人免疫缺陷病毒基因重组脊髓灰质炎病毒疫苗的实验研究

摘要

艾滋病是由人免疫缺陷病毒(HIV)引起的一种传染病，以破坏人体的免疫功能为致病特征，以性接触、血液传播为主，目前在全球的蔓延呈不断扩大的趋势。虽然药物治疗对一部分患者有效，但价格十分昂贵，且易复发、产生耐药。而绝大部分患者在经济落后的发展中国家，因此研制价格便宜、接种方便的有效HIV疫苗是当务之急。 目前研制的HIV疫苗种类很多，既有传统的病毒病毒失活疫苗、减毒活疫苗，也有新型的核酸疫苗、合成肽链疫苗、病毒载体疫苗等，但在临床试验效果均不理想。原因可能与HIV的高度变异、致病机理尚不清楚、抗体滴度不高多种因素有关。鉴于艾滋病主要以粘膜途径传播为主，研制一种能刺激机体产生较强粘膜免疫能力的疫苗可能对预防HIV的传播起重要作用。 脊髓灰质炎病毒(PV)是一类单股正链RNA病毒，具有自主的复制能力。减毒的Sabin株疫苗在防止脊髓灰质炎多年的防疫实践中证实安全、有效，以口服途径为主，有较好的粘膜免疫诱导功能。为此，本研究拟以减毒的脊灰病毒Sabin I为载体，以HIV中国主要流行病毒株的基因为抗原，研制一种有实际推广价值的HIV疫苗。 首先以HIV-1CN54株gagpol基因的cDNA为模板，通过PCR反应获得了gagprotease基因片段，并于其两端带上合适的酶切位点。将携带脊灰病毒cDNA的真核表达质粒载体通过酶切反应，将PV位于两个单一酶切位点的结构基因部分片段予以切除，而后由酶连接反应将HIV-l的gagprotease抗原基因片段与PV的cDNA酶切后的粘性末端进行连接，并保持了正确的阅读框架，经双酶切反应证实被正确地定向插入了载体上。对培养的Hela细胞，将重组的表达载体与由真核表达载体反式提供的PV结构基因实行共转染，实现缺陷性脊灰病毒的细胞内重新组装，并在电子显微镜下观察，发现细胞内有重组病毒产生。经显微镜下对转染的细胞连续观察48小时，未发现有明显的细胞病变效应。由于此重组缺陷病毒不产生子代病毒，没有传染性，因而有较好的生物安全性。 对培养的人二倍体细胞进行扩大培养，大规模生产重组病毒疫苗。采用蔗糖梯度离心法分离、纯化病毒颗粒，后以RT-PCR、WesternBlot对其进行鉴定，证实该病毒基因组带有抗原基因，壳蛋白呈典型的PV结构。使其对Hela细胞进行感染性、表达检测，发现能在细胞内正确表达抗原基因。 本实验另将HIV-lgagprotease基因插入了真核表达载体的多克隆位点上，制备了一个DNA疫苗，并采用脂质体技术转染细胞，以免疫荧光技术证实它能在细胞内有HIV抗原蛋白产生。 在随机分配的脊灰受体转基因小鼠身上，以研制的两种疫苗分别隔月进行了三次经鼻腔粘膜免疫接种，以ELISA法检测IgG、IgA体液免疫反应，以乳酸脱氢酶释放试验检测淋巴细胞免疫效应，结果显示重组的脊灰病毒疫苗整体诱导的免疫效果均DNA疫苗要好，部分结果相比差异有统计学意义，且差异显著；部分差异不太明显。此结果可能与其感染性较强、能在细胞能多次复制表达抗原能力较高相关。未发现疫苗有明显的毒性作用。 结论：HIV抗原基因重组的缺陷性脊髓灰质炎疫苗有较好的免疫原性，对预防艾滋病的传播应有较好的应用前景。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩写注释索引

声明

第一章HIV-1gagprotease基因重组缺陷性脊髓灰质炎病毒疫苗的研制

1.1前言

1.1.1 HIV及爱滋病简介

1.1.2疫苗的选择

1.1.3 HIV抗原基因的选择

1.2实验技术路线

1.3实验材料

1.3.1质粒与菌株

1.3.2细胞

1.3.3实验试剂

1.3.4工具酶、抗体

1.3.5实验仪器

1.3.6溶液的配备

1.4 HIV-1gagprotease基因重组缺陷性脊髓灰质炎病毒疫苗的初步构建和检测

1.4.1引言

1.4.2实验方法

1.4.3实验结果

1.5 HIV-1gagprotease基因重组缺陷性脊髓灰质炎病毒疫苗的制备、纯化和鉴定

1.5.1引言

1.5.2实验方法

1.5.3实验结果

1.6讨论

1.6.1 RNA复制子疫苗的特点

1.6.2脊髓灰质炎病毒的分子生物学性状

1.6.3粘膜免疫反应

1.6.4脊髓灰质炎病毒的生物毒性

1.6.5减毒的PV Sabin株

1.6.6 HIV-1gagprotease基因表达产物的免疫原性

1.6.7重组PV在细胞内的组装

1.6.8存在的问题

第二章HⅣlgagprotease基因DNA疫苗的构建和制备

2.1引言

2.2实验技术路线

2.3实验材料

2.4实验方法

2.5实验结果

2.6讨论

第三章HIV-1gagprotease基因重组脊髓灰质炎病毒疫苗、核酸疫苗免疫效果的研究

3.1引言

3.2实验材料

3.3实验方法

3.4实验结果

3.4.1靶细胞系的筛选

3.4.2体液免疫反应检测

3.4.3粘膜免疫反应检测

3.4.4淋巴细胞免疫反应的检测

3.4.5疫苗的毒性反应监测

3.5讨论

参考文献

综述一艾滋病疫苗研究进展

综述二基于脊髓灰质炎病毒的表达载体研究进展

附录1 HIV-1gagprotease基因重组的脊髓灰质炎病毒基因组序列

攻读博士学位期间主要的研究成果

致谢