用于检测萨宾口服脊髓灰质炎病毒疫苗病毒的基因组中的核苷酸置换的试验

摘要

本发明提供了用于特异性地并且同时检测所有三种血清型的活减毒口服脊髓灰质炎病毒疫苗（萨宾）病毒、疫苗样和疫苗衍生的脊髓灰质炎病毒的基因组中的突变的多重SNP试验方法和引物。重要地，本发明的引物和试验消除了对昂贵、费时和复杂程序，如完整的基因组测序的需求。这种新的试验能够在非常短的时间内测试几种样品。因此，该试验是非常简单、快速且有成本效益的。还提供了包含该新引物的试剂盒。

说明书

发明领域：

本发明广义地属于生物技术领域，并且具体涉及用于检测活减毒 口服脊髓灰质炎病毒疫苗（萨宾）病毒、疫苗样和疫苗衍生的脊髓灰 质炎病毒的基因组中的特定位点的突变的新引物，以及含有上述引物 的试剂盒。

发明背景：

Albert B Sabin博士研发了用于免疫对抗瘫痪型脊髓灰质炎的活 减毒口服脊髓灰质炎病毒疫苗。他通过细致的实验室工作，从产生所 有三种血清型的野生型脊髓灰质炎病毒的疾病中非常小心地分离出突 变的病毒株。将这些减毒（非神经毒性）脊髓灰质炎病毒株用于产生 活减毒口服脊髓灰质炎疫苗，该疫苗在全世界已经使用了50多年。萨 宾还研发了用于在猴子中评价脊髓灰质炎病毒的神经毒性（NVT）的 测试。NVT已经成为用于证明口服脊髓灰质炎病毒疫苗减毒的标准质 量控制测试。最近已经研发了转基因小鼠中的神经毒性测试，作为猴 子NVT的替代方案。

NVT可检验脊髓灰质炎病毒的生物学性状（减毒与毒性）。尽管 NVT可以将毒性的严重程度分级，但其不能确定病毒的基因组性状。

在20世纪80年代，描述了区分野生和萨宾OPV株的抗原和分 子标记。将全基因组测序、克隆和重组DNA技术用于了解萨宾减毒 的及其亲本野生的脊髓灰质炎病毒之间的基因组差异。这些研究导致 与萨宾疫苗脊髓灰质炎病毒的减毒性状相关的特定突变的检测。

以下表1中给出了最有可能的减毒位点：

研发了分子测试，即，通过PCR和限制酶切割（MAPREC）的 突变分析，以定量萨宾疫苗株中单个位点（5’未翻译区内的主要减毒 位点）上的突变及其与NVT结果的关联。WHO已经推荐该测试用于 测试脊髓灰质炎病毒疫苗的质量。最近，已经研发了通过实时PCR的 突变检测。也已经研发了能够检测整个脊髓灰质炎病毒基因组中的突 变的微矩阵芯片。

美国专利5585477和5691134涉及用于检测临床样品中的脊髓灰 质炎病毒的特异性引物，并且由此将其与非脊髓灰质炎肠病毒 （NPEV）区分开来，但没有描述基于其遗传性状（即，特异性地基 于减毒位点）来区分脊髓灰质炎病毒的特异性试验方法。

完整的基因组测序和全基因组微矩阵能够确定所有已知脊髓灰质 炎减毒位点的精确核苷酸（A、T、G或C），但仍然不存在快速且方 便的试验来作为上述在单个试验中同时检测脊髓灰质炎病毒1（六个 位点）、2（三个位点）和3（2个位点）的所有已知减毒位点的突变 的昂贵且复杂技术的替换方案。

发明目的：

本申请的目的在于提供用于同时检测这三种血清型的活减毒口服 脊髓灰质炎疫苗（萨宾）病毒、疫苗样和疫苗衍生的脊髓灰质炎病毒 的基因组中的特定位点的突变的多重PCR试验。

本发明的另一个重要目的是提供用于同时检测这三种血清型的脊 髓灰质炎病毒的基因组中的特定减毒位点的突变的新引物。

本发明的再一个目的是提供用于多重PCR试验中的包含上述引 物的试剂盒，所述试验用于同时检测这三种血清型的活减毒口服脊髓 灰质炎疫苗（萨宾）病毒、疫苗样和疫苗衍生的脊髓灰质炎病毒的基 因组中的特定位点的突变。

发明陈述

根据本发明，提供了用于同时检测这三种血清型的活减毒口服脊 髓灰质炎疫苗（萨宾）病毒、疫苗样和疫苗衍生的脊髓灰质炎病毒的 基因组中的特定位点的突变或SNP的试验和引物。

发明概述：

本发明涉及用于同时检测这三种血清型的活减毒口服脊髓灰质炎 疫苗（萨宾）病毒、疫苗样和疫苗衍生的脊髓灰质炎病毒的基因组中 的特定位点的突变的试验和新引物。本发明还提供了包含用于检测上 述病毒的基因组中的所有特定位点上的突变的引物的试剂盒。

参考表/流程图/实施例等的本发明的简述：

图1&1A描绘了对于萨宾脊髓灰质炎病毒1和对照靶向的特定位 置的核苷酸的突变-SNaP射击试验（shot assay）的结果。

图2&2A描绘了对于萨宾脊髓灰质炎病毒2和对照靶向的特定位 置的核苷酸的突变-SNaP射击试验的结果。

图3&3A描绘了对于萨宾脊髓灰质炎病毒3和对照靶向的特定位 置的核苷酸的突变-SNaP射击试验的结果。

图4描绘了2%琼脂糖凝胶上的第一步多重PCR结果。

表1提供了脊髓灰质炎病毒的基因组中最有可能的减毒位点。

表2提供了用于制备目标特异性区域的DNA扩增子的引物。

参考附图/实施例的本发明的详述

参考表、附图等以及特定的实施方案描述了本发明；该描述不是 想要以限制意义来解释。在参考本发明的描述时，本发明的各种供替 换的实施方案将是本领域技术人员显而易见的。因此预期这些供替换 的实施方案可形成本发明的一部分。

本发明提供了一种试验方法；一套特异性的新引物和包含这些特 异性引物的试剂盒，用于在单个试验中同时检测所有三种亚型的脊髓 灰质炎病毒的所有已知减毒位点的核苷酸，所述三种亚型即脊髓灰质 炎病毒1（六个位点），2（三个位点）和3（2个位点）。

该试验的其他优点在于可以利用相同原理进一步扩展至包括另外 的位点。该试验基于多重逆转录PCR，以将脊髓灰质炎病毒基因组 RNA转变成cDNA和DNA扩增子。然后将PCR产物用于多重SNP 试验。使用Genetic Analyzer解析SNP试验产物，以鉴定脊髓灰质炎 病毒基因组中的减毒位点的核苷酸（图1至3）。该试验适用于大量 样品，并且用于测试疫苗以及现场分离物。该试验方法可以转变成定 量试验。

试验的详细内容：

1.从各种来源获得脊髓灰质炎病毒样品（已知血清型，例如，脊 髓灰质炎病毒1、2或3）。（从粪便样品分离1、2和3型脊髓灰质 炎病毒，从NIBSc.PK获得口服脊髓灰质炎病毒疫苗（萨宾）株）。

2.使用反义PCR引物合成cDNA，并且在单个多重逆转录和PCR 反应中产生DNA扩增子。

3.纯化PCR产物（DNA扩增子）。

4.使用本发明的“新引物”进行多重单核苷酸多态性检测试验[目 前用于1型脊髓灰质炎病毒的试验包括6个引物对，2型包括3个引 物对，3型包括2个引物对多重体]。

5.通过Genetic Analyzer上的电泳解析SNP，检索数据，并且使 用Gene Mapper软件分析这些数据。

本发明的新颖性和创造性在新的引物设计、用于同时检测所有减 毒位点的突变的多重试验的便利性和特异性以及包含这些特异性引物 的试剂盒中是固有的。为了更好地理解本发明，如下提供进一步的详 细内容：

表1：脊髓灰质炎病毒的基因组中最有可能的减毒位点

I.引物的设计：用于检测特异性突变的新PCR引物

a.引物比待研究的减毒位点短一个核苷酸

b.已经设计了可变长度的5’端尾，并且结合在引物中。

c.尾片段不与引物靶向的基因组序列反应（互补）。

d.设计递增长度的引物（碱基对），使得在Genetic Analyzer 中解析时，以递升次序首先表示第一个减毒位点，而最后一个位点在 最后。

2，试验方法

a.该试验能够鉴定靶向的所有核苷酸位置的等位基因，即，可以 检测脊髓灰质炎病毒1、2和3中的所有减毒位点的核苷酸。

b.如果应当包括新位点，可以在一个多重试验中结合其他引物。

c.对于三种脊髓灰质炎病毒血清型，设计不同的引物组。

d.一个试验中可以研究所有减毒位点。

表2：用于制备目标特异性区域的DNA扩增子的引物

1-型

1.PV128-5′CATGGGACGCTAGTTGTGAA3′

2.PVI-IA-5'ATGAAACCTGAGCACCCAIT3'

3.Y7-5'GGGTTTGTGTCAGCCTGTAATGA3'

4.81-5'TGGGACGACTACACATGGCA3'

5DG53-5'TGGCTGCITATGGTGACAAT3'

6.DC21-5'TCA'GGTAATITCCACCACCA3'

7.PVI-J38-5'AAGTCATCGGGATGCATGIT3'

8，PV112A-5'CTGGCCAGCATAGTGGTCTA3'

2-型

1.PV23218-5'TGAGTCTGGACATTCCTCACC3'

2.PV2-575A.5′GTCACCATAAGCAGCCATGA3'

3.PV2-38308-5'CAACTGAGACGCAAACTGGA3'

4.PV2-3018A-5'AGAGGACGTCAGCCACGTAD'

3-型

I.PV3-285'ACGGGACGCTAGITGTGAAC3'

2.PV3-2A5'GCTCCCATTGTGACACTGAA3'

3.PV3-585'GAGCTCGCCGAGATAGACAC3'

4.PV3-5A5'AGATGAITGGAGGCCAAGAD'

以下提供了用于SNP试验的引物的详细内容：

用于1-型（萨宾病毒）的SNP引物

引物名称：PV I IF-1，核苷酸位置-480

序列ID1：

5'GACTGACTAATGCGGCTAATCCCAACCTCGG3′

Tm-67.6，GC-56.5%，长度-31nt

引物名称：PVI_2F-I，核苷酸位置-935

序列ID2：

5'GACTGACTGCCCATCAAGGATGTCCTGATAAAAACA3' Tm-66.4，GC-42.9%，长度-36nt

引物名称：PVI_3F-1，核苷酸位置-2438

序列ID3：

5'GACTGACTGACTGACTTGTAATGACTTCAGCGTGCGCTTG3' Tm-65.2，GC-50%，长度-40nt

引物名称：PVI_4F-1，核苷酸位置-2795

序列ID4：

5'GACTGACTGACTCAGCTTCCACCAAGAATAAGGATAAGCTATTT3' Tm-64.4，GC-37.5%，长度-44nt

引物名称：PVI_5F-I，核苷酸位置-2879

序列ID5：

5'GACTGACTGACTGACTGACTTTCACCTATTCTAGATTTGATATGGAA3' Tm-55.7，GC-29.6%，长度-47nt

引物名称：PVI_6F1，核苷酸位置-6203

序列ID6：

5'GACTGACTGACTGACTGACTACGTGGGTAACAAAATTACTGAAGTGGATGAG3 Tm-66.3，GC-40.6%，长度-52nt

用于（2-型脊髓灰质炎）的SNP引物

引物名称：PV2_2A，核苷酸位置-481

序列ID7：

5'GACTGACTCGGCTAATCCTAACCACGGA3'

Tm-58.7，GC-55%，长度-28nt

引物名称：PV2_28，核苷酸位置-2908

序列ID8：

5'GACTGACTGACTTTTTGTGGTCACCTCAAACTAC3'

Tm-53.2，GC-40.9%，长度-34nt

引物名称：PV2_2C，核苷酸位置-2909

序列ID9：

5'GACTGACTGACTGACTTTTTGTGGTCACCTCAAACTACA3' Tm-56，GC-39%，长度-39nt

用于（3-型脊髓灰质炎）的SNP引物

引物名称：PV3_3A，核苷酸位置-472

序列ID10：

5'GACTGACTCCCCTGAATGCGGCTAAT3'

Tm-57.2，GC-55.6%，长度-26nt

引物名称：PV3_38，核苷酸位置-2034

序列ID11：

5'GACTGACTGACTGCTTGTCACTATCCCCAGCAT3'

Tm-57.8，GC-52.4%，长度-33nt

根据其中一个实施方案，本发明中公开的具体试验方法能够在一 个试验中鉴定出靶向的所有核苷酸位置的等位基因并且研究所有减毒 位点，并且因此可用于鉴定脊髓灰质炎病毒1、2和3基因组中的所有 减毒位点的核苷酸。如果需要包括新的位点，可以将附加引物并入一 个多重试验中。该试验方法利用了为这三种脊髓灰质炎病毒血清型设 计的不同引物组。该试验方法适用于大量样品，并且可以用于检测疫 苗以及现场分离物。此外，该试验方法可以转变成定量试验，并且可 扩展至包括另外的突变位点。

本发明的另一个实施方案涉及用于检测所有三种血清型的活减毒 口服脊髓灰质炎病毒疫苗（萨宾）病毒、疫苗样和疫苗衍生的脊髓灰 质炎病毒的基因组中的突变特异性位点的PCR引物。该引物的特征在 于它们在其长度上具有变化，并且是比待研究的减毒位点短一个核苷 酸。该引物已经设计成结合可变长度的5’端尾，该尾片段与引物所靶 向的基因组序列是非互补的。

设计了递增长度（碱基对）的引物，使得在Genetic Analyzer中 解析时，以递升次序首先表示第一个减毒位点，而最后一个位点在最 后。

本发明的再另一个方面涉及试剂盒，其含有上述引物，用于检测 所有三种血清型的活减毒口服脊髓灰质炎病毒疫苗（萨宾）病毒、疫 苗样和疫苗衍生的脊髓灰质炎病毒的基因组中的特定位点的突变（核 苷酸置换），包括上述引物。该试剂盒进一步包括三磷酸脱氧核苷、 聚合酶、二价阳离子和/或缓冲液。

实施例：

以下实施例是用于说明本发明的，而不是旨在以任何方式来限制 本发明的范围。

实施例1：

从三种血清型的脊髓灰质炎病毒制备DNA扩增子

单独地获取每个血清型（1、2或3型）的脊髓灰质炎病毒。在单 个多重逆转录和PCR反应（Roche）中，使用反义PCR引物和DNA 扩增子产生，从冷冻的感染培养物合成脊髓灰质炎病毒样品，cDNA。 通过PCR纯化试剂盒（Quagcn）纯化PCR产物（DNA扩增子）。

RT-PCR－对于RT-PCR分析，直接获取冷冻的感染培养物 （1fll）和50fll总体积中的67mM Tris/HCl（pH8.8）、17mM硫酸铵、 6mM EDTA、2mM MgCh、200Mm每种dNTP、1mM二硫苏糖醇、 1mM每种引物、10U胎盘RNA酶抑制剂（Roche）、3U禽类成髓细 胞瘤病毒（AMV）逆转录酶（Roche）和5U Taq DNA聚合酶（Roche  Applied Science）。将反应在50℃下孵育30分钟，接着在94℃下孵 育3分钟。在9700-型热循环仪（Applied Biosystems）中进行了35 个热循环，94℃，30s，42℃，30s，72℃，30s。热循环后接着在72℃ 孵育5分钟。通过在10%聚丙烯酰胺TBE凝胶中电泳来分析反应产 物，并用0.5flg溴化乙啶mrl染色。通过QIA快速PCR纯化试剂盒 （Qiagen）来纯化DNA。

实施例2：

用于鉴定突变的单个核苷酸多态性试验（SNP试验）

在含有SNaPshot多重即用反应混合物（5lll）、引物混合物（3lll） （终浓度，0.15-0.6Ilmolll）和模板（2Ill）的10III终体积中进行了 10个SNP反应，所述模板由上述用QIAquick PCR纯化试剂盒 （Qiagcn）纯化的多重PCR产物组成。将从病毒RNA扩增的多重 PCR产物集合，并且在SNaPshot反应之前，在相同柱子上纯化。循 环程序包括25个循环，96℃10s，50℃5s和60℃30s。通过在37℃下 用1U虾碱性磷酸酶孵育IS-分钟，随后在75℃下孵育IS-分钟，使酶 灭活来纯化延伸产物。将纯化的产物（0.5Ill）与9III甲酰胺和0.5III GeneScan-120LIZ大小标准品（Applied Biosystems）混合，并通过 毛细管电泳（ABI PRISM3130Genetic Analyzer；Applied  Biosystems）分离。用GeneMapper3.0软件（Applied Biosystems） 分析结果。

以这样的方式设计SNP引物，使得每个引物比待研究的减毒位点 短一个核苷酸，并且从Sigma合成。设计递增长度（碱基对）的引物， 使得首先表示第一个减毒位点，而最后一个位点在最后。通过 SnaPshot试剂盒（Applied Biosystem）进行了多重单核苷酸多态性检 测试验。通过Genetic Analyzer3130（Applied Biosystem）上的毛细 管电泳来解析SNP，并重新获得数据，并通过Gene Mapper软件分析。

本发明的优点

1.可以在一个试验中研究所有减毒位点，并且检测脊髓灰质炎病 毒1、2和3基因组中的所有减毒位点的核苷酸。

2.该试验方法能够检测所有研究位点的等位基因（混合的碱基）。

3.该试验方法能够鉴定所有靶向的核苷酸位置的等位基因。

4.该试验包括多重反应。

5.该试验能够操作大量样品。

6.该试验可用于疫苗检测以及现场分离物检测。

7.该试验可以转变成定量试验。

8.该试验可扩展至包括另外的位点。