一种环状芽孢杆菌在酱香型白酒生产中的应用

摘要

本发明属于生物工程技术领域，特别涉及一种环状芽孢杆菌在酱香型白酒生产中的应用。该应用是在酱香型白酒生产工艺不变的条件下再使用环状芽孢杆菌HG12菌株，其特征为，将环状芽孢杆菌HG12菌株接种到液体种子培养基中，培养制得活化后的液体种子；将液体种子接种到液体培养基或固体培养基中，制得菌株液体培养物或固体培养物；将菌株液体或固体培养物接种到酱香型白酒蒸酒后的固体料醅中，入池发酵，制得发酵酒醅，将酒醅蒸馏，制得酱香型白酒酒液。本发明针对酱香型白酒生产中存在的主要问题，提供了一株产酱香功能菌环状芽孢杆菌HG12菌株在酱香型白酒中的应用方法，对提升酱香型白酒企业的技术水平与竞争力具有明显的应用价值。

说明书

（一）        技术领域

    本发明属于生物工程技术领域，特别涉及一种环状芽孢杆菌在酱香型白酒生产中的应用。

（二）        背景技术

酱香型白酒生产历史悠久，是我国重要的白酒类型之一，具有“酱香突出、香气幽雅、酒体丰满、醇厚柔和、回味悠长、空杯留香持久”的特殊风格。酱香型白酒的特殊风格来自于其独特的酿造工艺，并且在酿造过程中参与发酵的微生物种类多、数量大，通过微生物群体的生化作用和相互协调，形成了酱香型白酒独特的风味成分。

目前酱香型白酒生产中存在的主要问题有：对产生酱香型白酒风味物质所必须的微生物种类尚不清楚，并且对微生物在风味物质产生过程中产生何种酶及其具体作用等方面也不了解；酱香型白酒的酿造缺少特有的酿造科学理论与技术体系；酱香型白酒的生产由于受当地环境、气候、水质、原辅料以及工艺操作的影响，所产白酒的风格和质量不稳定、优质品率低等问题。

研究表明酱香型白酒风味物质的产生以及酱香型白酒风格的形成，主要是酿造酱香型白酒用的高温大曲中的产香功能菌所代谢的生物酶起的催化作用。高温大曲是以小麦为原料制成的，在制曲过程中通过网罗自然环境中的微生物接种和生长繁殖，因此大曲中含有许多种类的微生物。高温大曲在酱香型白酒生产过程中的主要作用是生香，这是大曲中微生物功能的体现，对赋予酱香型白酒风味的典型性具有重要贡献。因此，从产香微生物的角度分析酱香型白酒的主要风味物质及其形成机制是非常必要的。

科研人员在酱香型白酒风味物质产生菌方面已经做了一些研究，如杨涛（酿酒科技，2011年第4期）进行微生物技术在酱香型白酒生产中的应用研究时，从酱香型白酒高温大曲中分离得到5株嗜热芽孢杆菌，并将它们应用于酱香型白酒生产中，所生产的酱香型白酒品质优良，酱香风格典型；如中国专利文献CN 102268397 A（申请号201110208832.9）公开了酱香特征香高效产生菌株及其在中国白酒酿造中的应用，该发明利用从中国白酒高温大曲中选育的3株地衣芽孢杆菌单独或混合应用于酱香型白酒生产工艺中，生产的白酒品质得到提高，酒的特征香更突出且更持久。

上述研究表明，从高温大曲中分离得到产香微生物，经过培养再应用到酱香型白酒生产过程中，可以提高白酒中风味物质的含量，使酒的质量得以提高。虽然一株或几株产香微生物应用于酱香型白酒生产过程中不能产生酱香型白酒的所有风味物质，但对于提高其质量却有重要作用。在实际生产中，由于不同地区自然条件及企业制曲工艺的差别，酱香型白酒风味物质产生菌的种类和数量也会有差别。

据报道高温大曲中的产香微生物主要是芽孢杆菌（如地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌等），目前对地衣芽孢杆菌（如中国专利文献CN 103131615 A）、枯草芽孢杆菌（如中国专利文献CN 102703358 A）等在酱香型白酒生产中的应用有一定研究，但对从高温大曲中分离的产酱香环状芽孢杆菌及其在酱香型白酒生产中的应用研究较少。

近几年来，酱香型白酒得到了快速发展，其市场份额逐步提高，酱香型白酒的未来发展必须不断地对其传统工艺技术进行升级改造，充分开发酱香型高温大曲中的产香微生物的种类和功能，并将其应用于酒的生产，形成有效的应用工艺，提升酒的酿造技术水平，使酱香型白酒的特殊风格得到保持和进一步发挥。因此，产香功能微生物的应用对有效提高酱香型白酒生产的稳定性和酒的品质，实现酱香型白酒的酿造技术水平与竞争力的提升具有重要的作用。

（三）        发明内容

    本发明为了弥补现有技术的不足，提供了一种提高风味物质含量、经济效益高的环状芽孢杆菌在酱香型白酒生产中的应用。

本发明是通过如下技术方案实现的：

一种环状芽孢杆菌在酱香型白酒生产中的应用，以菌种保藏编号为CGMCC No.8044的环状芽孢杆菌（Bacillus circulans）HG12菌株为生产菌种，包括如下步骤：

（1）从试管斜面上挑取1-2环环状芽孢杆菌HG12菌株接种到液体种子培养基中，在35-40℃、120-160r/min条件下，培养12-16h，制得活化后的液体种子；

（2）将液体种子接种到液体培养基或固体培养基中，进行液体或固体培养，制得菌株液体培养物或固体培养物；

（3）将菌株液体或固体培养物接种到酱香型白酒蒸酒后的固体料醅中，按酱香型白酒生产工艺操作，入池发酵，制得发酵酒醅，将酒醅蒸馏，制得酱香型白酒酒液。

发明涉及的环状芽孢杆菌（Bacillus circulans）HG12菌株，来源于中国白酒厂生产酱香型白酒用的高温大曲，已于2013年8月19日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，菌种保藏编号为CGMCC No.8044。

本发明的环状芽孢杆菌（Bacillus circulans）HG12菌株的微生物学特征是：菌落呈乳白色、有褶皱、无光泽、表面不光滑；菌体呈杆状、直或接近直、单个或成链状，细胞大小约为（0.6-1.0）μm×（1.8-3.8）μm，产芽孢、孢囊膨大、芽孢椭圆形、芽孢中生到端生；革兰氏阳性、兼性厌氧、有机化能异养菌，利用葡萄糖、木糖、甘露醇、阿拉伯糖产酸，V-P反应阴性，接触酶阳性，硝酸盐还原阳性，可水解酪蛋白、明胶和淀粉，不利用柠檬酸盐、丙酸盐，在培养温度为55℃下生长；可发酵小麦麸皮、小麦、大麦、高粱的一种或几种组合制成的液体培养基和固态培养基，产生明显的酱香香气。

本发明的更优方案为：

步骤（2）中，将液体种子按体积比为2-5%的接种量接种到液体培养基中，于40-50℃、150-200r/min下，培养16-24h，制得菌株液体培养物。

步骤（2）中，将液体种子按体积比1-3%的接种量接种到固体培养基中，于40-50℃下，培养3-5d，制得菌株固体培养物。

步骤（1）中，液体种子培养基的组分为：葡萄糖10.0g/L，蛋白胨10.0g/L，牛肉膏10.0g/L，NaCl 5.0g/L，pH 7.0，蒸馏水定容。

步骤（3）中，菌株液体培养物的的接种量为1-10%的体积/重量比，菌株固体培养物的接种量为1-10%的重量比。

步骤（2）中，液体培养基的制备过程为：原料200g，加水800-1000mL，混合均匀，于100℃下、蒸煮10-20min，调pH值为6.0-6.5，121℃下、灭菌30min。

步骤（2）中，，固体培养基的制备为：原料200g，加水100-160mL，浸润10-20h，于100℃下、蒸煮20-30min，装瓶，于121℃下、灭菌30min。

步骤（2）中，液体培养基和固体培养基的原料为小麦麸皮、小麦、大麦和高粱中的一种或几种，原料经粉碎预处理，粉碎力度为1.0-2.0mm。

步骤（3）中，酱香型白酒生产工艺是白酒行业人员熟知的工艺，在酱香型白酒生产工艺（如入池温度、用曲量、发酵时间等）不变的条件下，再接种HG12菌株进行白酒生产。

本发明的方法是利用环状芽孢杆菌（Bacillus circulans）HG12菌株提高酱香型白酒中风味物质的含量，从而提高白酒质量、取得较好的经济效益。

本发明使用的环状芽孢杆菌（Bacillus circulans）HG12菌株来源于生产酱香型白酒的高温大曲并经过紫外线诱变选育获得；HG12菌株含有高活性阿魏酸脱羧酶，能将酿酒原料（如小麦、小麦麸皮、大麦等）中的阿魏酸转化成4-乙烯基愈创木酚，在白酒发酵过程中4-乙烯基愈创木酚在酵母菌（如酒香酵母）产生的乙烯基愈创木酚还原酶的作用下分解生成4-乙基愈创木酚，4-乙基愈创木酚是酱香型白酒的重要风味物质，对酱香型白酒的质量起着重要作用，酒液中含有4-乙基愈创木酚会使酒的酱香风味更突出和持久；HG12菌株能耐受55℃的高温，能分泌淀粉酶、蛋白酶等，可利用原料中的营养成分产生一系列代谢产物，将其应用于酱香型白酒生产中，能提高白酒中的酯、酸等风味物质的浓度，使生产的白酒品质得以提高。

本发明针对酱香型白酒生产中存在的主要问题，提供了一株产酱香功能菌环状芽孢杆菌HG12菌株在酱香型白酒中的应用方法，对提升酱香型白酒企业的技术水平与竞争力具有明显的应用价值。

（四）        具体实施方式

    下面结合实施例对本发明的技术方案进行具体描述或作进一步说明，目的在于更好地理解本发明的方法，但本发明的保护范围不限于以下的实施例。

本发明中4-乙基愈创木酚含量的测定步骤如下：

精密称取4-乙基愈创木酚标准品25mg，用1%冰乙酸溶解并定容到25mL，制得浓度为1mg/mL的标准母液。用1%冰乙酸将标准母液稀释，制得4-乙基愈创木酚质量体积浓度依次为0.02、0.2、1.0、2.0、4.0μg/mL的标准溶液。将上述标准溶液分别用0.22μm的有机滤膜过滤，过滤液分别用高效液相色谱仪（购自上海天普分析仪器有限公司）进样测定，以峰面积（Y）为纵坐标、浓度值（X，μg/mL）为横坐标，制作4-乙基愈创木酚标准溶液的标准曲线。根据标准曲线获得该曲线的回归方程为：y=3.862x+8.416 （R²=0.9996），其中：y为峰面积，x为4-乙基愈创木酚的质量浓度（μg/mL），R²为相关系数。峰面积Y的变化与4-乙基愈创木酚的质量浓度成线性关系，其拟合度达0.9996。

白酒酒液中4-乙基愈创木酚含量的测定：取白酒溶液10mL，用蒸馏水将酒液稀释，制得4-乙基愈创木酚质量体积浓度为0.01-4.0μg/mL的样品溶液，用高效液相色谱仪进样测定，得到样品溶液的峰面积，根据回归方程计算出4-乙基愈创木酚的浓度。

高效液相色谱仪的测定条件为：C₁₈色谱柱（Agilent HC-C18，250mm×4mm，5μm），流动相为水：甲醇：磷酸=540：450：10（v/v/v），流速为lmL/min，进样量为15μL，操作温度为30℃。荧光检测器条件为激发波长270nm、发射波长315nm。

本发明中酱香型白酒样品中的总酸、总酯含量的测定方法按《白酒分析方法国家标准》GB/T10345-2007中规定的测定方法。

原料来源：小麦麸皮、小麦、大麦、高粱市售，4-乙基愈创木酚标准品购自美国Sigma公司，冰乙酸购自天津市科密欧化学试剂有限公司。

实施例1-4所用的液体种子培养基组分如下（g/L）：葡萄糖10.0，蛋白胨10.0，牛肉膏10.0，NaCl 5.0，pH 7.0，蒸馏水定容。

   实施例1 

一种环状芽孢杆菌（Bacillus circulans）HG12菌株在酱香型白酒生产中的应用，步骤如下：

（1）用接种环从菌株试管斜面上挑取1环环状芽孢杆菌HG12菌株接种到10mL的液体种子培养基中，在40℃、160r/min条件下，培养12h，制得活化后的液体种子。

（2）将步骤（1）制得的液体种子按5%（v/v）的接种量接种到200mL的液体培养基中，于50℃、200r/min下，培养16h，制得菌株液体培养物。

（3）将步骤（2）制得的菌株液体培养物以10%（v/w）的接种量接种到酱香型白酒蒸酒后的固体料醅中，按酱香型白酒生产工艺操作，入池发酵30d，制得发酵酒醅，将酒醅蒸馏，制得乙醇浓度为60%（v/v）的酱香型白酒酒液。

所述步骤（2）中的液体培养基：小麦麸皮200g，加水800mL，混合均匀，于100℃下、蒸煮10min，调pH值为6.0，121℃下、灭菌30min。

将制得的酱香型白酒进行风味物质含量检测，与生产工艺相同但未使用HG12菌株所制得的酱香型白酒作对比，检测结果见表1。

表1 酱香型白酒中风味物质的含量

由此可见，使用环状芽孢杆菌HG12菌株的液体培养物可以提高白酒中的重要风味物质总酸、总酯的含量；而且由于HG12菌株含有高阿魏酸脱羧酶活性，因此4-乙基愈创木酚的含量增加幅度更高。

实施例2

一种环状芽孢杆菌（Bacillus circulans）HG12菌株在酱香型白酒生产中的应用，步骤如下：

（1）用接种环从菌株试管斜面上挑取1环环状芽孢杆菌HG12菌株接种到10mL的液体种子培养基中，在35℃、120r/min条件下，培养16h，制得活化后的液体种子。

（2）将步骤（1）制得的液体种子按2%（v/v）的接种量接种到200mL的液体发酵培养基中，于40℃、150r/min下，培养24h，制得菌株液体培养物。

（3）将步骤（2）制得的菌株液体培养物以1%（v/w）的接种量接种到酱香型白酒蒸酒后的固体料醅中，按酱香型白酒生产工艺操作，入池发酵32d，制得发酵酒醅，将酒醅蒸馏，制得乙醇浓度为60%（v/v）的酱香型白酒酒液。

所述步骤（2）中的液体培养基：小麦和大麦各100g，将两者粉碎，粉碎粒度为1.0mm，加水1000mL，混合均匀，于100℃下、蒸煮20min，调pH值为6.5，121℃下、灭菌30min。

将制得的酱香型白酒进行风味物质含量检测，与生产工艺相同但未使用HG12菌株所制得的酱香型白酒作对比，检测结果见表2。

表2 酱香型白酒中风味物质的含量

由此可见，当环状芽孢杆菌HG12菌株的接种量为1%（v/w）时，也能够提高白酒中的风味物质含量。

实施例3

一种环状芽孢杆菌（Bacillus circulans）HG12菌株在酱香型白酒生产中的应用，步骤如下：

（1）同实施例1的步骤（1）。

（2）将步骤（1）制得的液体种子按3%（v/w）的接种量接种到200g的固体培养基中，于50℃下，培养3d，制得菌株固体培养物。

（3）将步骤（2）制得的菌株固体培养物按10%（w/w）的接种量接种于酱香型白酒蒸酒后的固体料醅中，按酱香型白酒生产工艺操作，入池发酵30d，制得发酵酒醅，将酒醅蒸馏，制得乙醇浓度为60%（v/v）的酱香型白酒酒液。

所述步骤（2）中的固体培养基：小麦和高粱各100g，将两者粉碎，粉碎粒度为2.0mm，加水160mL，浸润20h，于100℃下、蒸煮30min，装瓶，于121℃下、灭菌30min。

将制得的酱香型白酒进行风味物质含量检测，与生产工艺相同但未使用HG12菌株所制得的酱香型白酒作对比，检测结果见表3。

表3 酱香型白酒中风味物质的含量

由此可见，使用环状芽孢杆菌HG12菌株的固体培养物同样能够提高酱香型白酒中的风味物质含量。

实施例4

一种环状芽孢杆菌（Bacillus circulans）HG12菌株在酱香型白酒酿造中的应用，步骤如下：

（1）同实施例2的步骤（1）。

（2）将步骤（1）制得的液体种子按1%（v/w）的接种量接种到200g的固体培养基中，于40℃下，培养5d，制得菌株固体培养物。

（3）将步骤（2）制得的菌株固体培养物按1%（w/w）的接种量接种到酱香型白酒蒸酒后的固体料醅中，按酱香型白酒生产工艺操作，入池发酵32d，制得发酵酒醅，将酒醅蒸馏，制得乙醇浓度为60%（v/v）的酱香型白酒酒液。

所述步骤（2）中的固体培养基：小麦麸皮200g，加水100mL，浸润10h，于100℃下、蒸煮20min，装瓶，于121℃下、灭菌30min。

将制得的酱香型白酒进行风味物质含量检测，与生产工艺相同但未使用HG12菌株所制得的酱香型白酒作对比，检测结果见表4。

表4 酱香型白酒中风味物质的含量

实施例5：酱香型白酒的感官评价

将在酱香型白酒生产中应用HG12菌株制得的酱香型白酒酒液稀释至乙醇浓度为52%（v/v），在 20℃的品评环境下进行品评，以生产工艺相同但未使用HG12菌株所制得的酱香型白酒作对比。感官评价标准按《酱香型白酒国家标准》GB/T26760-2011中的感官要求，从色、香、味、风格四个方面进行打分品评：色(10分)、香(25分)、味(50分)、格(15分)。品评人员由国家级评酒委员和省级评酒委员组成，每个酒样由三名品评人员分三次进行品评，感官品评结果见表5。

表5 酱香型白酒的感官品评结果

从感官品评结果可知，将环状芽孢杆菌HG112菌株应用于酱香型白酒生产中，制得的酱香型白酒的感官品质明显提高，其风味更加突出。