线设计软件WMD3(http://wmd3.weigelworld.org)设计 HOS人工干扰寡核苷酸引物，并在生工生物技术有限责任公司（上海）合成，合成的 引物退火形成双链。pChlamiRNA3载体用SpeI 37℃酶切3小时后，用Tiangen（Beijing， China）琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（DP209-03）回收纯化目的条带。将纯化后的酶 切载体与寡核苷酸双链用T4DNA连接酶（购自北京全式金公司）16℃连接过夜，转 化大肠杆菌Trans-T1感受态细胞（购自北京全式金公司），挑取单克隆，用 pChlamiRNA3载体特异引物PCR扩增，将阳性克隆送去北京三博生物技术有限责任 公司测序。将测序正确的克隆提取质粒（购自北京索莱宝公司），获得 pChlamiRNA3-HOSKD质粒。HOS人工干扰寡核苷酸引物为：

5′-ctagTTAGGACTACAGCATCAACTTAtctcgctgatcggcaccatgggggtggtggtgatcagcg ctaTAAGATGATGCTGTAGTCCTAg-3’和

5’-ctagcTAGGACTACAGCATCATCTTAtagcgctgatcaccaccacccccatggtgccgatcagcga gaTAAGTTGATGCTGTAGTCCTAa-3′

2、HOS过表达及人工干扰藻株的获得

将获得的pJR38-HOSOE和pChlamiRNA3-HOSKD质粒采用随机插入方法 (High-frequency nucldar transformation of Chlamydomonas reinhardtii，Kindle KL，Proc.Natl.Acad.Sci.ESA，Vol.87，pp.1228-1232,February 1990）分别转 化莱茵衣藻CC400(mt-)，并在含有巴龙霉素的TAP培养基中进行筛选，得到若干抗巴 龙霉素的突变株。其中，转pJR38-HOSOE突变株是HOS过表达藻株；转 pChlamiRNA3-HOSKD突变株是人工干扰藻株。

3、HOS过表达及人工干扰藻株的筛选

采用western blot的方法对步骤2获得的若干抗巴龙霉素的突变株进行筛选，分 别筛选HOS蛋白含量升高（HOS过表达藻株，转pJR38-HOSOE突变株）和减少（人工 干扰藻株，转pChlamiRNA3-HOSKD突变株）藻株，并选取其中三个藻株作为进一步实 验的材料。western blot中所用的HOS抗体是HOS专一性抗体，由日本MBL(MBL； Nagoya,Japan)公司采用多肽合成后免疫兔子获得。采用的多肽序列为： NH₂-ATERRWTSPYNFEKREGC-COOH。western blot结果如图1和图2所示。图1和图2 中，HOS表示在野生型及转基因材料中检测到的HOS蛋白含量，coomassie表示考 马斯亮蓝染色的SDS-PAGE胶，用以不同材料表示上样量的一致，图中所示条带为 Western blot条带。

4、HOS过表达及人工干扰藻株表型的鉴定

在进行过氧化氢处理时，先将转pJR38-HOSOE突变株或转pChlamiRNA3-HOSKD突 变株衣藻从固体TAP培养基平板上划起，接种到50ml三角瓶中培养至指数生长期后， 转移到装有100ml正常TAP培养液的250ml三角瓶中，并调节初始OD750为0.05。取 10.30ul 30%的H₂O₂加入其中使其终浓度达到1mM，后将其置于恒温光照培养箱中的摇 床上连续光照培养，待48小时后测定OD750数值并照相。以野生型莱茵衣藻CC400 （mt-）为对照。

从图1可以看出，用1mM过氧化氢处理藻株48小时后，HOS基因过表达的藻株（转 pJR38-HOSOE突变株系OE5、OE8、OE23）较野生型（莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)藻种CC400（mt-），Wt）相比，生长速率提高了15-35%,说明HOS过表 达可使藻株对过氧化氢抗性更强，该基因在抗过氧化方面有一定的功能。

从图2可以看出，用1mM过氧化氢处理藻株48小时后，HOS人工干扰藻株（KD20、 KD33、KD45）与野生型（莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)藻种CC400（mt-）， Wt）相比，生长速率降低至野生型的16-39%,说明HOS人工干扰藻株中HOS表达量降 低使其对过氧化氢抗性减弱，进一步证明该基因在抗过氧化方面的功能。

5、HOS过表达藻株放氢量测定

1）液体培养：将HOS过表达藻株（转pJR38-HOSOE突变株）接到盛150ml正常 TAP培养液的三角瓶中，当OD750值达到1.0-1.5时，再将其转到已加入磁转子的500ml 培养液中。

2）待OD750值达到1.5左右时，25℃，2500rpm，离心5分钟。

3）倒掉上清，用缺硫TAP培养液（缺硫TAP培养液（g/L）：将正常培养液中的 硫化物以等摩尔换成相应的氯化物）漂洗细胞两次。

4）将漂洗过的细胞用20ml左右缺硫TAP培养液重悬细胞。

5）取20μl悬浮细胞，加入980μl缺硫TAP培养液，再加入4ml丙酮，混匀， 5000rpm，5分钟。

6）取离心后的上清，测定663nm和645nm处的吸光值，根据下面的公式计算总 叶绿素含量：

Chl（a+b）=8.02×OD663+20.21×OD645

7）采用Schott培养瓶做放氢瓶，培养体系为100ml，计算最终叶绿素浓度达到 20μg/ml所需的4）步骤中的细胞原液体积，加入细胞，用缺硫TAP培养液补足到 100ml。

8）用石蜡封住瓶口，以防止气体外漏。

9）将培养瓶置于25℃，200μEs-1m-2培养箱中的磁力搅拌器上连续光照培养， 分别取不同的时间点测定放氢量。采用SHIMADZU GC-2014气相色谱测定氢气含量，载 气为氮气。测定时用1ml注射器吸取放氢瓶气体部分500μl，注入进样孔，甲烷外标 法计算气体体积。

上述方法以野生型莱茵衣藻CC400（mt-）为对照。

结果如图3所示，从图3可以看出，HOS基因过表达的藻株（OE5、OE8），在缺 硫产氢体系中，放氢量均高于野生型（Wt），说明HOS在应对营养亏缺时有重要功能， 可作为提高衣藻光合产氢的靶基因。